Summary
Aqui descrevemos os métodos usando microscopia confocal de fiação disco de imagem única fagocíticas eventos por macrófagos peritoneais residente do rato. Os protocolos podem ser estendidos a outras células fagocíticas.
Abstract
Fagocitose desempenha um papel fundamental na defesa do hospedeiro, bem como na manutenção e desenvolvimento do tecido e envolve rápidos, mediada rearranjos do citoesqueleto de actina para capturar, envolver e engolfar partículas grandes. Embora fagocíticas receptores, vias de sinalização a jusante e efetores, tais como as GTPases Rho, foram identificadas, a remodelação do citoesqueleto dinâmico de eventos fagocíticas mediada por receptores específicos permanecem obscuros. Quatro décadas atrás, dois mecanismos distintos de fagocitose, exemplificado pelo receptor Fcγ (FcγR) - e do receptor do complemento (CR) - mediada por fagocitose, foram identificados utilizando microscopia eletrônica. Vinculação de imunoglobulina G (IgG)-partículas opsonized para FcγRs aciona a protrusão de extensões da membrana fina, que formam inicialmente uma so-called Copa fagocítica ao redor da partícula antes que ele se torna completamente fechado e recolhido dentro da célula. Em contraste, as partículas de complemento opsonizada parecem afundar o fagócito ligação para complementar os receptores a seguir. Estes dois modos de fagocitose, formação de Copa fagocíticas e afundando, tornaram-se bem estabelecida na literatura. No entanto, é tornar-se esbateram as distinções entre os dois modos por relatórios que fagocitose mediada por receptores de complemento pode induzir várias saliências de membrana. Com a disponibilidade de técnicas de imagem de alta resolução, fagocitose ensaios são necessários que permitem visualização 3D (tridimensional) em tempo real de receptores fagocíticas como específicos mediato a absorção de partículas individuais. Mais comumente usadas abordagens para o estudo da fagocitose, tais como ensaios de ponto de extremidade, perder a oportunidade de entender o que está acontecendo na interface de partículas e os fagócitos. Aqui descrevemos fagocíticas ensaios, utilizando microscopia confocal disco girando lapso de tempo, que permitem que a imagem em 3D de eventos únicos fagocíticas. Além disso, descrevemos a ensaios para inequivocamente a imagem Fcγ do receptor - ou complementar fagocitose mediada.
Introduction
Vinte anos antes da observação de Metchnikoff de células fagocíticas mesênquima em larvas de estrela do mar, em 1882 e subsequente desenvolvimento de sua teoria da fagocitose1, Ernest Haeckel descreveu, em 1862, a absorção de partículas de corante insolúvel por sangue células de Thetis fimbris (fímbria Tethys), uma espécie de lesma do mar predatória (Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlim, 1862). Ele explicitamente descrito saliências de membrana envolvendo as partículas, que foram posteriormente retomadas para o citoplasma e acumuladas ao redor do núcleo da célula. Mais de 100 anos mais tarde, um estudo pioneiro por Kaplan sugeriu que havia pelo menos dois morfologicamente distintos mecanismos de fagocitose2. Kaplan mostrou por meio de microscopia eletrônica esse rato peritoneal macrófagos ingeriram um ovelha IgG-opsonizada glóbulos vermelhos usando extensões de fina membrana que estendeu a mão e firmemente envolto a partícula, inicialmente, dando origem a uma taça, como estrutura. Formação de Copa fagocíticas exigido polimerização de actina desde que foi revogada pela célula permeável toxina fúngica citocalasina B, conhecido por bloquear a actina dinâmica3. Em contraste, ovelhas glóbulos vermelhos opsonizados com complemento apareceu a afundar-se diretamente no macrófago sem a geração de extensões da membrana, embora, em algumas imagens, babados de membrana podem ser vistos na vizinhança imediata das partículas afunda. Ao contrário da formação de Copa fagocíticas, complemento mediada afundando foi insenstive a citocalasina B tratamento2. Nos experimentos descritos por Kaplan, complemento opsonização foi realizada incubando imunoglobulina M (IgM) rotulado ovelhas glóbulos vermelhos com soro de ratos de complemento C5-deficiente, que contorna a hemólise pelo terminal complemento C5-dependente Complemente o complexo.
Os dois modos de fagocitose, formação de Copa fagocíticas e afundando, identificados por Kaplan tornaram-se opinião estabelecida no campo4,5,6,7,8,9 . No entanto, as imagens de altíssima resolução usados no estudo original de Kaplan2, bem como um estudo semelhante por Munthe-Kaas et al 10, somente fornecer fotos dos eventos fagocíticas. Em uma recente revisão, et al . Rougerie 11 salientou que diferenças morfológicas entre FcγR e CR-mediada por fagocitose continuam a ser esclarecida, e, além disso, babados de membrana tem sido observados durante o complemento de captação das partículas mediada por receptores2. Imagem latente da viver-pilha de eventos únicos fagocíticas, abrangendo desde a captura de partículas para internalização, combinada com geneticamente modificado em modelos do rato, pode melhorar significativamente a nossa compreensão de como os fagócitos capturar e ingerem partículas. Uma abordagem poderia ser a utilização de microscopia de força atômica rápido (AFM), que permite imagens topográficas de resolução ultra-alta (10-20 nm) de células vivas. Recentemente, foi desenvolvido um rápido AFM sistema12 , que é apropriada para superfícies de célula de imagens rapidamente com baixo ruído. Esta técnica tem a vantagem de que os parâmetros de alta resolução, topográficas e mecânica de vida células podem ser medidas em intervalos curtos (segundos), ao contrário de microscopia eletrônica, que exige a fixação e secagem de ponto crítico de células. Outra abordagem é o lapso de tempo 3D microscopia confocal, que é amplamente disponível, embora fototoxicidade e branqueamento são fatores limitantes durante as gravações. Esta abordagem é altamente versátil e permite óptica de corte com alta resolução espacial e permite uma flexibilidade extraordinária na rotulagem, com uma impressionante gama de sondas fluorescentes, incluindo proteínas fluorescentes geneticamente codificadas. Aqui descrevemos fagocitose ensaios utilizando microscopia confocal do disco girando lapso de tempo que permitem alta resolução spatiotemporal de eventos fagocíticas mediada por receptores específicos.
Protocol
Os protocolos sigam as orientações da nossa Comissão de ética de pesquisa humana local, bem como as orientações de cuidados com animais.
1. isolamento de macrófagos peritoneais Mouse residente
- Sacrificar o mouse (3 – 4 meses de idade (ambos os sexos); por exemplo C57Bl/6 COE) usando uma overdose do isoflurano anestésico voláteis (> 5% no ar) ou dióxido de carbono13, seguido por deslocamento cervical. Indução da anestesia pode ser facilmente avaliada pela perda de endireitamento reflexo14, bem como pela perda do reflexo de retirada de pata.
- Depois de limpar a barriga do mouse com 80% de etanol na água, fazer uma incisão de pele e expor a parede abdominal subjacente.
- Colocar um cateter plástico 24-G na peritonium e sal solução (HBSS), sem Ca2 + e Mg2 +através de uma seringa de plástico de 5 mL de tampão de lavagem da cavidade com 2 x 4,5 mL gelada do Hank. Enquanto injetando, deixar cerca de 0,5 mL residual HBSS (5 – 4,5 mL (injetado) = 0,5 mL) em seringa no caso tecido é sugado para dentro da ponta do cateter e precisa ser expulso. Transferi a aspirado suspensão em um tubo de fundo redondo 14 mL polipropileno e centrifugar x g por 6,5 min à temperatura ambiente.
Nota: A ponta do cateter plástico é blunt, que, em comparação com uma agulha, minimiza o prejuízo para o conteúdo abdominal. Normalmente, a seguir suave massagem abdominal, suspensão de células peritoneais de 8 mL pode ser recuperada da cavidade peritoneal. - Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células peritoneais 1ml livre de bicarbonato RPMI 1640 meio contendo 20 mM Hepes, 10% inactivadas pelo calor fetal bovino soro e antibióticos, como penicilina (100 unidades/mL) e estreptomicina (100 µ g/mL), elaborado pelo diluindo 100 x penicilina/estreptomicina 1: 100. Isso normalmente dá uma concentração de cerca de 6 x 106 células/mL.
Nota: Cerca de 30% de células isoladas peritoneais são macrófagos, enquanto as outras células (menores) são linfócitos, predominantemente as células B.
2. semeadura de células Peritoneal no canal Slides
-
Depois de pipetagem a suspensão de células acima e para baixo para reduzir a aglutinação, Pipetar 100 suspensão µ l para o canal pré-carregadas (volume, 100 µ l) de um slide fibronectina revestido canal (um canal de 100 µ l tem as dimensões (comprimento x largura x altura): 50 mm x 5 mm 0,4 mm).
- Prefill câmara adicionando 1 mL de meio de RPMI 1640 (Hepes) de soro-completado para um dos dois reservatórios do slide canal, inclinando o slide e depois aspirar o meio do reservatório de jusante (Figura 1).
- Bolhas de ar remover indesejado, ou longas tiras de ar, no canal da mancha, adicionando 1 a 2 mL de meio para um dos dois reservatórios, firmemente aplicando um tampão do reservatório e então bombear para fora o ar através da pressão do polegar rítmica na tampa e, sempre que necessário, inclinando o slide. Após a expulsão de ar, incline o slide com o reservatório sem tampa (e contendo meio) para baixo antes de remover a tampa para evitar o ar sendo sugado para dentro do canal.
- Prefill câmara adicionando 1 mL de meio de RPMI 1640 (Hepes) de soro-completado para um dos dois reservatórios do slide canal, inclinando o slide e depois aspirar o meio do reservatório de jusante (Figura 1).
- Incubar o slide de canal, semeado com células, em uma câmara úmida para 2 h a 37 ° C, na ausência de CO2 (CO2 não é necessário desde o HCO3-/CO2 sistema de tampão Hepes redacção). Os slides de canal podem ser convenientemente colocados em uma cremalheira, que detém oito slides. Normalmente, 6 – 8 slides são preparados a partir de um rato, embora acima de 10 ou mais são possível.
-
Retire o cesto e trocar o meio RPMI 1640 (Hepes) em cada slide para o bicarbonato contendo meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino, bem como a penicilina/estreptomicina.
- Incline o slide e aspire o médio primeiro do reservatório inferior e, em seguida, do reservatório superior. Em seguida, adicionar 1 mL do meio de novo para um dos reservatórios, incline o slide e aspirado médio do reservatório a jusante, depois tem fluiu através do canal.
- Após esta etapa de lavagem (câmbio médio), preencha o slide do canal, adicionando 1 mL de meio de um dos reservatórios.
Nota: Lavar etapas usando slides de canal é muito simples e eficaz em termos de troca de solução e a remoção de células não-aderentes. Observe que o meio RPMI 1640 (bicarbonato) é normalmente pré-incubado com 5% CO2 durante a noite para garantir o equilíbrio térmico e pH.
- Incube as células durante a noite a 37 ° C, numa incubadora umidificado com 5% de CO2. Realizar experiências no dia seguinte.
3. isolamento de células vermelhas do sangue humano
- No dia 2 (segundo dia de experimentos; após incubação overnight de macrófagos peritoneais isolados), coletar sangue venoso periférico de 1 a 2 mL de um doador saudável, em um tubo heparinizado. Transferir 1 mL para um tubo de microcentrifugadora fundo redondo 2,0 mL (polipropileno), centrifugar 300 x g por 5 min à 18 ° C (configuração empírica) e remover o sobrenadante (plasma e buffy coat).
- Delicadamente, Aspire 100 µ l de células vermelhas do sangue sedimentadas e misturar este volume 1:1 com RPMI 1640 (Hepes) meio modificado (descrito abaixo) em um tubo de microcentrifugadora de 2,0 mL de fundo redondo. Rotule o tubo "1:1".
Nota: O meio RPMI 1640 (Hepes) usado no dia 2 (para ensaios) depois de isolar as células contém, além de 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino, penicilina (100 unidades/mL), estreptomicina (100 µ g/mL) e 1 mM N-(2-mercaptopropionyl) glicina (para reduzir fototoxicidade). Doravante, este meio é referido como "modificado" meio RPMI 1640 (Hepes). - Pipetar 4 µ l de suspensão de células de sangue vermelho diluído 1:1 para 2 mL modificou o meio RPMI 1640 (Hepes), pre-pipetado em um tubo de microcentrifugadora de 2,0 mL (repita essa etapa, ou seja, preparar 2 tubos). Etiquete cada tubo "4:2000". Coloque os tubos "1:1" e "4:2000" no gelo.
4. rotulagem de membrana plasmática macrófago
- Retire os slides canal semeado a incubadora de CO2 e trocar o meio RPMI 1640 (bicarbonato) em cada slide para meio RPMI 1640 (Hepes) modificado. Em seguida, coloca as células em uma câmara úmida a 37 ° C, na ausência de CO2.
Nota: Após incubação durante a noite e lavar, a maioria dos linfócitos é removida do canal. A maioria das restantes células aderentes são macrófagos, que podem ser identificados morfologicamente ou pela mancha da imunofluorescência usando anticorpo anti-F4/80. Cerca de 95% de macrófagos peritoneais residente do rato são F4/80 positivo. - Dilua o verde fluorescente etiquetado anti-rato F4/80 anticorpo (armazenado a 4 ° C) 01:40 em meio RPMI 1640 (Hepes) modificado. Pegue um slide, incliná-lo e pipetar (gota a gota), 100 µ l da mistura de anticorpos para a abertura do canal 100 µ l do slide (ver Figura 1). Meio de aspirado que flui para o reservatório a jusante. Incube as celulas por 20 min a 37 ° C (ambiente umidificado, sem CO2). Durante o período de incubação, rotule as células vermelhas do sangue humanas (ver secção 5).
Nota: Como aludido acima, CO2 não é necessário desde o HCO3-/CO2 sistema de tampão Hepes redacção. - Depois de 20 min tempo de incubação (durante o qual células vermelhas do sangue humanas são manchadas e opsonizadas), lavagem do slide, adicionando 1 mL modificado meio RPMI 1640 (Hepes) a um dos reservatórios e aspirando o meio depois que fluiu através do canal, facilitada pela inclinando o slide. Adicionar 1 mL de meio para armazenamento a curto prazo ou proceder a um experimento (ou seja, pipetagem em partículas (opsonized células vermelhas do sangue) e imaging fagocitose pela microscopia confocal do disco girando lapso de tempo).
5. rotulagem da membrana plasmática das células vermelhas do sangue humano
- Começa a rotulagem das células vermelhas do sangue humanas imediatamente após incubação de um slide de macrófagos com verde fluorescente etiquetadas de anticorpos anti-F4/80 (depois da seção 4.2). Após a mistura suave, tomar 400 µ l de um dos tubos de "4:2000" (ver seção 3.3) e dispense-lo em um tubo de microcentrifugadora de 2,0 mL (fundo redondo). Um prazo para a suspensão aquecer em torno de 37 ° c (Veja o parágrafo abaixo). Adicionar a mancha de vermelho/laranja fluorescente a membrana plasmática de 0,4 µ l (alíquotas armazenadas a-20 ° C), misturar e incubar a 37 ° C por 5 min.
Nota: Um bloco de alumínio aquecido, colocado dentro do capô de fluxo laminar, é útil para minimizar a perda de calor durante a preparação de slides. Os tubos podem ser colocados em poços do bloco de aquecimento e um separado, ou placa de alumínio integrado, aquecida pode servir como um espaço de trabalho. - Após o período de incubação de 5 min, prepare a primeira etapa de lavagem, adicionando 1600 µ l modificado RPMI 1640 (Hepes) médio (para encher o tubo de microcentrifuga 2,0 mL).
- Centrifugar o tubo a 300 x g durante 5 min à 18 ° C (configuração empírica). Um sedimento compacto vermelho deve ser visível na parede (ou seja, fora do centro) na parte inferior do tubo. Girar o tubo, de modo que o sedimento é virada para cima e remova cuidadosamente todo o sobrenadante sucessivamente (em duas etapas) usando uma ponta de pipeta de 1-1,5 mL.
- Depois de aspirar o sobrenadante, adicionar 2.000 µ l modificado RPMI 1640 (Hepes) médio, mistura (para Ressuspender as células) e repita os passos acima de aspiração de centrifugação e o sobrenadante.
- Resuspenda o pellet (da membrana plasmática manchado e 2x lavado de células vermelhas do sangue) com 400 µ l de meio RPMI 1640 (Hepes) modificado. Rotule o tubo PMS (abreviatura de membrana plasmática mancha).
Nota: Como alternativa, o succinimidil éster de um derivado de rodamina sensíveis ao pH, o que torna-se mais fortemente fluorescente em pH ácido, pode ser usado para rotular células vermelhas do sangue humanas. Neste caso, a intensidade da fluorescência além disso serve como uma medida da maturação do fagossoma depois de partículas têm sido internalizadas.
6. opsonização (etiquetagem) de humano glóbulos vermelhos com Mouse imunoglobulina G (IgG)
- Adicionar 1 µ l do mouse (IgG2b) anticorpo monoclonal (clone HIR2) anti-humano CD235a anticorpo (1 mg/mL) (armazenado a-20 ° C) ao tubo rotulado PMS (ver secções 5.2 – 5.5), contendo membrana plasmática manchado humanas hemácias suspendidas no meio de 400 µ l. CD235a (também conhecido como glucoforina A) é um sialoglycoprotein de membrana específicas de linhagem eritroide.
-
Incube a 37 ° C por 8 min. nota a opsonização das células vermelhas do sangue humanas com IgG causas aglutinação (aglutinação de células). Apesar de aglutinação pode servir como um indicador visual de opsonização, é indesejável para a imagem do único efeitos fagocíticas. Para contornar a aglutinação, repetidamente misturar a suspensão de eritrócitos (cada 1 min), usando, por exemplo, uma variável pipeta de volume 20-200 µ l definir a 200 µ l.
- No final do período de incubação de 8 min, se desejado, lave o slide do macrófago, incubado com verde fluorescente etiquetado anticorpo anti-F4/80, com 1 mL modificado meio RPMI 1640 (Hepes). Certifique-se de que ambos os reservatórios do slide canal são livres de médio após as etapas de lavagem.
7. a fagocitose de membrana plasmática de imagem manchada e IgG-revestido de células vermelhas do sangue humano
- Após a incubação de 8 min com anticorpo anti-CD235a (seção 6.2), Pipetar 100 suspensão de µ l contendo manchadas de membrana plasmática e IgG-opsonizada humanas células vermelhas do sangue dentro do canal de um slide contendo macrófagos rotulados com verde fluorescente anti-F4 / 80-anticorpo (passo 4). Assim, vermelhos fluorescentes, IgG-opsonizada humanos glóbulos vermelhos são adicionados ao verdes fluorescentes fagócitos (macrófagos).
- Quando células vermelhas do sangue humanas foram adicionadas, montar o slide de canal em um microscópio confocal de disco girando (com a incubadora de estágio definida a 37 ° C) para a imagem latente, por exemplo, através de um 60 X / 1.49 lente objetiva de imersão de óleo. Começa a imagem logo que possível, desde que as partículas começarem a resolver dentro de 1 min.
Nota: Usando grânulos fluorescentes com um diâmetro de 100 nm, medimos, através da análise de ponto de espalhar funções, resoluções XY de x = 0,22 µm, y = 0,23 µm (488 nm do laser) e x = 0,27 µm, y = 0,27 µm (561 laser nm). No entanto, para reduzir o fotobranqueamento e fototoxicidade durante o lapso de tempo de imagem 3D de células vivas, comprometemos a resolução espacial usando binning 2x2. Binning aumenta a sensibilidade (melhora a relação sinal-ruído) e a taxa de quadros permissível, mas à custa de resolução espacial. - Use um foco perfeito (ou similar) sistema para evitar o desvio de foco durante as gravações. Depois de ativar o sistema de foco perfeito, use o controle de deslocamento de foco para saliências de lamellipodial macrófago imediatamente acima a lamela (ver nota abaixo) do slide canal. Este nível de foco corresponde a Z = 0 µm. obter Z-pilhas de µm-1 a + 16 µm, 0,8 µm passos, que se eleva a 22 Z-fatias. Z-pilhas, por exemplo, contactar a uma taxa de 1 pilha (para cada canal) a cada 15 s para um total de 16 min.
Nota: Longos períodos de gravação sofrem perdas de qualidade de imagem, principalmente devido ao fotobranqueamento. Z-pilhas são adquiridos por cada um dos dois canais: os macrófagos são fotografados usando um laser de 488 nm (canal verde) e células vermelhas do sangue humanas são fotografadas usando um laser de nm 561 (canal vermelho). Usando essa abordagem, várias visões de macrófagos ingerindo opsonizada-IgG humanas células vermelhas do sangue em momentos diferentes podem ser obtidos (por exemplo, ver Figura 2).
Nota: As configurações típicas do sistema (com binning 2x2) são: canal verde (laser de 20,5% (50 mW; 488 nm) de potência, sensibilidade 101 (intervalo, 0-255) e tempo de exposição de 200 ms); canal vermelho (laser de 10,5% (50 mW; 561 nm) de potência, sensibilidade 101 (intervalo, 0-255) e tempo de exposição 98 ms).
Nota: A parte inferior do slide canal é um polímero com a mesma espessura que uma lamela de vidro #1.5 e as mesmas propriedades ópticas de vidro, mas, notadamente, o material tem a vantagem de permeabilidade de gás.
8. a fagocitose de membrana plasmática manchada revestida complemento humano glóbulos vermelhos e de imagem
- Membrana de plasma complemento-opsonize manchado e IgG-opsonizada vermelho sangue células da mesma forma para seções 5 e 6, exceto, em vez de pipetagem µ 4 l de suspensão de células de sangue vermelho diluído 1:1 em meio RPMI 1640 (Hepes) de 2 mL modificado, conforme descrito na seção 3.3, Pipetar 4 µ l meio RPMI 1640 (Hepes) de 1 mL modificado e por conseguinte rotular o tubo 4:1, 000. Assim, as células vermelhas do sangue humanas são 2x mais concentrado.
- Prossiga com as etapas nas seções 4 e 5, mas começando com o 4:1,000, ao invés do estoque de 4:2,000 diluído de células vermelhas do sangue humanos (4:1, 000 e 4:2,000 se referem as diluições subsequentes de inicialmente de 1:1 diluídas humanas células vermelhas do sangue descritas nas seções 3.1 e 3.2).
- Sacrificar um C5 nula do mouse (por exemplo, B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; Laboratório de Jackson) por inalação de isoflurano (> 5% no ar) seguida por decapitação e coletar o sangue. Nós geralmente gotejamento cerca de 0,8 mL de sangue em um tubo de plástico 14 mL de fundo redondo imediatamente após a decapitação e inalação de isoflurano.
- Após 1 h, quando o sangue é totalmente coagulado, transferi o líquido residual em um tubo de microcentrifuga de 2,0 mL e centrifugar 300 x g por 5 min à temperatura ambiente. Posteriormente, cuidadosamente colete o soro amarelado. Normalmente, recuperar pelo menos 200 µ l C5 nulo soro. Coloca o soro nulo C5 no gelo.
- Após incubação de 4 min da membrana plasmática manchadas de células vermelhas do sangue humanas com IgG, adicione outro 1 μl do anticorpo anti-CD235a (dando 2 x concentrada), pegar 50 µ l de suspensão de célula e misturá-lo em um tubo de microcentrifuga separado 2,0 mL contendo nulo de C5 50 µ l soro. Continue a misturar várias vezes (a cada 1 min) pipetando acima e para baixo, como na seção 6.2, por mais 4 minutos. Assim, após esta etapa, as células vermelhas do sangue humanas foram incubadas com anticorpo anti-CD235a para um total de 8 min.
Nota: O período de incubação de 4 min com soro nulo C5 é suficiente para ativar a cascata do complemento clássica e opsonize os glóbulos vermelhos humanos com C3b, o qual é clivado pelo Factor eu iC3b.
9. confirmação de IgG - e C3b-opsonização das células vermelhas do sangue humano
-
Confirme a opsonização das células vermelhas do sangue humanas com anticorpo de IgG (IgG2b; ver secção 6.1) anti-CD235a rato incubando-se as células com cabra anti-rato (secundário) anticorpo IgG conjugado com um fluoróforo fluorescente verde ou vermelho.
- Adicione o anticorpo de IgG 1 µ l do mouse anti-CD235a e 1 µ l fluorescente etiquetadas anti-rato anticorpo secundário a uma suspensão de 400 µ l de células vermelhas do sangue humanas e incubar a 37 ° C durante 8 min. Posteriormente, lavar duas vezes (como em secções 5.2 – 5.5).
- Ressuspender o centrifugado com 400 µ l modificado RPMI 1640 (Hepes) médio e pipetar 100 µ l de suspensão em um canal de deslize (ver Figura 1) para a imagem latente confocal de fluorescência.
Nota: As células serão moita (aglutinação) após a lavagem e ressuspensão, mas de lavagem é necessária reduzir fluorescência de fundo devido ao anticorpo secundário não acoplado.
-
Confirmar a opsonização de glóbulos vermelhos humanos, previamente rotulado com mouse IgG e incubadas com o soro de rato nula de C5, com C3b/iC3b usando, por exemplo, rato anti-rato C3b/iC3b/C3c anticorpo e um anticorpo secundário, por exemplo, anticorpo de IgG anti-rato cabra conjugado para um fluoróforo fluorescente verde.
- Repita as etapas na seção 8 usando imaculados humanos glóbulos vermelhos.
- Adicione 0,25 µ l fluorescente etiquetado anticorpos de C3b/iC3b/C3c anti-rato à mistura de 100 µ l (50 µ l rotulado de IgG humana glóbulos vermelhos + 50 µ l de soro rato nula C5) e incubar a 37 ° C durante 8 min.
- Lave duas vezes, resuspenda o pellet em 100 µ l modificado RPMI 1640 (Hepes) médio e pipeta a suspensão em um canal de deslize (ver Figura 1) para a imagem latente confocal de fluorescência.
Representative Results
Um diagrama esquemático do slide canal usado para a geração de imagens de fagocitose pela microscopia confocal de fiação de lapso de tempo é mostrado na Figura 1. Glóbulos vermelhos humanos (hRBCs) estão manchados com o marcador fluorescente vermelha a membrana plasmática CellMask Orange, Considerando que peritoneals residentes de rato isolado (Ms) são etiquetados com verde fluorescente Alexa Fluor 488-anti-F4/80 anticorpo conjugado ( Figura 2), que serve como um marcador específico de macrófagos de rato e um rótulo de membrana plasmática. Células vermelhas do sangue humanas pode ser opsonizadas com mouse IgG (mIgG), ou mouse IgM (mIgM), incubando-se as células com IgG (ou IgM) anticorpos anti-CD235a (CD235a, também conhecido como glucoforina A, é uma proteína especificamente expressada em células vermelhas do sangue humanas). Imagem em 3D do tempo-lapso de macrófagos fluorescentes verdes, apresentado com vermelhas fluorescentes humanas células vermelhas do sangue permite a visualização de eventos fagocitária de partícula única (Figura 2). Estreita observação de eventos únicos fagocíticas permite detalhes de captura de partículas e ingestão de ser delineado. Por exemplo, a captura de um mIgG-opsonizada humano glóbulo vermelho por um filopodium do macrófago, uma projeção de fina, dedo-como, pode ser observada (Figura 3A; ver também Horsthemke et al 15). Além disso, o apertar de uma hemácia humana durante a formação de Copa fagocíticas pode ser observada (Figura 3A). Mediante a introdução de soro fresco de rato, mIgG-opsonizada, ou humanas, mIgM-opsonizada hemácias desencadear a cascata de complemento clássica, que culmina na formação de um complexo de ataque de membrana hemolítico. A cinética da hemólise mediada por complemento pode ser medida por células manchadas com CellMask Orange e calceína dual de imagem. Verde fluorescente citosólica calceína rapidamente é liberada das células durante a hemólise (Figura 3B).
Figura 1: manipulação de slides canal revestido fibronectina. (A), A corrediça de canal consiste de dois reservatórios ligados por um canal com as dimensões 50 mm x 5 mm 0,4 mm. canal slides inicialmente são pré-carregadas, aplicando 1-2 mL de meio de um dos dois reservatórios e inclinando o slide. Caps (B) podem ser colocadas os reservatórios antes da incubação. As tampas podem ser convenientemente usadas para retirar as bolhas de ar indesejadas antes da semeadura do canal com as células. Canal de 100 µ l (C) o ar livre de bolhas pode ser preenchido diretamente pipetando médio na boca de um canal. Esta etapa é usada, por exemplo, aos macrófagos de sementes em um slide ou para adicionar gfluorophore (verde fluorescente)-anticorpo conjugado anti-F4/80, que serve como um rótulo de membrana, bem como um marcador de macrófagos de rato. (D) depois de pipetagem de partículas, tais como opsonized humanas células vermelhas do sangue, em um canal semeado com fluorescente manchado de macrófagos, o slide pode ser colocado no palco de um microscópio invertido e microscopia confocal do disco girando lapso de tempo pode ser executada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: imagem em 3D do tempo-lapso de fagocitose. (A) diagrama esquemático mostrando a opsonização de membrana plasmática manchada (vermelho fluorescente) humanas células vermelhas do sangue (hRBCs) com o rato (m) anti-CD235a imunoglobulina G (mIgG) anticorpo e apresentação de hRBCs rotulado de macrófagos de rato (Ms), rotulado (verde fluorescente) com verde anticorpo anti-F4/80 de fluoróforo conjugado fluorescente. (B) Lapso de tempo imagens (vistas XZ), obtidas por microscopia confocal disco, mostrando a formação de Copa fagocíticas e ingestão de hRBCs mIgG-opsonizada de giro. Barra de escala = 10 µm. (C) 3D reconstruções mostrando macrófagos ingerindo mIgG-opsonizada hRBCs. Correspondentes vistas XZ (para 3 dos momentos) são mostradas representam espaçamentos de B. Grid 5.07 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: captura de uma partícula por um filopodium. Imagens de lapso de tempo, obtidos por fiação microscopia confocal disco, mostrando um macrófago do mouse captura uma imunoglobulina de rato G (mIgG)-opsonized humana células vermelhas do sangue (hRBC) através de um filopodium (setas no painel superior), uma dedo-como a projeção. Observe que as células vermelhas do sangue perde suas crenations cedo durante a formação de Copa fagocíticas. Além disso, a Copa fagocítica aparece apertar as células vermelhas do sangue envelopada (indicada pelas setas no painel inferior). Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
A grande maioria dos ensaios de fagocitose, especialmente o ponto de extremidade e ensaios de alta produtividade, não fornecem visualização de como as partículas são realmente capturadas, envolto e ingeridas. Estudos pioneiros por Munthe-Kaas et al 10 e Kaplan2 na década de 1970 sugeriram que surpreendentemente diferentes reorganizações do citoesqueleto estiveram envolvidas na fagocitose de IgG-opsonizada contra partículas de complemento-opsonizada (ovelha glóbulos vermelhos). Aqui descrevemos fagocitose ensaios utilizando microscopia confocal do disco girando, que permitem imagens de alta resolução, em tempo real de eventos únicos fagocíticas. Fagócito nosso modelo é o macrófago peritoneal residente do mouse, que podem ser isolados com manipulação mínima, e nós usamos recentemente isolados humanos glóbulos vermelhos como partículas. No entanto, os ensaios de fagocitose podem ser aplicados a outros fagócitos, tais como os macrófagos derivados da medula óssea de rato ou neutrófilos, linhas de células de macrófagos de rato, macrófagos derivados de monócitos humanos ou neutrófilos do sangue periférico humano. No caso dos fagócitos humanos ou neutrófilos rato, alternativa fluorescente etiquetado anticorpos seria necessária, tais como anti-CD14 fluorescente etiquetado anticorpos (monócitos/macrófagos humanos)16 ou anti-Gr-1 (Ly - 6G) anticorpos (rato neutrófilos).
Unopsonized humanas células vermelhas do sangue, como tradicionalmente usado ovelha glóbulos vermelhos, são inertes no sentido de que estas células são não (ou, pelo menos, muito raramente) ingeridas por macrófagos peritoneais de rato. Isso garante que, em contraste com esferas de poliestireno, atividade de baixo fundo. Células vermelhas do sangue humanas pode ser convenientemente opsonizadas com imunoglobulinas usando rato IgG ou IgM anticorpos monoclonais contra CD235a (glucoforina A), um marcador específico de humanas hemácias (glóbulos vermelhos) e eritroide precursores17, 18. em ensaios paralelos, fluorescente etiquetadas do anti-mouse IgG ou IgM anticorpos secundários podem ser aplicados para confirmar a opsonização. As classes de anticorpos IgG e IgM são hemagglutinins, substâncias (anticorpos) que causam hemácias aglutinar. Para evitar a aglutinação, intermitentemente misturamos a suspensão de células durante o período de incubação de 8 min com anticorpo anti-CD235a, e então nós adicionamos a suspensão mista diretamente a um macrófago, contendo canal slide (slide fibronectina-revestido) sem uma etapa de lavagem . Lavagem de etapas envolve a sedimentação de células vermelhas do sangue por centrifugação, que promove fortemente a aglutinação. Antes de opsonização células vermelhas do sangue humanas, rotulamos a membrana plasmática com uma sonda fluorescente de vermelho/laranja lipofílica. Esta sonda é brilhantemente fluorescente no início das gravações de lapso de tempo, mas o sinal gradualmente se desvanece, provavelmente em grande parte devido ao fotobranqueamento19. Além disso, os macrófagos e o revestimento de fibronectina do slide podem tornar-se fracamente vermelho/laranja fluorescente durante as gravações. Este problema é presumivelmente devido à lavagem insuficiente das células vermelhas do sangue humanas depois de rotulagem. Em vez de usar um marcador lipofílico fluorescente a membrana plasmática, as células vermelhas do sangue humanas poderiam ser rotuladas com um derivado de rodamina sensíveis ao pH usando seu amina reativos succinimidil éster15,20. Isto tem a vantagem de permitir a visualização de maturação do fagossoma, desde que a intensidade da fluorescência aumenta com a diminuição do pH15,20, mas esta abordagem tem a desvantagem que éster reativo preparativos estão atualmente caro e instável após reconstituição em meio aquoso.
IgG-opsonizada humanos glóbulos vermelhos são ingeridos através de FcγRs, que pode ser confirmado usar macrófagos peritoneais isoladas de NOTAM21 ou Fcer1g- / - ratos (Fcer1g nocaute). Os macrófagos NOTAM vincular opsonizada-IgG humanas células vermelhas do sangue, mas falta o ITAM (immunoreceptor motivo de ativação baseada em tirosina) - mediada por sinalização necessária para induzir a fagocitose, enquanto os macrófagos nocaute de Fcer1g não expressam IgG FcγRs. superfície - ou IgM-opsonizada humanas células vermelhas do sangue pode ser adicionalmente opsonizadas com C3b (que é clivado para iC3b) incubando-se as células com soro fresco isolado de um rato nula do complemento C5 (o selvagem-tipo soro provoca hemólise). As opsoninas IgG e IgM ativam a cascata do complemento clássica, que leva à formação de poros (complexos de ataque de membrana) e lise celular. Em ratos que faltam complemento C5, a cascata do complemento procede para complementar a clivagem de C3, mas carece de C5 convertase o substrato necessário para catalisar a via terminal. Desenvolvemos simples ensaios para medir a cinética da cascata de complemento. Em suma, células vermelhas do sangue humanas pode ser co rotuladas com um vermelho fluorescente, marcador de membrana plasmática e o fluoróforo verde fluorescente, citosólico. Após a formação do complexo membrana ataque, formado por componentes do complemento C5-C9, o fluoróforo citosólico é rapidamente (em segundos) perdeu do citosol. Visualização da função da cascata de complemento de extremidade-effector (citólise) indicado que o tempo de incubação de 4 min é suficiente para C3b/iC3b opsonização das células vermelhas do sangue humanas. Em ensaios paralelos, pode ser facilmente avaliado após a aplicação de uma mistura de anti-rato C3b C3b/iC3b revestimento das células vermelhas do sangue humanos e fluorescente etiquetado anticorpos secundários. Neste caso, uma etapa de lavagem é necessário para remover anticorpos fluorescentes não acoplados. Embora a etapa de lavagem envolve células sedimentaion por centrifugação, que promove a aglutinação, opsonização bem sucedida pode ser prontamente avaliada pela microscopia confocal. Fagocitose mediada por receptores de complemento pode ser fotografado por qualquer aplicação IgG- / iC3b-opsonizada vermelho sangue células NOTAM ou Fcer1g- / - macrófagos ou introduzindo IgM- / iC3b-opsonizada vermelho sangue células de macrófagos do tipo selvagem. IgM-opsonizada glóbulos não são reconhecidos pelo ITAM-contendo FcγRs (FcγRI, FcγRIII e FcγRIV) necessários para a fagocitose de partículas opsonizada IgG22.
Para imagem fagocíticas eventos, a membrana plasmática de macrófagos podem ser rotulados com conjugado anticorpo anti-F4/80 verde fluorescente fluoróforo, que também serve como um marcador específico de macrófagos de rato. Células vermelhas do sangue humanas pode ser processadas vermelho fluorescente de incubação com um marcador vermelho/laranja fluorescente a membrana plasmática, como discutido acima. Este marcador lipofílico membrana plasmática evita potenciais efeitos confundimento de rótulos baseados em anticorpos. Vermelhas fluorescentes humanas células vermelhas do sangue, com ou sem opsonização, pode diretamente ser pipetadas dentro do canal 100 µ l de um slide de canal e 3D Time-Lapse fotografada através de um 60 X / 1,49 imersão em óleo (ou similar) lente objetiva executada usando a 488 nm e 561 linhas de laser nm , respectivamente, de um microscópio de confocal (ou similar) de disco girando. É tentador para otimizar o sistema para geração de imagens de alta resolução, mas a aquisição de repetidas Z-pilhas mais 16 min ou então pode causar fototoxicidade e fotobranqueamento considerável. Nós escolhemos usar 2x2 binning para promover boas relações de sinal-ruído e permitem a redução na intensidade da excitação e/ou tempos de exposição, mas à custa de resolução óptica. Além disso, para reduzir a fototoxicidade, acrescentamos um saqueador de espécies reativas de oxigênio ao meio. Em estudos futuros, os ensaios poderiam ser modificados para a fagocitose de apoptotic hemácias humanas de imagem. Aplicação de um ionóforo2 + Ca, tais como A23187, pode ser usada para induzir a fosfatidilserina exteriorização23, um "coma-me" sinal e a marca de início apoptose24,25.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subvenções HA 3271/4-1 e HA 3271/4-2 da DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) e o grant FF-2016-05 de EXC 1003 (Cluster de excelência 1003), células em movimento (CiM), DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
| µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
| N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
| Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
| Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
| Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
| Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |
References
- Tauber, A. I.
- Kaplan, G. Differences in the mode of phagocytosis with Fc and C3 receptors in macrophages. Scandinavian journal of immunology. 6, 797-807 (1977).
- Cooper, J. A.
- Caron, E., Hall, A. Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. Science. 282, 1717-1721 (1998).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Chimini, G., Chavrier, P. Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment. Nature cell biology. 2, E191-E196 (2000).
- Castellano, F., Chavrier, P., Caron, E. Actin dynamics during phagocytosis. Seminars in immunology. 13, 347-355 (2001).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 639-649 (2008).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nature reviews. Immunology. 12, 492-502 (2012).
- Munthe-Kaas, A. C., Kaplan, G., Seljelid, R. On the mechanism of internalization of opsonized particles by rat Kupffer cells in vitro. Experimental cell research. , 201-212 (1976).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation of membrane structures during phagocytosis and chemotaxis of macrophages: role and regulation of the actin cytoskeleton. Immunological reviews. , 222-239 (2013).
- Liu, Z., et al. Nanoscale optomechanical actuators for controlling mechanotransduction in living cells. Nature. 13, 143-146 (2016).
- Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Laboratory animals. 50, 241-253 (2016).
- McCarren, H. S., Moore, J. T., Kelz, M. B. Assessing changes in volatile general anesthetic sensitivity of mice after local or systemic pharmacological intervention. Journal of visualized experiments. (80), e51079 (2013).
- Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of biological chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
- Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: Roles of Rho. Scientific reports. 6, 25016 (2016).
- Poole, J. Red cell antigens on band 3 and glycophorin A. Blood reviews. 14, 31-43 (2000).
- Aoki, T. A Comprehensive review of our current understanding of red blood cell (RBC) glycoproteins. Membranes. 7, (2017).
- Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical journal. 68, 2588-2600 (1995).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of immunological. 342, 71-77 (2009).
- Boross, P., et al. FcRgamma-chain ITAM signaling is critically required for cross-presentation of soluble antibody-antigen complexes by dendritic cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5506-5514 (2014).
- Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature reviews. Immunology. 10, 778-786 (2010).
- Closse, C., Dachary-Prigent, J., Boisseau, M. R. Phosphatidylserine-related adhesion of human erythrocytes to vascular endothelium. British journal of haematology. , 300-302 (1999).
- Barth, N. D., Marwick, J. A., Vendrell, M., Rossi, A. G., Dransfield, I. The "phagocytic synapse" and clearance of apoptotic cells. Frontiers in immunology. 8, 1708 (2017).
- Sivagnanam, U., Palanirajan, S. K., Gummadi, S. N. The role of human phospholipid scramblases in apoptosis: An overview. Biochimica et biophysica acta. 1864, 2261-2271 (2017).
