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Immunology and Infection

माउस मैक्रोफेज द्वारा Phagocytosis की समय-चूक 3d इमेजिंग

Published: October 19, 2018 doi: 10.3791/57566
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institut für Molekulare Zellbiologie

Summary

यहां हम माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज द्वारा छवि एकल phagocytic घटनाओं के लिए कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग तरीकों का वर्णन । अंय phagocytic कक्षों के लिए प्रोटोकॉल विस्तारित किया जा सकता है ।

Abstract

Phagocytosis मेजबान रक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में ऊतक विकास और रखरखाव में, और तेजी से शामिल है, रिसेप्टर मध्यस्थता actin cytoskeleton के पुनर्व्यवस्थाओं पर कब्जा करने के लिए, ढंक और बड़े कणों निगलना. हालांकि phagocytic रिसेप्टर्स, बहाव संकेत रास्ते, और Rho GTPases के रूप में प्रभाव, की पहचान की गई है, विशिष्ट रिसेप्टर के गतिशील cytoskeletal remodeling-मध्यस्थता phagocytic घटनाओं अस्पष्ट रहते हैं. चार दशक पहले, phagocytosis के दो अलग तंत्र, Fcγ रिसेप्टर (FcγR) द्वारा उदाहरण-और पूरक रिसेप्टर (सीआर)-मध्यस्थता phagocytosis, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर की पहचान की गई. immunoglobulin जी (आईजीजी) के बंधन-opsonized कण पतली झिल्ली एक्सटेंशन है, जो शुरू में कण के आसपास एक तथाकथित phagocytic कप फार्म के पहले यह पूरी तरह से संलग्न है और सेल में मुकर जाता है की दखलंदाजी चलाता है । इसके विपरीत, पूरक opsonized कणों रिसेप्टर्स पूरक करने के लिए बाध्यकारी निम्नलिखित phagocyte में सिंक करने के लिए दिखाई देते हैं. phagocytosis, phagocytic कप के गठन और डूब में इन दो मोड, साहित्य में अच्छी तरह से स्थापित हो गए हैं । हालांकि, दो मोड के बीच भेद रिपोर्टों है कि पूरक रिसेप्टर-मध्यस्थता phagocytosis विभिन्न झिल्ली की दखलंदाजी पैदा कर सकते हैं द्वारा धुंधला हो गया है. उच्च संकल्प इमेजिंग तकनीक की उपलब्धता के साथ, phagocytosis परख कि कैसे विशिष्ट phagocytic रिसेप्टर्स के व्यक्तिगत कणों के तेज मध्यस्थता की वास्तविक समय 3 डी (तीन आयामी) दृश्य की अनुमति की आवश्यकता है । इस तरह के अंत बिंदु परख के रूप में phagocytosis के अध्ययन के लिए अधिक सामांयतः इस्तेमाल किया दृष्टिकोण, को समझने की क्या कणों और फ़ैगोसाइट के इंटरफेस पर हो रहा है अवसर याद आती है । यहां हम phagocytic परख का वर्णन, समय का उपयोग चूक डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी कताई, कि एकल phagocytic घटनाओं के 3 डी इमेजिंग की अनुमति । इसके अलावा, हम स्पष्ट रूप से छवि Fcγ रिसेप्टर के लिए परख का वर्णन-या रिसेप्टर की मध्यस्थता phagocytosis पूरक.

Introduction

तारामछली लार्वा में phagocytic mesenchyme कोशिकाओं के Metchnikoff अवलोकन से पहले बीस साल, १८८२ में, और1phagocytosis के अपने सिद्धांत के बाद विकास, अर्नेस्ट Haeckel, १८६२ में वर्णित, रक्त द्वारा अघुलनशील डाई कणों की समाई Thetis fimbris (टेथ्स fimbria), शिकारी सागर स्लग (अर्नेस्ट Haeckel की एक प्रजाति की कोशिकाओं । मर Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag वॉन Georg Reimer, बर्लिन, १८६२). वह स्पष्ट रूप से झिल्ली का पुलिंदा है, जो बाद में कोशिका द्रव्य में ले जाया गया था और कोशिका नाभिक के आसपास जमा ढंक । अधिक से अधिक १०० साल बाद, कापलान द्वारा एक अग्रणी अध्ययन का सुझाव दिया है कि वहां थे phagocytosis2में से कम दो आकृति विज्ञान अलग तंत्र । कापलान इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के माध्यम से पता चला है कि माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज एक आईजीजी-opsonized भेड़ लाल रक्त पतली झिल्ली एक्सटेंशन जो ऊपर तक पहुंच और कसकर कण लिफाफा, शुरू में एक कप को जंम देने की तरह का उपयोग कर घूस दिया संरचना. Phagocytic कप गठन आवश्यक actin बहुलकीकरण चूंकि यह कोशिका-पारगंय फफूंद विष cytochalasin बी द्वारा निष्प्रभाव था, actin गतिकी3को ब्लॉक करने के लिए जाना जाता है । इसके विपरीत, पूरक के साथ भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं opsonized झिल्ली एक्सटेंशन की पीढ़ी के बिना मैक्रोफेज में सीधे सिंक करने के लिए दिखाई दिया, हालांकि, कुछ छवियों में, झिल्ली व्याकुलता डूब कणों के तत्काल vacinity में देखा जा सकता है । phagocytic कप के गठन के विपरीत, रिसेप्टर पूरक मध्यस्थता में डूब cytochalasin बी उपचार2के लिए insenstive था. कापलान द्वारा वर्णित प्रयोगों में, पूरक opsonization मशीन द्वारा किया गया था immunoglobulin एम (आईजीएम) के लेबल वाली भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं से सीरम के साथ पूरक c5-की कमी चूहों, जो hemolysis के पूरक द्वारा c5-निर्भर टर्मिनल जटिल पूरक ।

phagocytosis के दो तरीके, phagocytic कप के गठन और डूब में, कापलान द्वारा की पहचान की राय क्षेत्र में स्थापित हो गए है4,5,6,7,8,9 . हालांकि, अल्ट्रा उच्च संकल्प छवियों कापलान2द्वारा मूल अध्ययन में इस्तेमाल किया, साथ ही Munthe द्वारा एक समान अध्ययन-Kaas एट अल । 10, केवल phagocytic घटनाओं के स्नैपशॉट प्रदान करते हैं । हाल ही में एक समीक्षा में, Rougerie एट अल । 11 बल दिया कि FcγR-और सीआर-मध्यस्थता phagocytosis के बीच मतभेद रूपात्मक स्पष्ट किया जाना है, और, इसके अलावा, झिल्ली व्याकुलता पूरक रिसेप्टर-मध्यस्थता कण2के दौरान मनाया गया है. जीना-एकल phagocytic कण पर कब्जा से फैले internalization की घटनाओं के सेल इमेजिंग, आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडलों के साथ संयुक्त, बहुत कैसे फ़ैगोसाइट कब्जा और निगल कणों की हमारी समझ में सुधार कर सकता है । एक दृष्टिकोण के लिए तेजी से परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) जो अल्ट्रा उच्च संकल्प (10-20 एनएम) जीवित कोशिकाओं के स्थलाकृतिक इमेजिंग की अनुमति देता है का उपयोग हो सकता है । हाल ही में, एक फास्ट AFM प्रणाली12 विकसित किया गया है, जो इमेजिंग सेल कम शोर के साथ तेजी से सतहों के लिए उपयुक्त है । इस तकनीक का लाभ यह है कि उच्च संकल्प, स्थलाकृतिक और यांत्रिक मानकों के रहने वाले कोशिकाओं को कम अंतराल पर मापा जा सकता है (सेकंड), स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के विपरीत, जो आवश्यक निर्धारण और महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने की कक्षों. हालांकि phototoxicity और ब्लीचिंग कारकों रिकॉर्डिंग के दौरान सीमित कर रहे हैं एक और दृष्टिकोण, समय चूक 3 डी फोकल माइक्रोस्कोपी है, जो व्यापक रूप से उपलब्ध है. इस दृष्टिकोण अत्यधिक बहुमुखी है और उच्च स्थानिक संकल्प के साथ ऑप्टिकल अनुभाग की अनुमति देता है और फ्लोरोसेंट जांच की एक चौंका देने वाला रेंज के साथ लेबलिंग में असाधारण लचीलापन सक्षम बनाता है, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन सहित । यहां हम समय का उपयोग कर phagocytosis परख का वर्णन-चूक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी कि अनुमति उच्च विशिष्ट रिसेप्टर के spatiotemporal संकल्प-phagocytic घटनाओं मध्यस्थता ।

Protocol

प्रोटोकॉल हमारे स्थानीय मानव अनुसंधान आचार समिति के दिशा निर्देशों का पालन करें, साथ ही पशु देखभाल दिशानिर्देश ।

1. निवासी माउस का अलगाव पेरिटोनियल मैक्रोफेज

  1. कुर्बानी का माउस (3-4 महीने की उम्र (या तो सेक्स); उदा. C57BL/6 तनाव) अस्थिर संवेदनाहारी isoflurane की अधिक मात्रा का उपयोग (> हवा में 5%) या कार्बन डाइऑक्साइड13, ग्रीवा विस्थापन के बाद । संज्ञाहरण के प्रेरण आसानी लेकन पलटा14, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पंजा वापसी पलटा के नुकसान के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है ।
  2. पानी में ८०% इथेनॉल के साथ माउस के पेट सफाई के बाद, एक midline त्वचा चीरा बनाने के लिए और अंतर्निहित पेट की दीवार बेनकाब ।
  3. peritonium में एक 24 जी प्लास्टिक कैथेटर प्लेस और 2x ४.५ मिलीलीटर बर्फ के साथ गुहा लेवेज-ठंड है हांक बफर नमक समाधान (HBSS), Ca 2 के बिना+ और2 मिलीग्राम +एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज के माध्यम से । जबकि इंजेक्शन के बारे में ०.५ मिलीलीटर अवशिष्ट HBSS (5-4.5 मिलीलीटर (इंजेक्शन) = ०.५ एमएल) में सिरिंज मामले में ऊतक कैथेटर की नोक में चूसा है और निष्कासित कर दिया जा करने की जरूरत है. एक 14 मिलीलीटर में aspirated निलंबन दौर-नीचे ट्यूब और कमरे के तापमान पर ६.५ मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक स्थानांतरण ।
    नोट: प्लास्टिक कैथेटर की नोक कुंद है, जो, एक सुई की तुलना में, उदर सामग्री के लिए चोट को कम करता है. आमतौर पर, कोमल पेट की मालिश के बाद, 8 मिलीलीटर पेरिटोनियल सेल निलंबन पेरिटोनियल गुहा से प्राप्त किया जा सकता है ।
  4. supernatant को त्यागें और पेरिटोनियल कोशिकाओं को 1 मिलीलीटर बिकारबोनिट-free RPMI १६४० मध्यम में 20 मिमी Hepes, 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं, जैसे पेनिसिलिन (१०० इकाइयों/एमएल) और streptomycin (१०० µ g/एमएल), द्वारा तैयार शामिल कमजोर 100x पेनिसिलिन/streptomycin 1:100. यह आमतौर पर चारों ओर की एकाग्रता देता है 6 x 106 कोशिकाओं/
    नोट: के बारे में 30% पृथक पेरिटोनियल कोशिकाओं मैक्रोफेज हैं, जबकि अन्य (छोटे) कोशिकाओं लिम्फोसाइटों हैं, मुख्य रूप से बी कोशिकाओं.

2. चैनल की स्लाइड्स में पेरिटोनियल कोशिकाओं का सीडिंग

  1. pipetting के बाद सेल सस्पेंशन को ऊपर और नीचे की झुरमुट को कम करने के लिए, पिपेट १०० µ l (वॉल्यूम, १०० µ l) एक fibronectin-लेपित चैनल स्लाइड (एक १०० µ l चैनल आयाम (लंबाई x चौड़ाई x ऊँचाई): ५० मिमी x 5 मिमी ०.४ मिमी) के लिए एक से भरे चैनल में
    1. एक चैनल स्लाइड के दो जलाशयों में से एक के लिए 1 मिलीलीटर सीरम पूरक RPMI १६४० (Hepes) मध्यम जोड़कर चैंबर भरें, स्लाइड झुका, और फिर बहाव जलाशय (चित्रा 1) से मध्यम aspirating ।
      1. दो जलाशयों में से एक के लिए 1-2 मिलीलीटर माध्यम जोड़ने के द्वारा चैनल में अवांछित हवा के बुलबुले, या लंबी स्ट्रिप्स को निकालें, कसकर एक जलाशय टोपी लगाने और फिर टोपी पर लयबद्ध अंगूठे के दबाव के माध्यम से हवा पंप और, जहां आवश्यक हो, स्लाइड झुका । हवा को खदेड़ने के बाद, छाया हुआ जलाशय के साथ स्लाइड झुकाव (और माध्यम से युक्त) नीचे हवा से बचने के लिए टोपी हटाने से पहले चैनल में चूसा जा रहा है ।
  2. चैनल स्लाइड, कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त, 2 एच के लिए एक नम कक्ष में ३७ ° c के अभाव में 2 घंटे ( co2 की आवश्यकता नहीं है के बाद से HCO3-/CO2 बफर सिस्टम Hepes द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है) । चैनल स्लाइड आसानी से एक रैक है, जो आठ स्लाइड रखती है पर रखा जा सकता है । 10 या अधिक संभव है, हालांकि आमतौर पर, 6-8 स्लाइड एक माउस से तैयार कर रहे हैं ।
  3. रैक निकालें और RPMI १६४० माध्यम बिकारबोनिट युक्त के लिए प्रत्येक स्लाइड में RPMI १६४० (Hepes) माध्यम विनिमय, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक, साथ ही पेनिसिलिन/streptomycin.
    1. स्लाइड को टिल्ट करें और महाप्राण मीडियम पहले निचले जलाशय से और फिर ऊपरी जलाशय से. अगले, जलाशयों में से एक के लिए नए माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें, बहाव जलाशय से स्लाइड और महाप्राण माध्यम झुकाव, के बाद यह चैनल के माध्यम से प्रवाहित है ।
    2. इस वॉश (मीडियम एक्सचेंज) स्टेप के बाद जलाशयों में से किसी एक को 1 एमएल मीडियम जोड़कर चैनल स्लाइड को भरें ।
      नोट: चैनल स्लाइड का उपयोग करके धुलाई चरण बहुत सरल और समाधान एक्सचेंज के मामले में प्रभावी और गैर अनुयाई कोशिकाओं को हटाने है । ध्यान दें कि RPMI १६४० (बिकारबोनिट) मध्यम सामांय रूप से पूर्व 5% सह2 के साथ रात भर के लिए थर्मल और पीएच संतुलन सुनिश्चित करने के लिए मशीन है ।
  4. 5% CO2के साथ एक humidified मशीन में ३७ ° c पर रात भर कोशिकाओं को मशीन । अगले दिन पर प्रयोग करते हैं ।

3. मानव लाल रक्त कोशिकाओं का अलगाव

  1. 2 दिन (प्रयोगों के दूसरे दिन; अलग पेरिटोनियल मैक्रोफेज की रात भर की गर्मी के बाद), एक स्वस्थ दाता से 1-2 मिलीलीटर परिधीय शिरापरक रक्त इकट्ठा, एक heparinized ट्यूब में । एक गोल नीचे २.० मिलीलीटर में 1 मिलीलीटर स्थानांतरण () microcentrifuge ट्यूब, 18 डिग्री सेल्सियस (अनुभवजंय सेटिंग) में 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक, और supernatant (प्लाज्मा और buffy कोट) को हटा दें ।
  2. धीरे महाप्राण १०० तलछटी लाल रक्त कोशिकाओं के µ एल और मिश्रण इस खंड 1:1 के साथ संशोधित RPMI १६४० (Hepes) मध्यम (नीचे वर्णित) एक दौर में नीचे २.० मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब । "1:1" ट्यूब लेबल ।
    नोट: RPMI १६४० (Hepes) मध्यम दिन 2 पर इस्तेमाल किया (परख के लिए) अलग कोशिकाओं के बाद होता है, 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के अलावा, पेनिसिलिन (१०० इकाइयों/एमएल), streptomycin (१०० µ g/एमएल), और 1 मिमी N-(2-mercaptopropionyl) glycine (कम करने के लिए phototoxicity) । इसके बाद, इस माध्यम को "संशोधित" RPMI १६४० (Hepes) माध्यम के रूप में संदर्भित किया जाता है ।
  3. पिपेट 4 µ एल के 1:1 पतला लाल रक्त कोशिका निलंबन में 2 मिलीलीटर संशोधित RPMI १६४० (Hepes) मध्यम, पूर्व एक २.० मिलीलीटर pipetted ट्यूब में microcentrifuge (इस कदम को दोहराने, यानी 2 ट्यूबों तैयार) । प्रत्येक ट्यूब "4:2000" लेबल । प्लेस "1:1" और "4:2000" बर्फ पर ट्यूबों ।

4. मैक्रोफेज प्लाज्मा झिल्ली के लेबल

  1. वरीयता प्राप्त चैनल स्लाइड से सह2 मशीन निकालें और संशोधित RPMI १६४० (Hepes) माध्यम के लिए प्रत्येक स्लाइड में RPMI १६४० (बिकारबोनिट) माध्यम का आदान-प्रदान करें । अगले,2सह के अभाव में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक नम कक्ष में कोशिकाओं जगह है ।
    नोट: रात भर की गर्मी और धोने के बाद, लिम्फोसाइटों के अधिकांश चैनल से हटा रहे हैं । शेष अनुयाई कोशिकाओं के बहुमत मैक्रोफेज, जो या तो आकृति विज्ञान या विरोधी F4/80 एंटीबॉडी का उपयोग दाग इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा पहचाना जा सकता है । माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज के लगभग ९५% F4/
  2. पतला फ्लोरोसेंट हरी लेबल विरोधी माउस F4/एंटीबॉडी (4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित) 1:40 संशोधित RPMI १६४० (Hepes) माध्यम में । एक स्लाइड ले लो, यह झुकाव, और पिपेट (ड्रॉप द्वारा ड्रॉप) १०० µ एल एंटीबॉडी मिश्रण के १०० µ एल स्लाइड के चैनल खोलने में ( चित्रा 1देखें) । महाप्राण माध्यम है कि बहाव जलाशय में बहती है । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को मशीन (2सीओ के बिना humidified पर्यावरण,) । मशीन अवधि के दौरान, मानव लाल रक्त कोशिकाओं लेबल (खंड 5 देखें) ।
    नोट: के रूप में ऊपर alluded,2 की आवश्यकता नहीं है HCO3-/CO2 बफर सिस्टम के बाद से Hepes द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है ।
  3. के बाद 20 मिनट की मशीन समय (जो के दौरान मानव लाल रक्त कोशिकाओं दाग और opsonized हैं), एक जलाशयों के लिए 1 मिलीलीटर संशोधित RPMI १६४० (Hepes) माध्यम जोड़कर स्लाइड धोने और माध्यम aspirating के बाद यह चैनल के माध्यम से प्रवाहित है, द्वारा सुविधा स्लाइड झुकाना. अल्पावधि भंडारण के लिए 1 मिलीलीटर मध्यम जोड़ें या एक प्रयोग करने के लिए आगे बढ़ना (यानी, कणों में pipetting (opsonized लाल रक्त कोशिकाओं) और इमेजिंग phagocytosis समय चूक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा) ।

5. मानव लाल रक्त कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली लेबलिंग

  1. हरी फ्लोरोसेंट लेबल विरोधी F4/80 एंटीबॉडी के साथ मैक्रोफेज की एक स्लाइड की मशीन के बाद तुरंत मानव लाल रक्त कोशिकाओं के लेबल शुरू (४.२ धारा के बाद) । कोमल मिश्रण के बाद, "4:2000" ट्यूबों में से एक से ४०० µ एल ले (३.३ अनुभाग देखें) और यह एक (गोल नीचे) २.० मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में बांटना । निलंबन के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस के आसपास गर्म करने के लिए समय की अनुमति दें (नीचे पैराग्राफ को देखें) । जोड़ें ०.४ µ एल नारंगी/लाल फ्लोरोसेंट प्लाज्मा झिल्ली दाग (aliquots पर संग्रहित-20 डिग्री सेल्सियस), मिश्रण और 5 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    नोट: एक गर्म एल्यूमीनियम ब्लॉक, लामिना प्रवाह हूड के अंदर रखा, गर्मी नुकसान को कम करने के लिए उपयोगी है, जबकि स्लाइड तैयार कर रहा है । ट्यूबों हीटिंग ब्लॉक के बोर कुओं में रखा जा सकता है और एक अलग, या एकीकृत, गर्म एल्यूमीनियम थाली एक काम अंतरिक्ष के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
  2. 5 मिनट की मशीन अवधि के बाद, १६०० µ l संशोधित RPMI १६४० (Hepes) मध्यम जोड़कर पहला वॉश स्टेप तैयार करें (२.० मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब को भरने के लिए) ।
  3. 18 डिग्री सेल्सियस (अनुभवजंय सेटिंग) में 5 मिनट के लिए ३०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक । एक कॉंपैक्ट लाल गोली दीवार पर दिखाई जानी चाहिए (यानी, बंद केंद्र) ट्यूब के तल पर । ट्यूब घुमाएं ताकि गोली ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है और ध्यान से supernatant क्रमिक के सभी (दो चरणों में) एक 1-1.5 मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग कर हटा दें ।
  4. supernatant aspirating के बाद, जोड़ें २,००० µ l संशोधित RPMI १६४० (Hepes) मध्यम, मिश्रण (कोशिकाओं को पुनर्स्थगित करने के लिए), और ऊपर केंद्रापसारक और supernatant आकांक्षा कदम दोहराने.
  5. (Hepes) मध्यम संशोधित RPMI के ४०० µ एल के साथ गोली (प्लाज्मा झिल्ली सना हुआ और 2x धोया लाल रक्त कोशिकाओं) के resuspend । लेबल ट्यूब पीएमएस (प्लाज्मा झिल्ली दाग के लिए संक्षिप्त नाम) ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक पीएच के succinimidyl एस्टर-संवेदनशील rhodamine व्युत्पंन है, जो अंलीय पीएच में और अधिक जोरदार फ्लोरोसेंट हो जाता है, मानव लाल रक्त कोशिकाओं लेबल किया जा सकता है । इस मामले में, प्रतिदीप्ति तीव्रता इसके अतिरिक्त phagosome परिपक्वता के एक उपाय के रूप में कणों के बाद आंतरिक किया गया है के रूप में कार्य करता है ।

6. Opsonization (लेबलिंग) मानव लाल रक्त कोशिकाओं के साथ माउस Immunoglobulin जी (आईजीजी)

  1. 1 µ l माउस जोड़ें (IgG2b) मोनोक्लोनल (क्लोन HIR2) एंटी-ह्यूमन CD235a (1 mg/एंटीबॉडी (पर संग्रहित-20 ° c) पीएमएस लेबल ट्यूब करने के लिए (अनुभाग 5.2 – 5.5 देखें), युक्त प्लाज्मा झिल्ली सना हुआ मानव लाल रक्त कोशिकाओं में निलंबित ४०० µ l माध्यम. CD235a (glycophorin के रूप में भी जाना जाता है) एक erythroid वंश-विशिष्ट झिल्ली sialoglycoprotein है ।
  2. 8 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन । ध्यान दें कि आईजीजी के साथ मानव लाल रक्त कोशिकाओं के opsonization कारण समूहन (कोशिका का झुरमुट). हालांकि समूहन opsonization के एक दृश्य संकेतक के रूप में सेवा कर सकते हैं, यह एकल phagocytic प्रभाव की इमेजिंग के लिए अवांछनीय है । समूहन दरकिनार करने के लिए, एक बार सेल निलंबन (हर 1 मिनट) का उपयोग कर मिश्रण, उदाहरण के लिए, एक चर 20 – 200 µ एल मात्रा पिपेट सेट करने के लिए २०० µ l
    1. 8 मिनट की मशीन अवधि के अंत की ओर, यदि वांछित, मैक्रोफेज स्लाइड धो, हरी फ्लोरोसेंट के साथ मशीन विरोधी F4/80 एंटीबॉडी, 1 मिलीलीटर संशोधित RPMI १६४० (Hepes) मध्यम के साथ । यह सुनिश्चित करें कि वाशिंग स्टेप्स के बाद चैनल स्लाइड के दोनों जलाशय मध्यम से मुक्त हों ।

7. इमेजिंग प्लाज्मा झिल्ली के Phagocytosis सना हुआ और आईजीजी-लेपित मानव लाल रक्त कोशिकाओं

  1. विरोधी के साथ 8 मिनट की मशीन के बाद CD235a एंटीबॉडी (धारा ६.२), पिपेट १०० µ l के साथ एक स्लाइड के चैनल में प्लाज्मा झिल्ली दाग और आईजीजी-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं युक्त मैक्रोफेज हरी फ्लोरोसेंट विरोधी के साथ लेबल-F4/ ८० एंटीबॉडी (चरण 4). इस प्रकार, लाल फ्लोरोसेंट, आईजीजी-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं को हरी फ्लोरोसेंट फ़ैगोसाइट (मैक्रोफेज) में जोड़ा जाता है ।
  2. जैसे ही मानव लाल रक्त कोशिकाओं को जोड़ दिया गया है, एक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप पर चैनल स्लाइड माउंट (स्टेज मशीन के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए सेट) इमेजिंग के लिए, उदाहरण के लिए, एक 60X/ जितनी जल्दी हो सके इमेजिंग शुरू, के बाद से कणों 1 मिनट के भीतर बसने शुरू करते हैं ।
    नोट: १०० एनएम के व्यास के साथ फ्लोरोसेंट मोतियों का प्रयोग, हम मापा, बिंदु फैले कार्यों का विश्लेषण करके, XY x के संकल्प = ०.२२ µm, y = ०.२३ µm (४८८ एनएम लेजर) और x = ०.२७ µm, y = ०.२७ µm (५६१ एनएम लेजर) । हालांकि, photobleaching और phototoxicity को कम करने के लिए समय के दौरान चूक 3d इमेजिंग रहने वाली कोशिकाओं की, हम 2 एक्स 2 बिन्नी का उपयोग कर स्थानिक संकल्प समझौता । बिन्नी संवेदनशीलता बढ़ाता है (सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाता है) और स्वीकार्य फ़्रेम दर, लेकिन स्थानिक रिज़ॉल्यूशन की कीमत पर ।
  3. रिकॉर्डिंग के दौरान फ़ोकस बहाव को रोकने के लिए एक सही फ़ोकस (या समान) प्रणाली का उपयोग करें । सही ध्यान केंद्रित प्रणाली को सक्रिय करने के बाद, ऑफसेट नियंत्रण का उपयोग करने के लिए coverslip के ऊपर तुरंत मैक्रोफेज lamellipodial दखलंदाजी पर ध्यान केंद्रित (नीचे नोट देखें) चैनल स्लाइड के । इस फ़ोकस स्तर z = 0 µm से मेल खाती है । z-स्टैक प्राप्त करें-1 µm से + 16 µm पर ०.८ µm चरणों, जो 22 Z-स्लाइस करने के लिए मात्रा । Z-पोट, उदाहरण के लिए, 1 स्टैक की दर से प्राप्त किया जा सकता है (प्रत्येक चैनल के लिए) 16 मिनट की कुल के लिए हर 15 एस ।
    नोट: अब रिकॉर्डिंग अवधि छवि गुणवत्ता के घाटे से ग्रस्त हैं, मुख्य रूप से photobleaching की वजह से. Z-पोट दो चैनलों में से प्रत्येक के लिए अधिग्रहीत कर रहे हैं: मैक्रोफेज एक ४८८ एनएम लेजर (ग्रीन चैनल) और मानव लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग कर imaged रहे है एक ५६१ एनएम लेजर (लाल चैनल) का उपयोग कर imaged । इस दृष्टिकोण का प्रयोग, विभिंन timepoints पर मैक्रोफेज घूस आईजीजी-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं के विभिंन विचारों को प्राप्त किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, चित्र 2देखें) ।
    नोट: सिस्टम की विशिष्ट सेटिंग्स (2 x 2 बिन्नी के साथ) हैं: ग्रीन चैनल (२०.५% लेजर (५० मेगावाट; ४८८ एनएम) पावर, १०१ संवेदनशीलता (रेंज, 0-255) और २०० ms एक्सपोज़र टाइम); लाल चैनल (१०.५% लेजर (५० मेगावाट; ५६१ एनएम) बिजली, १०१ संवेदनशीलता (रेंज, 0-255) और ९८ एमएस जोखिम समय) ।
    नोट: चैनल स्लाइड के नीचे एक #1 .5 ग्लास coverslip और कांच के एक ही ऑप्टिकल गुणों के रूप में एक ही मोटाई के साथ एक बहुलक है, लेकिन, विशेष रूप से, सामग्री गैस पारगम्यता का लाभ है ।

8. इमेजिंग प्लाज्मा झिल्ली के Phagocytosis सना हुआ और पूरक-लेपित मानव लाल रक्त कोशिकाओं

  1. पूरक-opsonize प्लाज्मा झिल्ली सना हुआ और आईजीजी-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं को इसी तरह के वर्गों के लिए 5 और 6, सिवाय, के बजाय pipetting 4 µ के एल 1:1 पतला लाल रक्त कोशिका निलंबन में 2 मिलीलीटर संशोधित RPMI १६४० (Hepes) मध्यम, धारा ३.३ में वर्णित के रूप में, पिपेट 4 µ एल में 1 मिलीलीटर संशोधित RPMI १६४० (Hepes) माध्यम है, और तदनुसार लेबल ट्यूब 4:1000 । इस प्रकार, मानव लाल रक्त कोशिकाओं 2x अधिक ध्यान केंद्रित कर रहे हैं ।
  2. 4 और 5 वर्गों में कदम के साथ आगे बढ़ना है, लेकिन 4 के साथ बाहर शुरू: 1000 के बजाय 4:2000 मानव लाल रक्त कोशिकाओं का पतला शेयर (4:1000 और 4:2000 के बाद के कमजोर पड़ने का उल्लेख शुरू में 1:1 पतला मानव लाल रक्त वर्गों में वर्णित कोशिकाओं ३.१ और ३.२) ।
  3. एक C5 नल माउस (जैसे, B10 बलिदान । D2-Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; जैक्सन प्रयोगशाला) द्वारा (> हवा में 5%) isoflurane सांस लेना decapitation द्वारा पीछा किया, और रक्त इकट्ठा । हम आम तौर पर एक गोल नीचे 14 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब तुरंत isoflurane सांस लेना और decapitation के बाद में रक्त की ०.८ मिलीलीटर ड्रिप ।
  4. 1 घंटे के बाद, जब रक्त पूरी तरह से coagulated है, अवशिष्ट द्रव एक २.० मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ३०० x g पर केंद्रापसारक । बाद में, ध्यान से पीले सीरम इकट्ठा । आम तौर पर, हम २०० µ एल C5 नल सीरम कम से ठीक हो । C5 null सीरम को बर्फ पर लगाएं ।
  5. प्लाज्मा झिल्ली की 4 मिनट की मशीन आईजीजी के साथ मानव लाल रक्त कोशिकाओं सना हुआ, विरोधी के एक और 1 µ l-CD235a एंटीबॉडी (2x केंद्रित दे) जोड़ने के लिए, और फिर सेल निलंबन के ५० µ एल ले और यह एक अलग २.० मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में मिश्रण ५० µ एल C5 null सीरम. एक और 4 मिनट के लिए, धारा ६.२ के रूप में, pipetting द्वारा (हर 1 मिनट) के लिए एक बार फिर से मिश्रण करने के लिए जारी रखें । इस प्रकार, इस कदम के बाद, मानव लाल रक्त कोशिकाओं 8 मिनट की कुल के लिए किया गया है विरोधी CD235a एंटीबॉडी के साथ मशीन ।
    नोट: C5 शूंय सीरम के साथ 4 मिनट की मशीन अवधि शास्त्रीय पूरक झरना को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त है और C3b के साथ मानव लाल रक्त कोशिकाओं opsonize, जो कारक मैं iC3b से सट गया है ।

9. मानव लाल रक्त कोशिकाओं के आईजीजी-और C3b-opsonization की पुष्टि

  1. माउस के साथ मानव लाल रक्त कोशिकाओं के opsonization की पुष्टि विरोधी CD235a आईजीजी (IgG2b; ६.१ अनुभाग देखें) बकरी विरोधी माउस के साथ कोशिकाओं को मशीन द्वारा एंटीबॉडी (माध्यमिक) एक हरे या लाल फ्लोरोसेंट आईजीजी को एंटीबॉडी संयुग्मित fluorophore ।
    1. जोड़ें 1 µ एल माउस विरोधी CD235a आईजीजी एंटीबॉडी और 1 µ एल फ्लोरोसेंट लेबल विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी मानव लाल रक्त कोशिकाओं के एक ४०० µ एल निलंबन के लिए, और 8 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन । बाद में, दो बार धो (के रूप में खंड 5.2 – 5.5) ।
    2. ४०० µ l संशोधित RPMI १६४० (Hepes) मध्यम और पिपेट १०० µ निलंबन के एक चैनल स्लाइड (देखें चित्रा 1C) में फोकल प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए एल के साथ सेल गोली resuspend ।
      नोट: कोशिकाओं का झुरमुट (agglutinate) पालन करेंगे और धुलाई के बाद resuspension, लेकिन धोने के लिए असीमित माध्यमिक एंटीबॉडी के कारण पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए आवश्यक है ।
  2. मानव लाल रक्त कोशिकाओं के opsonization की पुष्टि करें, माउस आईजीजी के साथ पूर्व लेबल और C5 नल माउस सीरम के साथ मशीन, C3b/iC3b का उपयोग कर के साथ, उदाहरण के लिए, चूहे विरोधी माउस C3b/iC3b/C3c एंटीबॉडी और एक माध्यमिक एंटीबॉडी, उदाहरण के लिए, बकरी विरोधी चूहा आईजीजी एंटीबॉडी संयुग्मित एक हरी फ्लोरोसेंट fluorophore के लिए ।
    1. धुंधला मानव लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग कर धारा 8 में कदम दोहराएं ।
    2. जोड़ें ०.२५ µ एल फ्लोरोसेंट लेबल विरोधी माउस C3b/iC3b/C3c एंटीबॉडी को १०० µ l मिश्रण (५० µ l आईजीजी-लेबल मानव लाल रक्त कोशिकाओं + ५० µ एल C5 नल माउस सीरम) और 8 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    3. दो बार धो, १०० µ l संशोधित RPMI १६४० (Hepes) मध्यम में गोली resuspend और एक चैनल स्लाइड में निलंबन पिपेट (देखें चित्रा 1C) के लिए फोकल प्रतिदीप्ति इमेजिंग ।

Representative Results

समय-चूक कताई फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा phagocytosis के इमेजिंग के लिए इस्तेमाल चैनल स्लाइड का एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 1में दिखाया गया है । मानव लाल रक्त कोशिकाओं (hRBCs) लाल फ्लोरोसेंट प्लाज्मा झिल्ली मार्कर CellMask ऑरेंज के साथ दाग रहे हैं, जबकि अलग माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज (एमएस) हरी फ्लोरोसेंट Alexa Fluor के साथ लेबल कर रहे हैं ४८८-संयुग्मित विरोधी F4/80 एंटीबॉडी ( चित्रा 2), जो माउस मैक्रोफेज के एक विशिष्ट मार्कर के रूप में और एक प्लाज्मा झिल्ली लेबल के रूप में दोनों कार्य करता है । मानव लाल रक्त कोशिकाओं माउस आईजीजी के साथ opsonized जा सकता है (mIgG), या माउस आईजीएम (mIgM), आईजीजी (या आईजीएम) विरोधी CD235a एंटीबॉडी (CD235a, भी glycophorin ए के रूप में जाना जाता है के साथ कोशिकाओं को मशीन द्वारा, एक प्रोटीन है विशेष रूप से मानव लाल रक्त कोशिकाओं पर व्यक्त) । लाल फ्लोरोसेंट के साथ प्रस्तुत हरी फ्लोरोसेंट मैक्रोफेज के समय चूक 3d इमेजिंग मानव लाल रक्त कोशिकाओं एकल कण phagocytic घटनाओं (चित्रा 2) के दृश्य में सक्षम बनाता है । एकल phagocytic घटनाओं के बंद अवलोकन कण पर कब्जा और घूस का विवरण delineated होने की अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, एक मैक्रोफेज filopodium द्वारा एक mIgG-opsonized मानव लाल रक्त कोशिका का कब्जा, एक पतली, उंगली की तरह प्रक्षेपण, मनाया जा सकता है (चित्र 3ए; यह भी Horsthemke एट अल देखें । 15). इसके अलावा, phagocytic कप के गठन के दौरान एक मानव लाल रक्त कोशिका के निचोड़ (आंकड़ा 3ए) मनाया जा सकता है । नए सिरे से माउस सीरम, mIgG-opsonized, या mIgM-opsonized, मानव लाल रक्त कोशिकाओं की शुरूआत पर क्लासिक झरना, जो एक रक्तलायी झिल्ली का दौरा परिसर के गठन में समापन के पूरक ट्रिगर । पूरक-मध्यस्थता hemolysis के कैनेटीक्स CellMask नारंगी और Calcein के साथ दोहरे दाग इमेजिंग कोशिकाओं द्वारा मापा जा सकता है । ग्रीन फ्लोरोसेंट cytosolic Calcein तेजी से hemolysis (चित्र बी) के दौरान कोशिकाओं से जारी है ।

Figure 1
चित्रा 1: fibronectin-लेपित चैनल स्लाइड की हैंडलिंग । (a) एक चैनल स्लाइड आयाम ५० मिमी x 5 मिमी ०.४ मिमी के साथ एक चैनल द्वारा जुड़े दो जलाशयों के होते हैं. चैनल स्लाइड शुरू में दो जलाशयों में से एक के लिए 1-2 मिलीलीटर मध्यम लागू करने और स्लाइड झुकाव से भर रहे हैं । (ख) टोपियां गर्मी से पहले जलाशयों पर रखा जा सकता है । टोपियां आसानी से बाहर अवांछित हवा के बुलबुले कोशिकाओं के साथ चैनल बोने से पहले पंप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । (ग) एयर बबल-फ्री १०० µ एल चैनल को सीधे pipetting माध्यम द्वारा किसी चैनल के मुँह में भर दिया जा सकता है. इस चरण का उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, एक स्लाइड में मैक्रोफेज बीज के लिए या gfluorophore जोड़ने के लिए (हरी फ्लोरोसेंट)-संयुग्मित विरोधी F4/80 एंटीबॉडी, जो एक झिल्ली लेबल के रूप में कार्य करता है, साथ ही एक माउस मैक्रोफेज मार्कर. (घ) ऐसे opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं के रूप में pipetting कणों के बाद, एक चैनल में फ्लोरोसेंट दाग मैक्रोफेज के साथ वरीयता प्राप्त, स्लाइड एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर रखा जा सकता है, और समय चूक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप हो सकता है प्रदर्शन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: phagocytosis की समय चूक 3 डी इमेजिंग । (क) योजनाबद्ध आरेख प्लाज्मा झिल्ली के opsonization से सना हुआ (लाल फ्लोरोसेंट) मानव लाल रक्त कोशिकाओं (hRBCs) माउस के साथ दिखा रहा है (एम) विरोधी CD235a immunoglobulin जी (mIgG) एंटीबॉडी, और माउस hRBCs लेबल मैक्रोफेज की प्रस्तुति (Ms), लेबल हरी फ्लोरोसेंट fluorophore के साथ (ग्रीन फ्लोरोसेंट)-संयुग्मित विरोधी F4/ (ख) समय चूक छवियों (XZ विचारों), कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त की, phagocytic कप के गठन और mIgG-opsonized hRBCs की घूस दिखा । स्केल बार = 10 µm. (C) 3डी रिकंस्ट्रक्शन दिखाकर मैक्रोफेज घूस mIgG-opsonized hRBCs. इसी XZ विचार (timepoints के 3 के लिए) बी में दिखाया गया है ग्रिड रिक्ति ५.०७ µm का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एक filopodium द्वारा एक कण पर कब्जा । समय चूक छवियों, कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त की, एक चूहा immunoglobulin जी (mIgG) पर कब्जा मैक्रोफेज एक माउस दिखा रहा है-opsonized मानव लाल रक्त कोशिका (hRBC) के माध्यम से एक filopodium (ऊपरी पैनल में तीर), एक उंगली प्रक्षेपण की तरह । ध्यान दें कि लाल रक्त कोशिका phagocytic कप के गठन के दौरान अपने crenations जल्दी खो देता है । इसके अलावा, phagocytic कप को लिफाफा लाल रक्त कोशिका निचोड़ प्रकट होता है (निचले पैनल में तीर से संकेत) । स्केल बार = 10 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

phagocytosis परख के विशाल बहुमत, विशेष रूप से अंत बिंदु और उच्च प्रवाह परख, कैसे कणों वास्तव में कब्जा कर रहे हैं, के दृश्य प्रदान नहीं कर रहे है और लिफाफे में घूस लिया । Munthe द्वारा अग्रणी अध्ययन-Kaas एट अल । 10 और 1970 के दशक में2 कापलान सुझाव दिया है कि हड़ताली अलग cytoskeletal पुनर्गठन आईजीजी के phagocytosis में शामिल-opsonized बनाम पूरक opsonized कणों (भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं) थे । यहां हम phagocytosis का वर्णन परख कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी जो उच्च संकल्प, वास्तविक समय एकल phagocytic घटनाओं के इमेजिंग की अनुमति का उपयोग कर । हमारे मॉडल phagocyte माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज है, जो कम से निपटने के साथ अलग किया जा सकता है, और हम कणों के रूप में हौसले से पृथक मानव लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग करें । हालांकि, phagocytosis परख अंय फ़ैगोसाइट के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे माउस अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज या न्यूट्रोफिल, माउस मैक्रोफेज सेल लाइंस, मानव monocyte-व्युत्पंन मैक्रोफेज या मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल । मानव फ़ैगोसाइट या माउस न्यूट्रोफिल के मामले में, वैकल्पिक फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी की आवश्यकता होगी, जैसे फ्लोरोसेंट लेबल विरोधी CD14 एंटीबॉडी (मानव monocytes/मैक्रोफेज)16 या विरोधी जीआर-1 (6G) एंटीबॉडी (माउस न्यूट्रोफिल) ।

Unopsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं, पारंपरिक रूप से इस्तेमाल किया भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं की तरह, इस अर्थ है कि इन कोशिकाओं को नहीं कर रहे हैं में निष्क्रिय कर रहे हैं (या, कम, बहुत शायद ही कभी) माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज द्वारा घूस. यह सुनिश्चित करता है, polystyrene मोतियों के विपरीत, कम पृष्ठभूमि गतिविधि. मानव लाल रक्त कोशिकाओं को आसानी से माउस आईजीजी या मोनोक्लोनल के खिलाफ आईजीएम CD235a एंटीबॉडी का उपयोग इम्युनोग्लोबुलिन के साथ opsonized जा सकता है (glycophorin ए), मानव एरिथ्रोसाइट्स के एक विशिष्ट मार्कर (लाल रक्त कोशिकाओं) और erythroid के अग्रदूतों17, 18. समानांतर परख में, फ्लोरोसेंट लेबल विरोधी माउस आईजीजी या आईजीएम माध्यमिक एंटीबॉडी opsonization पुष्टि करने के लिए लागू किया जा सकता है । आईजीजी और आईजीएम एंटीबॉडी वर्गों hemagglutinins, पदार्थ (एंटीबॉडी) कि लाल रक्त कोशिकाओं के कारण agglutinate हैं । समूहन से बचने के लिए, हम आवर्तक रूप CD235a एंटीबॉडी के साथ 8 मिनट की मशीन अवधि के दौरान सेल निलंबन मिश्रण, और फिर हम मिश्रित निलंबन सीधे एक मैक्रोफेज-युक्त चैनल स्लाइड (fibronectin-लेपित स्लाइड) एक धोने कदम के बिना जोड़ने . धो चरणों केंद्रापसारक द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं के अवसादन शामिल है, जो दृढ़ता से समूहन को बढ़ावा देता है । opsonizing मानव लाल रक्त कोशिकाओं से पहले, हम एक lipophilic नारंगी/लाल फ्लोरोसेंट जांच के साथ प्लाज्मा झिल्ली लेबल । इस जांच चमकीले समय की शुरुआत में फ्लोरोसेंट है चूक रिकॉर्डिंग, लेकिन संकेत धीरे से फ़ेड, शायद मोटे तौर पर19photobleaching के कारण । इसके अलावा, मैक्रोफेज और स्लाइड के fibronectin कोटिंग कमजोर नारंगी/रिकॉर्डिंग के दौरान लाल फ्लोरोसेंट हो सकता है । यह समस्या संभवतः लेबलिंग के बाद मानव लाल रक्त कोशिकाओं के अपर्याप्त धोने के कारण है । इसके बजाय एक lipophilic फ्लोरोसेंट प्लाज्मा झिल्ली मार्कर का उपयोग कर के, मानव लाल रक्त कोशिकाओं को एक पीएच के साथ लेबल किया जा सकता है संवेदनशील rhodamine अपने अमीन प्रतिक्रियाशील succinimidyl एस्टर15,20का उपयोग कर व्युत्पंन । यह कम पीएच15,20के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ जाती है के बाद से phagosome परिपक्वता के दृश्य की अनुमति का लाभ है, लेकिन इस दृष्टिकोण नुकसान है कि प्रतिक्रियाशील एस्टर की तैयारी वर्तमान में कर रहे है महंगा और अस्थिर जलीय माध्यम में पुनर्गठन के बाद ।

आईजीजी-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं FcγRs, जो मैक्रोफेज21 या नोटं-/-(Fcer1g नॉकआउट) चूहों से अलग पेरिटोनियल Fcer1g का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है के माध्यम से घूस ले रहे हैं । नोटं मैक्रोफेज बाँध आईजीजी-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं, लेकिन कमी आईटम (immunoreceptor tyrosine-आधारित सक्रियण आकृति)-मध्यस्थता संकेत phagocytosis प्रेरित करने के लिए आवश्यक है, जबकि Fcer1g नॉकआउट मैक्रोफेज सतह FcγRs व्यक्त नहीं करते. आईजीजी- या आईजीएम-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं को इसके अतिरिक्त C3b के साथ opsonized जा सकता है (जो iC3b से सट जाता है) एक पूरक C5 नल माउस (जंगली-प्रकार सीरम कारण hemolysis) से ताजा अलग सीरम के साथ कोशिकाओं को मशीन द्वारा । opsonins आईजीजी और आईजीएम शास्त्रीय झरना, जो pores के गठन की ओर जाता है पूरक (झिल्ली हमला परिसरों) और सेल lysis सक्रिय करें । में चूहों कमी पूरक c5, झरना पूरक के लिए C3 दरार के पूरक हैं, लेकिन C5 convertase टर्मिनल मार्ग उत्प्रेरित करने के लिए आवश्यक सब्सट्रेट का अभाव है. हम सरल परख विकसित करने के लिए कैनेटीक्स झरना के पूरक उपाय । संक्षेप में, मानव लाल रक्त कोशिकाओं को एक लाल फ्लोरोसेंट, प्लाज्मा झिल्ली मार्कर और हरी फ्लोरोसेंट, cytosolic fluorophore के साथ सह-लेबल किया जा सकता है । झिल्ली हमला जटिल के गठन पर, C5-C9 घटकों के पूरक द्वारा गठित, cytosolic fluorophore तेजी से (सेकंड में) cytosol से खो दिया है । अंत के दृश्य-प्रभाव (cytolysis) समारोह के पूरक झरना का संकेत दिया है कि 4 मिनट की मशीन समय C3b/iC3b opsonization मानव लाल रक्त कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है । समानांतर परख में, C3b/मानव लाल रक्त कोशिकाओं के iC3b कोटिंग विरोधी माउस C3b और फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी लेबल का एक मिश्रण लागू करने के बाद आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है । इस मामले में, एक धोने कदम असीम फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी को दूर करने के लिए आवश्यक है । हालांकि धोने कदम sedimentaion द्वारा सेल शामिल है, जो समूहन को बढ़ावा देता है, सफल opsonization आसानी से फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । पूरक रिसेप्टर-मध्यस्थता phagocytosis या तो आवेदन आईजीजी-/iC3b-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं को नोटं या Fcer1g-/मैक्रोफेज या आईजीएम-/iC3b-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं जंगली-प्रकार मैक्रोफेज करने के लिए शुरू करने से imaged जा सकता है । आईजीएम-opsonized रक्त कोशिकाएँ FcγRIII-FcγRIV कणों की phagocytosis के लिए आवश्यक आईटम-युक्त FcγRs (FcγRI, आईजीजी और opsonized) द्वारा मान्यता प्राप्त नहींहैं.

छवि phagocytic घटनाओं के लिए, मैक्रोफेज के प्लाज्मा झिल्ली हरी फ्लोरोसेंट fluorophore संयुग्मित विरोधी F4/80 एंटीबॉडी, जो भी माउस मैक्रोफेज के एक विशिष्ट मार्कर के रूप में कार्य करता है के साथ लेबल किया जा सकता है । मानव लाल रक्त कोशिकाओं को एक नारंगी/लाल फ्लोरोसेंट प्लाज्मा झिल्ली मार्कर के साथ मशीन द्वारा लाल फ्लोरोसेंट गाया जा सकता है, के रूप में ऊपर चर्चा की । यह lipophilic प्लाज्मा झिल्ली मार्कर एंटीबॉडी आधारित लेबल के संभावित निराधार प्रभाव से बचा जाता है । लाल फ्लोरोसेंट मानव लाल रक्त कोशिकाओं के साथ या बिना opsonization, सीधे एक चैनल स्लाइड के १०० µ एल चैनल में pipetted जा सकता है और 3 डी समय-एक 60X/1.49 तेल विसर्जन (या इसी तरह) उद्देश्य लेंस के माध्यम से imaged चूक ४८८ एनएम और ५६१ एनएम लेजर लाइनों का उपयोग कर प्रदर्शन , क्रमशः एक कताई डिस्क की (या इसी तरह) माइक्रोस्कोप । यह उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए प्रणाली का अनुकूलन करने के लिए आकर्षक है, लेकिन 16 मिनट से अधिक दोहराया Z-पोट या तो काफी photobleaching और phototoxicity कारण हो सकता है के अधिग्रहण । हम अच्छा संकेत करने के लिए शोर अनुपात को बढ़ावा देने और उत्तेजना तीव्रता और/या जोखिम समय में कटौती की अनुमति 2x2 बिन्नी का उपयोग करने के लिए चुना है, लेकिन ऑप्टिकल संकल्प की कीमत पर । इसके अलावा, phototoxicity को कम करने के लिए, हम मध्यम करने के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों में से एक मेहतर जोड़ें । भविष्य के अध्ययनों में, परख अपोप्तोटिक मानव लाल रक्त कोशिकाओं के phagocytosis छवि को संशोधित किया जा सकता है । इस तरह के A23187 के रूप में एक Ca2 + ionophore, के आवेदन, phosphatidylserine externalization23प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, एक "मुझे खाओ" संकेत और जल्दी24,25की पहचान apoptosis.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम अनुदान के द्वारा समर्थित किया गया हा 3271/4-1 और हा 3271/4-2 से DFG (ड्यूश Forschungsgemeinschaft), और अनुदान एफएफ-2016-05 से EXC १००३ (क्लस्टर ऑफ एक्सीलेंस १००३), प्रमोशन में सेल (यूके), DFG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 G plastic catheter B Braun Mesungen AG, Germany 4254503-01 Used for peritoneal lavage
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14170120 Used for peritoneal lavage
14 mL polypropylene round bottom tubes BD Falcon 352059 Used to collect peritoneal cells
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes Sigma-Aldrich R7388 Basis medium for assays
Heat-inactivated fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10082139 Used as supplement for RPMI 1640 media
100x penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Used as supplement for RPMI 1640 media
Fibronectin-coated µ-Slide I chambers Ibidi, Martinsried, Germany 80102 Channel slides used for assays
µ-Slide (anodized aluminum) rack Ibidi, Martinsried, Germany 80003 Autoclavable stackable rack for channel slides
RPMI 1640 medium containing bicarbonate Sigma-Aldrich R8758 Medium for overnight culture
N-(2-mercaptopropionyl)glycine Sigma-Aldrich M6635 Scavenger of reactive oxygen species
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody Thermo Fisher Scientific MF48020 Mouse macrophage marker and plasma membrane label
CellMask Orange Thermo Fisher Scientific C10045 Red fluorescent plasma membrane stain
Succinimidyl ester of pHrodo Thermo Fisher Scientific P36600 Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo
Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a  Thermo Fisher Scientific MA1-20893 Used to opsonize human red blood cells with IgG
Alexa Fluor 594-conjugated  goat anti-mouse (secondary) IgG antibody Abcam Ab150116 Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG
Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody Hycult Biotech HM1065 Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody Thermo Fisher Scientific A-11006 Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization
Calcein/AM Thermo Fisher Scientific C3100MP Used to load human red blood cells with Calcein
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system  Perkin Elmer, Rodgau, Germany Spinning disk confocal microscope system
Nikon Eclipse Ti inverse microscope Nikon, Japan Inverted microscope
CSU-X1 spinning disk scanner Yokogawa Electric Corporation, Japan Nipkow spinning disk unit
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera Hamamatsu Photonics Inc., Japan EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system 
488 nm solid state laser, 50 mW Perkin Elmer, Rodgau, Germany Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system
561 nm solid state laser, 50 mW Perkin Elmer, Rodgau, Germany Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण मुद्दा १४० मैक्रोफेज phagocytosis लाइव सेल इमेजिंग कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी Fcγ रिसेप्टर्स पूरक रिसेप्टर्स
माउस मैक्रोफेज द्वारा Phagocytosis की समय-चूक 3d इमेजिंग
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Horsthemke, M., Wilden, J., Bachg,… More

Horsthemke, M., Wilden, J., Bachg, A. C., Hanley, P. J. Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (140), e57566, doi:10.3791/57566 (2018).

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