Summary
ここでイメージの単一食イベントに回転ディスク共焦点顕微鏡を用いたマウス腹腔マクロファージの方法について述べる。他の貪食細胞に、プロトコルを拡張できます。
Abstract
貪食は、ティッシュの開発やメンテナンスと同様、ホストの防衛のために重要な役割を果たしているし、キャプチャし、包む大きな粒子を巻き込むアクチン細胞骨格の急速な受容体を介した語順換えを含みます。貪食受容体、下流のシグナル伝達経路における Rho gtp アーゼなどのエフェクタを特定したら、特定の受容体を介した貪食イベントの動的な細胞骨格改造の不明確なままです。四十年前、Fcγ 受容体 (FcγR) と補体レセプター (CR) に代表される食の 2 つの異なるメカニズムは貪食を介した、走査型電子顕微鏡を使用して識別されました。結合免疫グロブリン G (IgG)-FcγRs をオプソニン粒子トリガーとなり完全に囲まれた、セルに撤回する前に最初の粒子のまわりのいわゆる貪食カップを形成する薄い膜拡張の突起。対照的に、食細胞の受容体を補完するためにバインド、次にシンクするオプソニン補完する粒子が表示されます。貪食能、貪食カップ形成と、シンクのこれらの 2 つのモードは、文献で定評になっています。ただし、2 つのモードの違いがその補体受容体を介した貪食は、様々 な膜の突起を引き起こす可能性がありますレポートでぼやけています。食作用の試金が必要な高解像度イメージング技術の可用性は、できる方法特定の貪食受容体の可視化 3 D (3次元) リアルタイム仲介する個々 の粒子の取り込み。詳細はよく使われる手法エンドポイント アッセイなどの貪食に関する研究のため、粒子と食細胞の界面で起こっているを理解する機会を逃します。ここ我々 単一食イベントの 3 D イメージングができるコマ回転ディスク共焦点顕微鏡を用いた貪食の試金を記述します。さらに、明確にイメージ Fcγ 受容体 - や受容体を介した細胞貪食を補完するための法について述べる。
Introduction
1862 年、血液による不溶性色素粒子の貪食で、Metchnikoff の 1882 年に、ヒトデの幼生の貪食間充織細胞の観察と貪食1の彼の理論の後続の開発の前に二十年アーネスト ・ ヘッケル説明テティス fimbris (テティス采)、略奪の海スラグ (アーネスト ・ ヘッケルの種の細胞。Radiolarien (Rhizopoda radiaria) は死ぬ: アイネ ・か。Druck und Verlag ・ フォン ・ ゲオルク ・ ライマー、ベルリン、1862)。彼は明示的に、細胞質に取り込まれ、その後、細胞の核の周囲に蓄積する粒子を包み込む膜の突起を説明します。100 年以上後、カプランによる先駆的な研究は、貪食2の少なくとも 2 つの形態的に異なるメカニズムが示唆されました。カプラン示した走査型電子顕微鏡、マウス腹腔マクロファージ摂取 IgG オプソニン羊赤の血液細胞を達し、粒子をしっかりと包まれて薄い膜の拡張を使用して、最初のカップのような上昇を与える構造体です。貪食カップ形成は、細胞膜透過性の真菌毒素サイトカラシン B、アクチン動態3をブロックする知られていた abrogated 以来アクチン重合を必要です。対照的に、ですが、いくつかの画像膜フリルを沈降粒子のすぐ近くで見ることが、補完とオプソニン羊赤血球は膜拡張を発生せずマクロファージに直接シンクに登場。貪食カップ形成とは異なり補体受容体を介した沈没はサイトカラシン B 処理2insenstive だった。カプランによって記述された実験で免疫グロブリン M の孵化によって補完オプソニン化を行った (IgM) というラベルの付いた羊赤血球は、補体 C5 欠損マウス血清補体 C5 依存端末により溶血を回避すると複雑なを補完します。
カプランによって識別される貪食能、貪食カップ形成と、シンクの 2 つのモードとなっているフィールド4,5,6,7,8,9 に意見を設立し.ただし、超高解像度の画像は、ムンテ ・ カースらによる同様の調査と同様、カプラン2、元の研究で使用10、食イベントのスナップショットを提供するだけ。最近のレビュー、ジャックルージュリらで11では、媒介 FcγR と CR 貪食の形態差は明らかと、また、膜フリルが補体受容体を介した粒子取り込み2の間に観察されていると強調しました。住セルイメージ投射粒子の捕捉から遺伝子と組み合わせて内面にまたがる単一の食イベントのマウス ・ モデルを変更、食をキャプチャし、粒子を摂取の私達の理解が大幅に向上します。1 つのアプローチは、生きている細胞の超高分解能 (10-20 nm) 地形イメージングを可能にする高速原子間力顕微鏡 (AFM) を使用することです。最近、急速に低ノイズでイメージング細胞表面に適している高速原子間力顕微鏡システム12が開発されています。この手法は利点固定と臨界点乾燥を必要と走査電顕とは異なり短い間隔 (秒) でセルを測定ことができる生活の高解像度、地形的、力学的パラメーターセルです。別のアプローチは、コマ撮りの 3 D 共焦点顕微鏡では、光毒性と漂白が録画中に制限要因が広く利用可能であります。この方法は汎用性の高い光学的に高い空間分解能で切断と遺伝的コード化の蛍光蛋白質を含む蛍光プローブの驚異的な範囲にラベルに特別な柔軟性を実現します。ここで我々 は食作用の試金コマ回転ディスク共焦点顕微鏡を用いた特定の受容体を介した貪食イベントの高時空間解像度を許可をについて説明します。
Protocol
プロトコルは、私たち地元の人間研究の倫理委員会のガイドラインだけでなく、動物のケアのガイドラインに従ってください。
1. 居住者のマウス腹腔マクロファージの分離
- 犠牲にするマウス (3-4 ヶ月の年齢 (どちらかの性);例えばC57BL/6 系統) 揮発性麻酔薬イソフルランの過剰摂取を使用して (> 空気中 5%) または二酸化炭素13、頚部転位が続きます。足引っ込め反射の損失によってだけでなく、立ち直り反射14の損失によって、麻酔導入を容易に評価できます。
- 80% エタノール水を使って、マウスの腹を洗浄後正中皮膚切開を行い根本的な腹部壁を公開します。
- Peritonium と洗浄 2 × 4.5 mL 冷たいハンクのバッファリングされた塩溶液 (HBSS) Ca2 +と Mg2 +5 mL プラスチック注射器を経由せずにキャビティに 24 G のプラスチック製カテーテルを配置します。、注入しながら残留約 0.5 mL を残して HBSS (5-4.5 mL (注入) = 0.5 mL) の場合注射器で組織カテーテルの先端に吸われ、追放される必要があります。14 mL ポリプロピレン製丸底チューブと室温で 6.5 分間 300 × gで遠心分離機に吸気の懸濁液を転送します。
注意: プラスチック製のカテーテルの先端が鈍針に比べると、これは腹部の内容への損傷を最小限に抑えます。通常、次の穏やかな腹部のマッサージ、8 mL の腹膜の細胞懸濁液を腹腔内から取得できます。 - 上澄みを廃棄し、1 mL 炭酸無料 RPMI 1640 を含む培地 20 mM Hepes、10% 熱不活化牛胎児血清 (100 単位/ml) ペニシリンとストレプトマイシン (100 μ g/mL)、作製などの抗生物質で腹腔細胞を再懸濁します100 x ペニシリン/ストレプトマイシン 1: 100 希釈すること。これは通常約 6 x 106セル/mL の濃度を提供します。
注: 他の (より小さい) 細胞は主に B 細胞リンパ球に対し、分離腹腔細胞の約 30%、マクロファージです。
2 スライド チャネルにおける腹腔細胞の播種
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チャネルのフィブロネクチン コート スライドの事前のチャンネル (ボリューム、100 μ L) にピペット 100 μ L 懸濁液の凝集を抑える上下に細胞懸濁液を分注した後 (100 μ L チャネルが寸法 (長さ x 幅 x 高さ): 50 mm × 5 mm 0.4 mm)。
- チャネル スライドの 2 つの貯水池のいずれかに 1 mL の血清添加 RPMI 1640 (Hepes) 媒体を追加、スライド、傾斜し (図 1) の下流の貯水池から培地を吸引によってチャンバーを自動設定します。
- 削除する不要な空気泡、または 2 つの貯水池のいずれかに 1-2 mL の培地を追加、しっかりとリザーバー キャップを適用するキャップ上のリズミカルな親指圧力によって空気をポンプし、必要に応じて、傾斜スライドによるチャネル内の空気の長いストリップ。空気を追放、以後チルト上限なしの貯水池とスライド (および媒体を含んでいる) チャネルに戻って吸い込まれて空気を避けるためにキャップを取り外す前に下向き。
- チャネル スライドの 2 つの貯水池のいずれかに 1 mL の血清添加 RPMI 1640 (Hepes) 媒体を追加、スライド、傾斜し (図 1) の下流の貯水池から培地を吸引によってチャンバーを自動設定します。
- CO2の不在で 37 ° C で 2 時間湿室に細胞を播種、チャネル スライドを孵化させなさい (HCO3以来 CO2は必要ありません-/CO2バッファー システムは Hepes に置き換えられます)。チャネルのスライドは便利な 8 枚のスライドを保持する、ラックに配置できます。通常、1 つのマウスからは、上に 10 人以上は可能です、6-8 のスライドを用意しています。
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ラックを取り外して RPMI 1640 中含まれている炭酸、ペニシリン/ストレプトマイシンと同様に 10% 牛胎児血清を添加した各スライドに RPMI 1640 (Hepes) 培地交換します。
- スライドを傾斜し、下部貯水池や上部貯水池からまず培地を吸引します。次に、貯水池のいずれかに新しい媒体の 1 つの mL を追加、それはチャネルを通して流れてきた後下流の貯水池からスライドと吸引の媒体を傾けます。
- この洗浄 (メディア交換) ステップ後に、貯水池のいずれかに 1 mL の培地を追加することによってチャネル スライドを記入します。
注: は、非常にシンプルでソリューション exchange および非付着性のセルを削除する点で効果的なはチャネルのスライドを使用して、ステップを洗浄です。RPMI 1640 (重炭酸塩) 媒体は通常 5% CO2一晩熱と pH の均衡を確保するために, 注意してください。
- 一晩で 5% CO2加湿インキュベータ 37 ° C 細胞を孵化させなさい。次の日に実験を行います。
3. ひと赤血球の分離
- 2 日目 (2 日目実験; 分離腹腔マクロファージの一晩インキュベートした後)、ヘパリン管に健康なドナーから 1-2 mL 末梢静脈血を集めます。転送 1 mL 丸底 (ポリプロピレン) 2.0 mL 遠心チューブ、300 x g で 18 ° C (実証設定) で 5 分間遠心、上清 (プラズマとバフィー コート) を削除。
- 優しく堆積赤血球の 100 μ L を吸引し、変更された RPMI 1640 (Hepes) の媒体 (後述) 2.0 mL 丸底遠心チューブにこのボリューム 1:1 を混ぜます。チューブ「1:1」のラベルします。
注: セルを分離後 (試金) の 2 日目に使用 RPMI 1640 (Hepes) メディアに含まれる、10% 熱不活化牛胎児血清、ペニシリン (100 単位/ml)、ストレプトマイシン (100 μ g/mL)、1 mM n-(2-mercaptopropionyl) グリシン (削減するだけでなく毒性)。以下、この媒体は「変更」RPMI 1640 (Hepes) 媒体として呼ばれます。 - 1:1 希釈赤血球懸濁液の 4 μ L をピペット 2 mL に RPMI 1640 (Hepes) 媒体を変更、事前 2.0 mL 遠心チューブに戻 (この手順を繰り返します 2 管をすなわち準備)。各チューブ「4:2000」のラベルを付けます。氷の上には、「1:1」および「4:2000」のチューブを配置します。
4. マクロファージ細胞膜のラベリング
- CO2インキュベーターからシード チャンネル スライドを削除し、変更された RPMI 1640 (Hepes) 中の各スライドの RPMI 1640 (重炭酸塩) 培地交換します。次に、CO2の不在で 37 ° C で湿室にセルを配置します。
注: 一晩インキュベート、洗濯後、リンパ球のほとんどは、チャネルから削除されます。残りの付着性のセルの大半は、形態学的、または蛍光抗体法による抗-F4/80 抗体を用いた識別ことができますマクロファージです。約マウス腹腔マクロファージの 95% は F4/80 正です。 - 緑蛍光標識抗マウス F4/80 (4 ° C で保存) 抗体 1:40 修正 RPMI 1640 (Hepes) 中を希釈します。スライドを取る、傾けるし、スライドの 100 μ L チャネルの開口部に抗体の混合物の (一滴ずつ) 100 μ L をピペット (図 1参照)。下流の貯水池に流入する媒体を吸い出しなさい。37 ° C (加湿環境、CO2なし) で 20 分のセルを孵化させなさい。潜伏期間中にラベルのひと赤血球 (セクション 5 を参照してください) を実行します。
注意: 上記に触れたように、CO2以降ではない必要な HCO3-/CO2バッファー システムは Hepes に置き換えられます。 - によって容易に 20 分インキュベーション時間 (その中にひと赤血球がステンド グラスし、オプソニン、洗浄 1 mL を追加してスライド変更 RPMI 1640 (Hepes) 中 1 つの貯水池とそれは、チャネルを通じて流れてきた後、培地を吸引) 後スライドを傾斜します。短期的なストレージのための 1 mL 媒体を追加または実験 (すなわち粒子 (オプソニン赤い血球) でピペッティング、コマの回転のディスク共焦点顕微鏡による貪食をイメージング) に進みます。
5. 人間の赤血球の膜のラベリング
- (セクション 4.2) の後で緑の蛍光に分類された反-F4/80 抗体を用いたマクロファージのスライドをインキュベート後すぐにひと赤血球のラベリングを開始します。穏やかな混合後 (セクション 3.3 を参照)「4:2000」チューブの 1 つから 400 μ L と (丸底) 2.0 mL 遠心チューブに分注します。37 ° C のまわりに懸濁液のための時間を許可する (下項参照)。0.4 μ L オレンジ/赤蛍光膜汚れ (因数-20 ° C で保存) を加えてミックス 5 分の 37 ° C で孵化させなさい。
注: 層流フードの内部配置温水アルミニウム ブロックはスライドを準備している間熱損失を最小限に抑えるために役立ちます。暖房のブロックとは、別のボア井戸にチューブを配置ことができます。 または統合、温水のアルミ板が作業スペースとして使用できます。 - 5 分潜伏期間後 1600 μ L 変更 RPMI 1640 (Hepes) 媒体 (2.0 mL 遠心チューブに合わせて) を追加することによって最初の洗浄ステップを準備します。
- 300 x g 18 ° C (実証設定) で 5 分間でチューブを遠心します。コンパクトな赤いペレットが管の底で壁 (すなわちオフセンター) に表示されます。ペレットが上向きで、チューブを回転させるし、1-1.5 mL のピペット チップを使用して連続して (2 段階) で清のすべてを慎重に取り外します。
- 上清を吸引後 2,000 μ L 変更 RPMI 1640 (Hepes)、中 (細胞を再懸濁します) に、ミックスを追加し、上記の遠心分離し、上清吸引手順を繰り返します。
- 変更された RPMI 1640 (Hepes) 媒体の 400 μ L で (細胞膜の染色し、2 倍洗浄赤血球) ペレットを再懸濁します。チューブ PMS (膜汚れの略) のラベルを付けます。
注: なる pH 敏感なローダミン誘導体サクシニミジルエステルも強く酸性 pH で蛍光はひと赤血球をラベルに使用することができます。この場合、さらに、粒子が内在している後、蛍光強度の内容もファゴソーム成熟の指標として役立ちます。
6. オプソニン化ひと赤血球とマウス免疫グロブリン G (IgG) の (ラベル)
- 1 μ L (IgG2b) マウス モノクローナル抗体 (クローン HIR2) 抗ひと CD235a を追加 (1 mg/mL) 抗体 (-20 ° C で保存) 細胞膜を含む PMS (セクション 5.2-5.5 参照)、ラベルの付いたチューブ染色ひと赤血球 400 μ L 中で中断します。CD235a (グリコフォリン A とも呼ばれます) は、赤血球が系統特異膜シアロ糖タンパク質です。
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8 分注赤血球 IgG 原因凝集反応 (細胞凝集) とそのオプソニンの 37 ° C で孵化させなさい。凝集は、オプソニンの視覚的なインジケーターとして使用できる、ただしそれは単一作用のイメージングのため望ましくありません。凝集反応を回避、繰り返しのミックス変数を使用して細胞懸濁液 (1 分毎) 20-200 μ L のボリューム ピペット 200 μ L を設定します。
- 8 分潜伏期間の終わりに向かって、必要に応じて洗浄は蛍光グリーンと培養マクロファージ スライド分類された抗体. 抗-F4/80、1 ml RPMI 1640 (Hepes) 媒体を修正します。洗濯の手順の後、チャンネル スライドの両方の貯水池が媒体の自由であるを確認します。
7. イメージング貪食細胞膜の染色し、IgG コーティングひと赤血球
- 抗 CD235a 抗体 (セクション 6.2) 8 分インキュベーション後ピペット 100 μ L サスペンション膜染色し、IgG オプソニンひと赤血球マクロファージ緑蛍光抗-F4 の付いたを含むスライドのチャンネルに含まれている/80 抗体 (ステップ 4)。したがって、赤い蛍光、IgG オプソニンひと赤血球は緑色蛍光食細胞 (マクロファージ) に追加されます。
- ひと赤血球が追加され、すぐにマウント チャンネル スライド回転のディスク共焦点顕微鏡の (37 ° C に設定段階インキュベーター) 60 X を介して、例えば、イメージングのため/1.49 油浸対物レンズ。粒子を 1 分以内に解決を開始するので、できるだけ早く画像を開始します。
注: 100 の直径を持つ蛍光ビーズを用いた nm、測定、ポイントの解析による広がり関数 x の XY 解像度 0.22 μ m = y = 0.23 μ m (488 nm レーザー) と x = 0.27 μ m、y = 0.27 μ m (561 nm レーザー)。しかし、退色、光毒性を減らすため、生きている細胞の 3 D イメージ投射時間経過の間には、我々 は 2 x 2 のビニングを用いた空間分解能を妥協します。ビニング感度 (信号対雑音比が向上) と許容フレーム レートを増加させるが、空間分解能を犠牲にして。 - 完璧なフォーカスを使用して (または類似の) 録音中にフォーカス ドリフトを防止するシステム。完璧なフォーカス システムをアクティブ化した後、coverslip のすぐ上のマクロファージ葉状突起の上に集中するオフセット コントロールを使用 (下のメモを参照) チャネル スライドの。このフォーカス レベル Z に対応 = 0 μ m. 取得 Z スタック-1 μ m から 22 Z スライスにのぼる 0.8 μ m ステップで +16 μ m に。Z スタックなどで入手できます (各チャネル) の 1 スタック率すべて 15 16 分の合計のための s。
注: 長時間録音に苦しむフォトブリーチングによる主の画像品質の損失。Z スタックが 2 つのチャネルのそれぞれの取得: マクロファージは、488 nm レーザー (グリーン チャンネル) を使用してイメージを作成およびひと赤血球が 561 nm レーザー (赤のチャネル) を使用してイメージを作成します。このアプローチを使用すると、異なる縦長で、ヒトの赤い血液細胞を IgG オプソニンを摂取マクロファージのさまざまなビューを取得ことができます (たとえば、図 2を参照)。
注: (2 x 2 のビニング) を使用してシステムの典型的な設定は、: グリーン チャンネル (20.5% レーザー (50 mW; 488 nm)、101 の感度 (0 ~ 255 範囲) の電源と 200 ms 露光時間);赤のチャネル (10.5% レーザー (50 mW; 561 nm)、101 の感度 (0 ~ 255 の範囲) の電源と 98 ms 露光時間)。
注: チャネル スライドの下部は #1.5 ガラス基板と同じガラス、光物性と同じ厚さとポリマーが、特に、材料ガス透過性という利点があります。
8. 膜染色と補体コーティングひと赤血球の貪食能のイメージング
- 補完する opsonize 膜の染色し、IgG オプソニンひと赤血球の同様にセクション 5、6 を除いて、変更 2 mL RPMI 1640 (Hepes) 媒体に 1:1 希釈赤血球懸濁液の 4 μ L 分注ではなくセクション 3.3 で説明されているよう変更 1 mL RPMI 1640 (Hepes) 中に 4 μ L をピペットし、それに応じてラベルをチューブ 4:1、000。したがって、人間の赤血球は、2 倍濃縮です。
- セクション 4 と 5 の手順を続行しますが、ひと赤血球の希釈 4:2,000 ストックではなく、4:1,000 始まること (4:1、000 と 4:2,000 を参照して、最初 1:1 希釈ひと赤血球のセクションで説明の後希釈液3.1 と 3.2)。
- 犠牲に C5 null マウス (例えばB10。D2-Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ;ジャクソンの実験室) 続く斬首、および収集血 (> 5% 空気中) イソフルラン吸入。我々 は通常イソフルラン吸入と斬首直後丸底 14 mL プラスチック チューブに血液の約 0.8 mL を滴下します。
- 1 時間後血が完全に凝固するときは、2.0 mL 遠心管、室温で 5 分間 300 × gで遠心分離に残留液を転送します。その後、慎重には、黄色の血清を収集します。通常、我々 は、少なくとも 200 μ L C5 null 血清を回復します。氷の上には、C5 null 血清を配置します。
- 後膜の 4 分インキュベーションでは、ひと赤血球 IgG とステンド グラス、別 1 μ L (2 倍濃縮を与える)、抗 CD235a 抗体の追加し、細胞懸濁液を 50 μ l 添加を取るし、50 μ L C5 null 値を含む別の 2.0 mL 遠心チューブに混ぜる血清。繰り返しセクション 6.2 のように別の 4 分の上下、ピペッティングで (1 分毎) をミックスし続けます。したがって、この手順の後 8 分の合計は抗 CD235a 抗体を用いたひと赤血球を培養されています。
注: C5 null 血清 4 分の潜伏期間は、古典的な補体カスケードをアクティブにし、c3b は、により切断される要因私 iC3b へひと赤血球を opsonize するのに十分です。
9. 確認の IgG と C3b - の - オプソニンひと赤血球
-
アドロイにヤギ抗マウス (セカンダリ) IgG 抗体の緑または赤の蛍光 fluorophore に活用される赤血球マウス抗 CD235a (IgG2b; 参照セクション 6.1) IgG 抗体のオプソニン化を確認します。
- ひと赤血球 400 μ L 懸濁液 1 μ L マウス抗 CD235a 抗体と 1 μ L 蛍光標識抗マウス抗体を追加し、8 分の 37 ° C で孵化させなさい。その後、2 回 (のようにのセクション 5.2-5.5) を洗います。
- RPMI 1640 (Hepes) を変更 400 μ L で細胞ペレットを再懸濁します共焦点蛍光イメージングのためのチャンネルに懸濁液の中、ピペット 100 μ L スライド (図 1を参照)。
注: セルが塊 (アグルチネート) 次の洗濯と、巻き上がりが、洗浄非連結二次抗体によるバック グラウンド蛍光を抑える必要があります。
-
ひと赤血球のオプソニン化済みの付いたマウス IgG と C5 の null マウス血清、C3b/iC3b の使用すると、たとえば、ラット抗マウス C3b/iC3b/C3c 抗体二次抗体とインキュベートを共役ヤギ抗ラット IgG 抗体を確認します。緑の蛍光蛍光。
- 無染色のひと赤血球を使用してセクション 8 の手順を繰り返します。
- 蛍光標識抗マウス抗体 C3b/iC3b/C3c 100 μ L 混合物 (50 μ L IgG 標識赤血球 + 50 μ L C5 null マウス血清) 0.25 μ L を追加し、8 分の 37 ° C で孵化させなさい。
- 2 回洗って、100 μ L 変更 RPMI 1640 (Hepes) 媒体やピペット共焦点蛍光イメージングのためのチャンネルに懸濁液スライド (図 1 を参照) でペレットを再懸濁します。
Representative Results
コマ回転共焦点顕微鏡による貪食のイメージングに使用チャネル スライドの模式図を図 1に示します。分離されたマウス腹腔マクロファージ (Ms) が緑蛍光 Alexa Fluor 488 共役アンチ-F4/80 抗体 (と分類されるに対し、ひと赤血球 (hRBCs) 赤い蛍光膜マーカー CellMask オレンジと汚れる図 2)、マウス大食細胞の特異的マーカーと膜ラベルとしての両方を提供しています。ひと赤血球は、(CD235a として知られているグリコフォリン A はひと赤血球に特異的に発現するタンパク質) igg 抗体 (IgM) の抗 CD235a 抗体と細胞の孵化によってマウス IgG (mIgG)、またはマウス IgM (政経) でオプソニンできます。赤蛍光赤血球は、緑の蛍光マクロファージのコマ撮りの 3 D イメージングでは、単一粒子の貪食イベント (図 2) の可視化を実現。 にします。単一の食イベントの観察では、粒子の捕捉と摂取は線引きするの詳細をことができます。たとえば、mIgG オプソニンひと赤血球マクロファージ filopodium、指のような細い突起によっての捕獲観察できる (図 3 a; Horsthemkeらも参照してください。15). さらに、人間の赤血球の貪食カップ形成の間に絞る観察できる (図 3 a)。MIgG オプソニン、新鮮なマウス血清や松下政経塾オプソニン、人間の赤血球の溶血性膜の攻撃の複合体の形成で絶頂に達する古典的な補をトリガーします。CellMask オレンジとカルセイン デュアル染色細胞による補体による溶血の動態を測定できます。緑の蛍光細胞質カルセインは溶血 (図 3 b) 細胞から急速に解放されます。
図 1: チャネルのフィブロネクチン コート スライドの処理します。(A) A チャンネル スライド寸法 50 mm × 5 mm 0.4 mm。 チャネル スライドは最初 2 つの貯水池のいずれかに 1-2 mL の培地を適用し、スライドを傾斜事前入力チャネルによって接続されている 2 つの貯水池で構成されています。(B) のキャップは、孵化する前にタンクの上に配置できます。キャップを便利に使用できるセルのチャネルを播種する前に不要な空気の泡をポンプします。(C) 空気バブル無料 100 μ L チャネルは、チャネルの口の中に直接培地を分注で充填が可能します。この手順する使用されます、たとえば、シード マクロファージにスライドまたは gfluorophore (蛍光グリーン) を追加する-共役のアンチ-F4/80 抗体を膜ラベルとしてマウスのマクロファージ マーカーとして機能します。(D) 蛍光とシードのチャンネルにオプソニンひと赤血球などの粒子をピペッティングした後染色マクロファージ、スライド倒立顕微鏡のステージ上に配置し、コマの回転のディスク共焦点顕微鏡することができます。実行されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 食の時間経過の 3 D イメージングします。(A) 模式図膜染色 (蛍光レッド) ひと赤血球 (hRBCs) のオプソニン化 (m) マウス抗 CD235a 免疫グロブリン G (mIgG) 抗体とマウスのマクロファージ (Ms) にラベル付き hRBCs のプレゼンテーション(緑蛍光) を緑蛍光蛍光標識抗-F4/80 抗体に付いています。(B)コマ撮り画像 (XZ ビュー)、貪食カップ形成と hRBCs の mIgG オプソニンの摂取を示すディスク共焦点顕微鏡を回転によって得られます。スケール バー = 10 μ m. (C) 3 D 再構成マクロファージ mIgG オプソニン hRBCs を摂取することを示します。(の縦長の 3) 対応する XZ ビューは、B. グリッド間隔を表すに表示されます μ m 5.07この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 3: 粒子の filopodium でキャプチャします。コマ撮りの画像がマウス免疫グロブリン G (mIgG) をキャプチャ マウスのマクロファージを示すディスク共焦点顕微鏡を回転によって得られる-オプソニン赤血球 (hRBC) filopodium (上部のパネルで矢印) 経由で指のような突起。赤の血液細胞が貪食カップ形成の初期段階でその crenations を失うことに注意してください。さらに、(下のパネルの矢印で示されます) エンベロープの赤血球を圧迫する貪食のカップが表示されます。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
エンドポイントと高スループット試金、特に食作用の試金の大半は、どの粒子実際にキャプチャされ、包まれて、摂取の可視化を提供しません。ムンテ ・ カースらによる先駆的な研究10とカプラン2 1970 年代に著しく異なる細胞骨格の再編成が補完するオプソニン粒子 (羊赤血球) 対 IgG オプソニン貪食に関与していたことが示唆されました。ここで我々 は食作用の試金回転ディスク共焦点顕微鏡を用いた単一食イベントの高解像度、リアルタイム イメージングが可能をについて説明します。私たちのモデルの食細胞は、マウス常駐腹腔マクロファージでは最小限の処理を分離できるので、粒子として新鮮単離ひと赤血球を用いて。ただし、食作用の試金はマウス骨髄由来マクロファージや好中球、マウスのマクロファージ細胞株、ひと単球由来マクロファージひと末梢血好中球などの他の食細胞に適用でした。人間の食やマウス好中球の場合代わりに蛍光標識抗体が蛍光に分類された抗 CD14 抗体 (ひと単球/マクロファージ)16または抗 Gr 1 Ly (6 G) 抗体 (マウスなど、必要になります好中球)。
Unopsonized ひと赤血球、伝統的に使用される羊赤血球細胞のようなこれらの細胞はマウス腹腔マクロファージによって摂取されません (または、少なくとも、非常にまれ) という意味で不活性。これにより、ポリスチレン ビーズと対照をなして低バック グラウンド アクティビティです。ひと赤血球は便利な CD235a に対してマウス IgG または IgM モノクローナル抗体を用いた免疫グロブリンとオプソニンができます (グリコフォリン A) ひと赤血球 (赤い血液細胞)、赤芽球前駆体17,の特異的マーカー18. オプソニン化を確認する平行アッセイ、蛍光標識抗マウス IgG または igm 抗体二次抗体を適用できます。Igg 抗体と IgM 抗体のクラスは、赤血球、赤血球凝集を引き起こす物質 (抗体) です。凝集を避けるためには、我々 断続的に細胞懸濁液 8 分潜伏期間中に抗 CD235a 抗体と混ぜて洗浄ステップなしマクロファージを含むチャネル スライド (フィブロネクチン コート スライド) に直接混合の懸濁液を加えます.洗浄の手順は、遠心沈降法による凝集反応を強く促進する赤血球の沈降を伴います。ひと赤血球を opsonizing 前に脂溶性オレンジ/レッドの蛍光プローブを用いた細胞膜をラベルします。このプローブは、時間経過の録音の冒頭に鮮やかな蛍光が信号から徐々 に、おそらく主に退色19のため。さらに、マクロファージとスライドのフィブロネクチン コーティング弱オレンジ/レッドのレコーディング中に蛍光になります。この問題はおそらくひと赤血球のラベル付け後の洗浄不足が原因です。脂溶性蛍光膜マーカーを使用する代わりにアミン反応性染色エステル15,20を使用して pH に敏感なローダミン誘導体とひと赤血球を分類する可能性があります。以来、蛍光強度は増加する pH15、20、減少傾向が、このアプローチがあります反応エステル製剤は現在欠点ファゴソーム成熟の可視化の利点があります。高価で、水溶液に溶解後不安定。
IgG オプソニンひと赤血球が由来マクロファージを用いた NOTAM21またはFcer1g-/- (Fcer1g ノックアウト) 確認することができます FcγRs 経由で摂取されます。NOTAM マクロファージ IgG オプソニンひと赤血球、バインドが、ITAM (細胞チロシン活性化モチーフ) を欠いている - Fcer1gノックアウト マクロファージ表面 FcγRs igg 抗体を発現していないのに対し、貪食能を誘導するために必要なシグナリングを仲介 -。IgM オプソニンひと赤血球は、新鮮単離血清補体 C5 null マウスの細胞を培養によって (これは iC3b へ切断) C3b とまたオプソニンできますか (野生型血清, 溶血が原因)。IgG および IgM オプソニン毛穴 (膜の攻撃の複合体)、セル換散の形成につながる古典的な補をアクティブにします。C3 胸の谷間を補完するために補体 C5 に欠けているマウス、補体カスケードの収入が C5 転換酵素は、ターミナルの経路を触媒に必要な基板を欠いています。補体カスケードの動態を測定する簡単なアッセイを開発しました。一言で言えば、ひと赤血球は共同蛍光赤、膜マーカー、グリーンの蛍光、ゾル性細胞質の蛍光で標識することができます。複雑な膜の攻撃の形成、ゾル性細胞質の蛍光体補体成分、C5 C9 によって形成される急速に (単位は秒) が細胞質から失われました。補体カスケードのエンド エフェクタ (細胞崩壊) 関数の可視化は、4 分インキュベーション時間が人間の赤い血球の C3b/iC3b オプソニン十分であることを示されます。並列の試金のひと赤血球の C3b/iC3b コーティングは簡単に抗マウス C3b の混合物を適用した後に評価、蛍光標識した二次抗体できます。この場合、洗浄手順は、非連結の蛍光抗体を削除する必要です。洗浄ステップには凝集を促進し、遠心分離によって細胞沈降が含まれますが、共焦点顕微鏡による成功オプソニン化を容易に評価できます。いずれか適用する IgG によって視覚化される補体受容体を介した貪食/NOTAM またはFcer1g-/- マクロファージ細胞人間の赤い血を iC3b オプソニン IgM-を導入したり iC3b オプソニンひと赤血球細胞に野生型マクロファージ。IgM オプソニンの血液細胞は、ITAM を含む FcγRs (FcγRI、FcγRIII および FcγRIV) IgG オプソニン粒子22の貪食能に必要なによって認識されません。
イメージを貪食するには、イベント、マクロファージの細胞膜はマウス大食細胞の特異的マーカーとしても緑蛍光蛍光共役アンチ-F4/80 抗体と分類することがことができます。ひと赤血球レンダリングできます赤蛍光孵化によって赤/オレンジ蛍光膜マーカーでは、前述の通り。これは脂溶性の細胞膜マーカー抗体ベースのラベルの潜在的な交絡因子を回避できます。赤蛍光赤血球、オプソニン化、有無できるチャネル スライドの 100 μ L チャンネルに直接戻され、60 X を介して 3 D タイムラプス イメージング/1.49 油浸漬 (または類似の) 対物レンズを用いて、488 nm と 561 nm レーザー ライン、それぞれの回転のディスク共焦点 (または類似の) 顕微鏡。高解像度画像ですが繰り返される Z スタック 16 分以上の獲得のためにシステムを最適化するために魅力的なだからかなり退色、光毒性を引き起こす可能性があります。我々 は 2 × 2 良い信号対雑音比を促進し励起強度および/または露出時間でも光学解像度を犠牲にして削減を許可するビニングを使用しました。さらに、光毒性を減らすためには、我々 はメディアに活性酸素のスカベン ジャーを追加します。将来の研究で、アッセイはアポトーシスひと赤血球の貪食能を画像に修正できます。A23187 など、Ca2 +イオノフォアのアプリケーションは、信号と早期アポトーシス24,25の認刻極印にホスファチジルセリン外在化23、「私を食べて」を誘導するために使用できます。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、HA 3271/4-1 および HA 3271/4-2 DFG (ドイツ研究振興協会) からの助成金と EXC 1003 (優秀 1003 クラスター)、モーション (CiM)、DFG のセルからの FF-2016-05 助成金によって支持されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
| µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
| N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
| Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
| Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
| Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
| Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |
References
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