Summary
Det övergripande målet för polysome profilering teknik är analys av enskilda mRNA eller transkriptom mRNA translationell verksamhet under proteinsyntesen. Metoden är viktigt för studier av proteinsyntes förordning, översättning aktivering och förtryck i hälsa och flera mänskliga sjukdomar.
Abstract
Ordentlig proteinuttryck vid rätt tidpunkt och i rätt mängd är grunden för normal cellfunktion och överlevnad i en snabbt föränderlig miljö. Under en lång tid dominerades gen uttryck studierna av forskning på transkriptionell nivå. Dock steady-state nivåerna av mRNA korrelerar inte väl med proteinproduktion och översättbarhet av mRNA varierar kraftigt beroende på förutsättningarna. I vissa organismer, som parasiten Leishmania, regleras proteinuttryck mestadels på translationell nivå. Nyligen genomförda studier visat att protein översättning dysreglering är associerad med cancer, metabola, neurodegenerativa och andra mänskliga sjukdomar. Polysome profilering är en kraftfull metod att studera protein översättning förordning. Det gör att mäta translationell status för enskilda mRNA eller undersöka översättning i genome-wide skala. Grunden för denna teknik är avskiljandet av polysomes, ribosomer, deras subenheter och gratis mRNA under centrifugering av en cytoplasmiska lysate genom en sackaros övertoning. Här presenterar vi en universell polysome profilering protokollet används på tre olika modeller - parasit Leishmania stora, odlade mänskliga celler och djurvävnader. Leishmania cellerna växer fritt i suspension och odlade mänskliga celler växa i vidhäftande enskiktslager, medan mus testiklarna representerar ett djur vävnadsprov. Tekniken är således anpassas efter alla dessa källor. Protokollet för analys av polysomal fraktioner omfattar identifiering av enskilda mRNA nivåer av RT-qPCR, proteiner genom Western blot och analys av ribosomalt RNA genom elektrofores. Metoden kan förlängas ytterligare genom undersökning av mRNA association med Ribosomen på transkriptom nivå av djup RNA-seq och analys av Ribosomen-associerade proteiner av massa spektroskopi av fraktioner. Metoden kan enkelt justeras till andra biologiska modeller.
Introduction
Reglering av genuttryck i cellerna styrs av transkriptionell, postttransskriptionell och posttranslationalen mekanismer. Framsteg i djupa RNA-sekvensering tillåter studier av steady state mRNA nivåer i genome-wide skala på en oöverträffad nivå. Nya rön har dock visat att steady state mRNA nivå inte alltid korrelerar med protein produktion1,2. Ödet för en enskild utskrift är mycket komplex och beror på många faktorer som inre och yttre stimuli, stress, etc. Reglering av genuttryck under proteinsyntesen ger ytterligare ett lager av uttrycket kontroll behövs för en snabb reaktion på förändrade villkor. Polysome (eller ”polyribosome”) profilering, separation och visualisering av aktivt översätta ribosomer, är en kraftfull metod att studera regleringen av proteinsyntes. Även dess första experimentella program visades i 1960-talet3, är polysome profilering för närvarande en av de viktigaste teknikerna i protein översättning studier4. Enda mRNA kan översättas av mer än en ribosom leder till bildandet av en polysome. Utskrifter kan vara stannat på ribosomerna med Kungliga Automobilklubben5 och mRNA som innehåller olika antal polysomes kan separeras i processen polysome fraktionering av sackaros gradient ultracentrifugering6,7 , 8 , 9. RNA analys av polysomal fraktioner sedan tillåter mätning av förändringar i translationell påstår av enskilda mRNA av genome-wide omfattning och under olika fysiologiska förhållanden4,7, 10. metoden har även använts för att avslöja 5' UTR och 3' UTR sekvenser i kontroll av mRNA översättbarhet11roller, undersöka rollen som MicroRNA i translationell förtryck12, avslöja brister i ribosom biogenes13 , och förstå rollen av Ribosomen-associerade proteiner med mänskliga sjukdomar14,15. Under det senaste decenniet, har en växande roll för reglering av genuttryck under översättning framkommit som visar dess betydelse i mänskliga sjukdomar. Bevisen för translationell kontroll i cancer, metaboliska och neurodegenerativa sjukdomar är överväldigande15,16,17,18. Till exempel dysreglering av eIF4E-beroende translationell kontroll bidrar till autism med underskott15 och FMRP är involverad i spilta ribosomer på mRNA kopplade till autism14. Således är polysomal profilering ett mycket viktigt verktyg att studera defekter i translationell förordning i flera mänskliga sjukdomar.
Proteinanalys av polysomal fraktioner under olika fysiologiska förhållanden dissekerar funktionen av faktorer som förknippas med ribosomer under översättning. Polysome profilering tekniken har använts i många arter, inklusive jäst, däggdjursceller, växter och protozoer10,19,20,21. Protozo parasiter som Trypanosoma och Leishmania uppvisar begränsad transkriptionell kontroll av genuttryck. Deras genom är organiserade i polycistronic gen kluster som saknar arrangören-reglerade transkription22. Utvecklingsmässiga genuttrycket styrs istället huvudsakligen på nivå av protein översättning och mRNA-stabilitet i trypanosomatid arter23,24. Förståelse för translationell kontroll i avsaknad av Transkriptionsreglering är därför särskilt viktigt för dessa organismer. Polysomal profilering är ett kraftfullt verktyg att studera från reglering av genuttryck i Leishmania25,26,27,28.
De senaste framstegen i identifiering av enskilda mRNA nivåer av verklig tid kvantitativ PCR (RT-qPCR) och full transkriptom av nästa generations sekvensering, liksom proteomics teknik, ger upplösning och fördelarna med polysomal profilering till en ny nivå. Användningen av dessa metoder kan förlängas ytterligare genom analys av enskilda polysomal fraktioner av djupa RNA-sekvensering kombinerat med proteomiska analys övervaka translationell status av celler i genome-wide skala. Detta möjliggör identifiering av nya molekylära spelare reglera översättning under olika fysiologiska och patologiska förhållanden. Här presenterar vi en universell polysome profilering protokollet som används på tre olika modeller: den parasit Leishmania stora, odlade mänskliga celler och djurvävnader. Vi presenterar råd om förberedelse av cell lysates från olika organismer, optimering av lutningsförhållanden, val av RNase-hämmare och tillämpning av RT-qPCR, Western blot och RNA elektrofores för att analysera polysome fraktioner i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur behandlingar och hantering av vävnaderna i studien utfördes enligt protokoll som godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén på Texas Tech University Health Science Center i enlighet med de nationella instituten av Hälsa djurskydd riktlinjer, protokollnummer 96005. Vänligen offra ryggradsdjur och förbereda vävnader enligt riktlinjerna från den institutionella djur vård och användning kommittén. Om saknar sådan kommitté, hänvisas till National Institutes of Health djurskydd riktlinjerna. Vuxen (> 60 dagar gamla) C57BL/6 möss användes. Alla djur och vävnader erhölls enligt protokoll godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén vid den Texas Tech University Health Sciences Center enligt National Institutes of Health djurskydd riktlinjer. För dödshjälp, en enda mus placerades i en liten kammare, och luften förflyttades successivt med ca 30% koldioxid att söva och minimera nöd av djuret. Efter andningsstopp brukade vi cervikal dislokation bekräfta döden av djuret före skörd vävnader.
Varning: Alla arbetet med levande Leishmania och odlade mänskliga celler skedde i biosäkerhet skåp i BSL-2 certifierat laboratorium.
1. beredning av cytoplasmiska Lysates från Leishmania stora , odlade mänskliga celler, och mus vävnader
Obs: Det finns flera skillnader i lysate förberedelserna från de olika källmaterial. Andra steg inklusive sackaros gradient förberedelse och polysomal fraktionering är identiska och beroende inte av provkällan.
-
Leishmania stora cytoplasmiska lysate beredning
- Inokulera Leishmania stora (FV1 stam) celler i 30 mL 1 x M199 medium29 som innehåller 10% fetalt bovint Serum (FBS) och penicillin/streptomycin blandning (100 enheter och 100 μg/mL motsvarande)på täthet på 1 x 105 celler/mL .
Obs: Alla åtgärder som rör Leishmania stora celler måste utföras i en biosäkerhet skåp. - Placera celler i inkubatorn och odla dem vid 27 ° C tills den logaritmiska fas (mitten av log motsvarar 5 x 106 celler/mL). Det tar vanligtvis cirka två dagar för att växa.
- Lägga till Kungliga Automobilklubben Leishmania stora kultur till en slutlig koncentration på 100 μg/mL att arrestera ribosomerna på översatta mRNA. Placera celler tillbaka i inkubatorn för 10 min vid 27 ° C.
- Efter Kungliga Automobilklubben behandling är klar, överföra celler till en 50 mL konisk tub och snurra dem på 1.800 x g och 4 ° C i 8 min. Kassera supernatanten.
- Tvätta cellerna med 30 mL Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS). Centrifugera vid 1.800 x g och 4 ° C i 8 min.
- Kassera supernatanten. Att resuspendera cellerna i 1 mL DPBS.
- Ta en alikvot av celler och blanda det med 3,5% formaldehydlösning.
- Räkna celler av hemocytometer och avgöra deras koncentration. Över önskat antal celler till mikrofugrör. Lysate beredd från 0.5x108-2 x 108 celler/mL räcker för en sackaros gradient lastning.
- Snurra cellerna vid 1.800 x g och 4 ° C i 8 min. avlägsna supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten på is i 1 mL lyseringsbuffert innehållande proteashämmare och RNase inhibitor (20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1% NP-40, 1 x proteashämmare cocktail (EDTA-fria), 200 enheter/mL RNase inhibitor).
- Passera den lysate 23-gauge nål tre gånger. Den lysate bör bli transparent efter passage genom nålen.
- Centrifugera vid 11.200 x g och 4 ° C i ca 10 min att klargöra lysate. Överföra den klargj橬一j lysate till en fräsch röret och hålla det på is tills sackaros gradient ultracentrifugering.
- Samla 400-500 μL av den lysate som indata (för att analysera senare), fryser den direkt i flytande kväve för framtida proteinanalys eller Lägg till RNA rening reagens före frysning för RNA analys.
- Inokulera Leishmania stora (FV1 stam) celler i 30 mL 1 x M199 medium29 som innehåller 10% fetalt bovint Serum (FBS) och penicillin/streptomycin blandning (100 enheter och 100 μg/mL motsvarande)på täthet på 1 x 105 celler/mL .
-
Cytoplasmiska lysate beredning från odlade mänskliga HeLa celler
- Dela HeLa cells och utsäde dem i 20 mL DMEM mediet som innehåller 10% FBS och penicillin/streptomycin blandning (100 enheter och 100 μg/mL motsvarande) med cell räkna 2 x 105 celler/mL i en 15 cm platta.
- Växa HeLa cells vid 37 ° C, 5% CO2 för 20-24 h. utför plasmid DNA transfection enligt tillverkarens protokollen.
- Sprida celler för 24 h efter transfection vid 37 ° C, 5% CO2.
- Lägga till Kungliga Automobilklubben odlas HeLa cells till 100 μg/mL att arrestera ribosomerna på översatta mRNA och inkubera cellerna under 10 minuter vid 37 ° C, 5% CO2slutliga koncentration. Aspirera medium. Tvätta cellerna två gånger med kallt DPBS på is.
- Tillsätt 500 μL lyseringsbuffert (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 1 x proteashämmare cocktail (EDTA-fria), 200 enheter/mL av RNase inhibitor eller 1 mg/mL heparin) till plattan och skrapa cellerna på is.
- Överföra lyserat cellerna till mikrofugrör. Justera koncentrationen av NP-40 till 0,5% och MgCl2 till 5 mM enligt den ökade volymen av provet.
- Passera den lysate 23-gauge nål 3 - 6 gånger.
- Snurra på 11.200 x g och 4 ° C i 8 min att klargöra lysate. Efter centrifugering, överför supernatanten till en ny tub. Använda en spektrofotometer att utvärdera cell lysis effektivitet och bestämma provmängd för lastning på övertoningen. Tillsätt 10 μL av provet till 0,5 mL av 0,1% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Tomt mot 0,1% SDS. Mät absorbansen vid 260 nm. Förväntade absorbansvärde är runt 15-20 enheter/mL.
- Späd alla prover med lyseringsbuffert till samma absorptionsvärdet innan sackaros gradient centrifugering. Hålla prover på is tills sackaros gradient centrifugering.
-
Cytoplasmiska lysate beredning från mus testiklarna
- Dissekera mus testiklarna. Gör ett litet snitt i tunica albuginea och samla sädeskanalerna i testiklarna och överföra dem i en 15 mL koniska rör innehållande 5 mL DPBS kompletteras med 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF).
- Blanda vävnaden kraftigt genom att vända flera gånger. Att vävnaden sedimentera på enheten gravitation på is i 5 min.
- Avlägsna och kassera grumlig bufferten som innehåller bindväv celler och vävnad fragment. Upprepa proceduren 2-3 gånger. Den återstående vita pelleten är berikad för seminifera tubuli och könsceller.
- Överföra seminifera tubuli pelleten till en 2 mL mikrocentrifug rör och spinn på 500 x g för 1 min. avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 500 µL lyseringsbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 1 x proteashämmare cocktail (EDTA-fria), 1 mg/mL heparin eller 200 enheter/mL av RNase inhibitor) mot tubuli. Använd en pipett för att pulverisera vävnaden.
- Överför till en liten (0.5-1.0 mL) Dounce Homogenisatorer. Störa vävnaden med sju till åtta slag av glas mortelstöten.
- Överföra den lysate till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Centrifugera provet vid 12 000 x g och 4 ° C i 8 min att rensa den lysate. Överför supernatanten till en ny tub och lagra på is tills lastning på sackaros övertoningen.
- Samla 50 μl av den lysate som ingående prov, fryser den direkt vid-80 ° C för framtida proteinanalys; eller Lägg till RNA rening reagens före frysning för RNA analys.
2. sackaros Gradient förberedelse och ultracentrifugering
- Förbered två sackaros gradient lösningar (20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 x proteashämmare cocktail), som innehåller antingen 10% sackaros eller 50% sackaros. (Tris-HCl, pH 7,4, kan användas i stället för HEPES). Lägga till 200 enheter/mL RNase inhibitor eller 1 mg/mL heparin enligt experimentell design. Placera en ultracentrifugen röret för SW 41 rotor i blocket markör och rita en linje längs den övre nivån om blocket. Överföra röret i ett stabilt rack.
- Ta en 10 mL spruta med skiktning enheten ansluten och Fyll sprutan med 10% sackaroslösning (beredd enligt ovan). Försiktigt släppa den på botten av ultracentrifugen röret tills den når markeringen på röret.
- Fyll en annan spruta med 50% sackaroslösning och noggrant sätt dess skiktning enheten genom 10% sackaros lagret till botten av röret. Försiktigt släppa sackaroslösning nedifrån tills det når markeringen på röret. Förslut röret med det medföljande locket.
- För att förbereda toningen som sackaros, stänga av gradient maker enheten ON. Nivå på plattan med hjälp av upp eller ner knapparna och tryck på klar. Leveling är viktigt för linjäritet på toningen.
- Trycker GRAD öppna gradient menyn efter utjämning plattan. Gå till listan på menyn övertoning och välj SW 41 Ti rotorn. Välj sedan önskad sackaros övertoningen från listan på menyn med knapparna upp och ned . Tryck på användning.
- Placera hållaren lutning röret på gradient maker plattan. Överföra röret i hållaren. Upp till 6 övertoningar kan tillagas samtidigt. Tryck på Kör. Gradient maker roterar rören i programmerad hastighet och vinklar bildar en linjär övertoning. Det tar bara några minuter att förbereda övertoningen.
- När processen är klar, placera rören i ett rack. Ta korkarna bort. Ta bort samma volym som provvolymen från toppen av ultracentrifugen rören.
- Noggrant läsa 400-500 μL av lysat som innehåller 15-20 per260 enheter med polysomes på toppen. Placera rören i rotorn hinkar och balansera dem.
- Centrifugera vid 260 000 x g och 4 ° C i 2 h med SW 41 rotor.
3. polysome fraktionering och provtagning
Obs: Medan lysate preparat har vissa skillnader beroende på källan, gradient förberedelse och polysome fraktionering protokoll är densamma för alla typer av lysates.
- Efter slutförandet av ultracentrifugering, placera rotorn hinkar med rör på is. Slå bråk samlare och lutning naftafraktioneringskolonn ON. Klicka på Skanna på menyn naftafraktioneringskolonn. Sätta ett rack med 24 samling rör i bråkdel samlaren.
- Fyll upp en skölj reservoar på sidan av naftafraktioneringskolonn med avjoniserat vatten. Tryck på skölj för 10 s att skölja pumpen på naftafraktioneringskolonn. Bifoga en skölj adapter med sprutan fylld med vatten till kolv för kalibrering.
- Öppna naftafraktioneringskolonn-programvaran på datorn. Tryck på kalibrera. Använd standardinställningarna och tryck OK. Vara redo att injicera vatten från sprutan.
- Tryck OK för att göra kalibrering. Omedelbart börjar injicera vatten för nästa 5 s. Under denna tid vattnet kommer att flöda genom cellen UV detektor flöde och instrumentet kommer att kalibreras. Tecknet Noll kalibreringen slutförts visas. Instrumentet är klart för fraktionering.
- Ta bort skölj adaptern med sprutan. Bifoga ett tips till pistongen av naftafraktioneringskolonn.
- Öppna mässing luft ventilen och tryck luft nyckeln för 10 s till torra slangar och flöde cell. Stäng luftningsventilen.
- Försiktigt ta bort lutning röret från rotor hinken och placera den i hållaren. Applicera röret innehavaren locket till toppen av röret och försiktigt flytta röret till röret innehavaren och låses i position.
- Placera hållaren under pistongen av naftafraktioneringskolonn. Polysomal band kan ofta ses med ögat. Införa önskade inställningar för bråkdel antal och volym (24 fraktioner till 500 μL/bråkdel är vanligen tillräckligt). Filen namnet på lämpligt sätt. Tryck på OKoch sedan Gå till graf -knappen. I nästa fönster, tryck på Starta skanning. Inställningar visas, tryck på OK. Solfångaren kommer att flytta från rännstenen till den första fraktionen och kolven kommer flytta in i röret. När kolven når toppen av toningen det kommer sakta till den valda hastigheten och fraktioner insamlas. När färdig, flyttas kolven ur lutning röret.
- Öppna mässing luft ventilen och tryck luft nyckeln på den naftafraktioneringskolonn att hämta den senaste fraktionen.
- Flytta rören från rack på is.
- Lägg till 2 volymer RNA rening reagensmedel till varje fraktion och flash frysa i flytande kväve tills RNA rening. Alternativt om protein behöver analyseras, lägga till triklorättiksyra slutliga koncentration av 10% att koncentrera dem för Western blotting (se avsnitt 8).
4. beredning av syntetiska RNA In Vitro för normalisering av mRNA nivåer under RT-qPCR dataanalys
Obs: E. coli OmpA mRNA används i detta protokoll för normalisering. Några andra RNA som inte har omfattande identitet med mRNA studerade organismens (däggdjur eller Leishmania) kan användas.
- Förbereda den OmpA DNA-fragment som innehåller SP6 arrangören sekvens av en standard PCR-reaktion från en plasmid som innehåller OmpA gen30.
- Förbereda 100 µL av blandningen: 80 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 16 mM MgCl2, 2 mM Spermidine, 10 mM DTT, 3 mM ATP, 3 mM CTP, 3 mM UTP, 3 mM GTP, 0.5 U/μL RNase inhibitor, 1 μg OmpA PCR DNA, 3 μL SP6 RNA-polymeras , 0,005 U/μL pyrophosphatase.
- Inkubera vid 40 ° C under 2 h.
- Rena RNA genom ett RNA rening kit.
- Mäter koncentration av spektrofotometer och undersöka av agaros gelelektrofores.
5. RNA isolering från Gradient fraktioner och cDNA förberedelse
Obs: Fortsätt direkt med detta protokoll för RNA rening om en RNase inhibitor användes som en ribonukleasinhibitor. Dock när den används som en ribonukleasinhibitor, hämmar heparin omvänt transkriptas används cDNA beredning. Därför behövs ytterligare rening av RNA om heparin användes i lyseringsbuffert och lutning. Se avsnitt 6 inför cDNA syntes RNA om heparin användes.
- Tina de prover som innehåller RNA rening reagens, tillsätt 20 ng av syntetiska RNA som intern kontroll för normalisering av RT-qPCR resultat. Fortsätt med RNA beredning enligt tillverkarens protokollet utom en ändring. Tillsätt 1 µL av RNA grade glykogen (20 µg) tidigare isopropanol nederbörd. Lös upp RNA pellets i 20-25 µL RNase-gratis vatten.
Obs: Glykogen serverar som bärare och hjälper till att undvika förluster och visualisera RNA pellet under reningen. OmpA mRNA används för ytterligare normalisering i RT-qPCR reaktioner. - Mäta RNA-koncentrationen med spektrofotometer för att säkerställa tillräcklig avkastning. Kombinera lika stora volymer av RNA fraktioner som innehåller 40-, 60- och monosomes som prepolysomes. Fraktioner som innehåller 2-4 ribosomer kombinera som ljus polysomes och fraktioner med 5-8 ribosomer kombinera som tunga polysomes.
- Använd 5-10 µL av RNA från kombinerade fraktioner för att förbereda cDNAs med ett kit och följa tillverkarens rekommendationer.
- Tillsätt 80 µL nuclease gratis vatten i 20 µL av cDNA. Frysa cDNA proverna vid-20 ° C.
6. RNA rening från Heparin kontaminering
Obs: Heparin hämmar nukleinsyra bearbetning enzymer såsom omvänt transkriptas. Därför använda detta ytterligare rening protokoll när heparin används i lyseringsbuffert eller i övertoningen.
- Lägg till LiCl 1 M koncentration till de rena RNA-proverna.
- Blanda proverna och inkubera på is för 1 h.
- Snurra proverna vid 16 000 x g och 4 ° C under 15 minuter.
- Ta bort supernatanten så fullständig som möjligt med hjälp av en pipett.
- Lufttorka pellets i ca 5 min.
- Återsuspendering pellets i den ursprungliga volymen RNase-gratis vatten.
- Utföra spektrofotometrisk mätning vid 260 nm att bestämma koncentrationen av RNA. Vanligtvis, är förlusten av provet minimal.
7. RT-qPCR och dataanalys av mRNA Distribution
- Kombinera 10,2 μL av vatten, 20 μL av SYBR Green, 4,8 μL av genen specifika primers (2,5 μM varje set), 5 μL cDNA, blanda väl och fyll 10 μl per brunn i exemplar i plattan med 384 brunnar.
- Täckplatta med självhäftande film tätt och centrifugera plattan vid 1.800 x g i 5 min.
- Med en Real-Time PCR-instrumentet ställa in qPCR reaktion under förhållanden som anges i tabell 1.
- Använda cykel tröskeln (CT) beräkna värden och den jämförande CT (TΔΔC) metod31 procentandelen (%) av mRNA fördelning i prepolysomes, ljus och tunga polysomes som beskrivs32 med en ändring. Använda syntetiska RNA (här OmpA) för datanormalisering i RT-qPCR dataanalys. Syntetiska RNA ger en normalisering-kontroll som gör det möjligt att beräkna relativa mRNA nivåer och jämföra dem i olika fraktioner för en övertoning.
8. analys av proteiner i Polysomal fraktioner av Western Blotting
- Från en 100% (w/v) lager, lägga till triklorättiksyra (TCA) i de valda fraktionerna (500 μL) till en slutlig koncentration av 10%, hålla på is för minst 15 min, Centrifugera i en microfuge i 5 min, Kassera supernatanten, tvätta två gånger med iskall aceton och lös i 25 μL av S DS-sidan prov lastning buffert för elektrofores.
- Belastning på SDS-sidan och genomföra standard elektrofores med följande överföring till PVDF membranet. Gå vidare till Western blotting33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie, beskriver vi tillämpningen av polysomal profilering tekniken på tre olika källor: parasiter Leishmania stora, odlade mänskliga celler och mus testiklarna. Leishmania cellerna växer fritt i flytande media i suspension, odlade mänskliga celler växer i den vidhäftande enskiktslager på tallrikar och mus testiklarna representerar ett vävnadsprov. Metoden kan enkelt justeras till andra typer av fritt odlade celler i suspension, olika typer av vävnader, eller från en annan organism, och olika typer av odlade celler. Metoden består av fyra huvudsteg: lysate beredning, sackaros gradient förberedelse och ultracentrifugering steg, polysome fraktionering och provtagning följt av analys av fraktioner. Celler från olika källor samlas in, tvättas och lyserat i lyseringsbuffert av passage genom en nål eller Dounce Homogenisatorer. Centrifugering används för att ta bort cellfragment, klargöra den lysate. Systematiken i gradient fraktionering visas i figur 1A. En kontinuerlig sackaros gradient bildas av blandning av 10% och 50% sackaros lösningar i en gradient maker. Den lysate läses på toppen av övertoningen. Ultracentrifugering separerar mRNA som förknippas med olika antal ribosomer som övervakas av en UV-detektor under fraktionering, bildar ett distinkt absorbansen spektrum. Insamlade fraktioner används för analys av RNA och protein (figur 1B). RNA kan analyseras genom elektrofores följt av nordliga plumpen eller används för cDNA produktion följt av en RT-qPCR-reaktion för att analysera kopplingen mellan enskilda mRNA och polysomes. Nästa generations sekvensering kan användas för att analysera mRNA på en genome-wide skala7translationell status. För proteinanalys av polysomal fraktioner fälls proteiner med triklorättiksyra att koncentrera dem. Proteiner analyseras sedan av Western blotting eller massa spektroskopi på nivån proteomet.
En typisk polysomal profil genereras från Leishmania stora aktivt växande kultur visas i figur 2A. Absorbansen grafen av fraktioneringen har en distinkt form med typiska toppar för Ribosomen subenheter (40- och 60-talet), enda ribosomer (80S eller monosomes) och polysomes.
Kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR) var anställd för att upptäcka sammanslutning av enskilda Leishmania mRNA med ribosomer och polysomes. Den jämförande CT (TΔΔC)31 metoden är en enkel och lämplig metod att studera relativa mRNA nivåerna i cellerna. Denna metod kräver en intern kontroll (en stabil mRNA, som inte ändrar uttryck under behandlingar eller villkor för experimentet) för beräkningar. Dock finns det ingen intern kontroll i polysomal fraktioner eftersom nivåerna av mRNA eller ribosomalt RNA varierar i fraktioner, beroende på deras förening med ribosomer, polysomes, etc. För att lösa problemet med intern kontroll, har vi använt syntetiska bakteriell OmpA mRNA för normalisering av relativa enskilda Leishmania mRNA nivåer i fraktioner. OmpA mRNA var syntetiseras i vitro och läggas i lika mängder till respektive fraktion innan RNA extraktioner. Tillägg av syntetiska RNA är viktigt eftersom det gör beräkningar av RT-qPCR data mer exakt, som fungerar som intern kontroll för beräkningar av jämförande CT (TΔΔC) metod.
Alikvoter av gradient fraktioner blandades in i tre grupper: prepolysomes (subenheter och monosomes), ljusa polysomes (bestående av 2-4 ribosomer) och tunga polysomes (bestående av 5-8 ribosomer). RT-qPCR utfördes på RNA från kombinerade fraktioner att analysera mRNA fördelning mellan dessa kombinerade fraktioner (figur 2B). 18s ribosomal RNA användes som kontroll. Dess relativa nivåer bestäms av RT-qPCR korrelerade väl med uppskattade fördelningen av små ribosomal subunitsna (gratis subenhet, och som en del av monosomes och polysomes) på spektrumet. RT-qPCR-analys visade att enskilda mRNA testade har olika grad av engagemang i översättning under logaritmiska fas av Leishmania tillväxt. Tubulin mRNA associeras företrädesvis med tunga polysomes, föreslå effektiva översättning. Däremot Sherpa mRNA hittas främst med prepolysomes och ljus polysomes stöd mindre aktiva översättning i jämförelse med tubulin mRNA.
Uttryck av rekombinanta proteiner i odlade celler är ett viktigt experimentella förhållningssätt i olika kategorier av studier. Här presenterar vi ett exempel på polysomal profilering av rekombinant protein mRNA i en annan provkällan, odlade mänskliga celler. HeLa celler var övergående transfekterade med plasmider uttrycka rekombinant cystisk fibros transmembrane conductance regulator (CFTR)34 eller Norrie sjukdom protein (NDP). Absorbansen spektra av polysome fraktionering från dessa två oberoende kulturer var mycket liknande och innehöll distinkta toppar motsvarande ribosomal subenheter (40- och 60-talet), monosomes (80) och polysomes (figur 3A). Likheten i spektra från dessa experiment illustrerar reproducerbarhet av den lutning fraktioneringen. Som i studierna av Leishmania bestämdes fördelningen av mRNA av RT-qPCR i de fraktioner som representerar prepolysomes, lätta polysomes och tunga polysomes (figur 3B). Detektering av små ribosomal subuniten 18S RNA korrelerade med deras uppskattade distribution i spektra. NDP mRNA var mestadels associerade med lätta och tunga polysomal fraktioner, medan CFTR mRNA hittades oftast i prepolysome fraktioner, vilket tyder på att NDP översätts mer effektivt. NDP är ett relativt litet protein, är CFTR ett stort protein (1480 aminosyra rester) bestående från flera domäner, som vik självständigt under översättning35. Lägre kopplingarna av CFTR mRNA med polysomes kan avspegla långsammare översättning som krävs för cotranslational vikning av dess distinkta domäner.
Polysome fraktioner kan också användas för påvisande av proteiner. Påvisande av proteiner i gradient fraktioner genomfördes på exempel på ribosomala proteiner i HeLa cells (figur 4). Proteiner koncentrerades genom utfällning med 10% TCA från fraktioner och Western blot användes för att upptäcka liten subunit ribosomal protein RPS6 och stora subunit ribosomal proteinet RPL11 (figur 4, övre panelen). Deras fördelning korrelerade väl med distinkta toppar på absorbansen spektrumet. Dessa experiment visar tydligt att de polysome fraktionerna kan användas för att analysera proteiner i dem.
Många olika sackaros koncentrationer gradienter (till exempel 7-47%36, 5-50%7, 7-50%6 , 10-50%37, 15-50%8och andra) för polysomes fraktionering användes. Här, jämförde vi två lutningar 10-50% och 17-51% (figur 5). Även om, 17-51% producerat godtagbara resultat, var avskiljandet i 10-50% övertoningen övergripande bättre.
Det är väl dokumenterat att kelatbildare, som EDTA, störa ribosomer och polysomes8,9. Som det visas i figur 6, EDTA behandling av HeLa lysate innan lastning på övertoningen leder till försvinnandet av topparna, motsvarande monosomes och polysomes, och betydande ökning av Ribosomen subunitsna toppar. Detta experiment fungerade som en kontroll och visade att de observerade topparna utan EDTA behandling är faktiskt ribosomal monosomes och polysomes.
Figur 7 visar resultaten av polysome fraktionering från mus testiklarna. Absorbansen spektrumet har likheter med de från Leishmania och HeLa celler: distinkta toppar ribosomal subenheter, monosomes och polysomes. Deras form och distribution producera en signaturutseende, som gör det enkelt att identifiera dem på olika polysomal spectra. Totala RNAs var renas från fraktioner och RNAs från valda fraktioner analyserades av elektrofores i agarosgel (figur 7, övre panelen). Elektrofores visar typisk fördelning av 18S och 28S ribosomalt RNA. Sin vassa band indikerar orördhet av proverna. Gelen kan användas för enskilda mRNA upptäckt av en följande norra blot eller det kan användas för att utvärdera kvaliteten på proverna innan ytterligare experiment på RNA- eller protein analys - diffust ribosomalt RNASEN band indikerar RNA nedbrytning i proven.
Under våra studier använde vi RNase inhibitor och Heparin som RNase-hämmare i lysates och sackaros Övertoningarna. Medan dem båda gav tillfredsställande resultat, var användning av RNase inhibitor att föredra för RNA analys eftersom det inte hämmar de cDNA och RT-qPCR reaktioner. Sålunda, det inte kräver ytterligare RNA reningssteg. Om forskare väljer att använda heparin under polysome beredning, dock medveten om att heparin hämmar nedströms tillämpningar såsom RT-qPCR och ytterligare RNA reningssteg behövs (se protokollet avsnitt 6).
Figur 1 . Polysome profilering. (A) systemet av gradient beredning, polysome fraktionering och absorbansen profil. (B) system av bråkdel analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Polysome profil analys av Leishmania stora kultur i logaritmisk skede av tillväxt. (A) Cytoplasmic lysate var fractionated i 10-50% sackaros lutning. (B) relativ fördelning av 18S RNA, tubulin och Sherpa mRNA (%) i prepolysomes, lätta och tunga polysomes log celler analyseras av RT-qPCR. Fraktioner som innehåller 40S, kombinerades 60S och monosomes som prepolysomes. Fraktioner med 2-4 ribosomer kombinerades som ljus polysomes, medan fraktioner med 5-8 ribosomerna bildas tunga polysomes. Syntetiska E. coli OmpA mRNA läggas till bråk tidigare RNA-extraktion som tjänstgjorde som en normalisering kontroll i RT-qPCR. Jämförande CT (TΔΔC)31 metod användes för beräkning av mRNA nivåer. Felstaplar representera standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Polysome fraktionering och analys av rekombinant CFTR och NDP mRNA förening med ribosomer i HeLa cells transfekterade med plasmid DNAs. (A) Polysomal profil i HeLa cells transfekterade med CFTR och NDP plasmider. 10% - 50% sackaros övertoningen tillämpades för att uppnå separation av polysomes. Toppar för små (40S) och stor (60S) subenheter, samt monosome (80) indikeras. Fraktioner var kombinerat som visas på sidopanelen A och används för ytterligare analys. (B) fördelningen av mRNA CFTR och NDP i olika fraktioner. Påvisande av 18S av RT-qPCR användes som en kontroll för polysome fraktionering. RNA-nivåer utvärderades av RT-qPCR-analys. Data var normaliserade använder syntetiska mRNA. Jämförande CT (TΔΔC)31 metod användes för beräkning av mRNA nivåer. Felstaplar representera standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Påvisande av ribosomala proteiner i HeLa polysomal fraktioner. Hela cell lysate utsattes av 10% - 50% sackaros gradient centrifugering. Proteiner i valda bråk var fälls ut med TCA och analyseras av elektrofores hos 12% SDS-PAGE med följande Western blotting använder mus monoklonal RPS6 och kanin polyklonala RPL11 antikropp som primära antikroppar och Peroxidase-Conjugated get anti-mus eller anti-kanin sekundära antikroppar. Visualisering av signaler utfördes av SuperSignal West Pico PLUS Kemiluminiscens substrat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Jämförelse av HeLa polysomal profilering i 10-50% (svart) eller 17% - 51% (grå) sackaros övertoningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Effekten av EDTA behandling på polysomal profil i HeLa cells. Hela cell lysate behandlades med 10 mM EDTA på is för 10 min omedelbart före sackaros gradient centrifugering. MgCl2 ersattes av 5 mM EDTA i sackaros gradient lösningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 . Polysomal profil från mus testiklarna vävnad lysate. Fraktioner utsattes för RNA-extraktion med en RNA rening reagens och analyseras av elektrofores i 1% agarosgel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Skede | Steg | Villkor |
| Håll | Steg 1 | Öka temperaturen från 25 till 50° C med 1,6 ° C/s |
| Inkubera vid 50° C under 2:00 min | ||
| Steg 2 | Öka temperaturen från 50 till 95° C med 1,6 ° C/s | |
| Inkubera vid 95° C under 10:00 min | ||
| PCR | Steg 1 | Inkubera vid 95° C 00:15 min |
| Steg 2 | Sänka temperaturen från 95 till 60° C med 1,6 ° C / | |
| Inkubera vid 60° C för 1:00 min | ||
| Antal cykler 40 | ||
| Smälta kurva | Steg 1 | Öka temperaturen från 60 till 95° C med 1,6 ° C/s |
| Steg 2 | Sänka temperaturen från 95 till 60° C med 1,6 ° C/s | |
| Inkubera vid 60° C för 1:00 min | ||
| Steg 3 (dissociation) | Öka temperaturen från 60 till 95° C med 0,05 ° C/s | |
| Inkubera vid 95° C 00:15 min | ||
Tabell 1. Villkor för RT-qPCR
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polysome fraktionering av sackaros lutning i kombination med RNA och proteinanalys av fraktioner är en kraftfull metod att analysera translationell status för enskilda mRNA eller hela translatome samt roller protein faktorer reglerar translationell maskiner som under normala fysiologiska eller sjukdom tillstånd. Polysomal profilering är en särskilt lämplig teknik för att studera translationell förordning i organismer såsom trypanosomatids inklusive Leishmania där transkriptionell kontroll är i stort sett frånvarande och genreglering uttryck sker oftast under översättning.
Här beskriver vi ett protokoll för fraktionering av polysome som används på tre modeller: Leishmania parasiter, odlade mänskliga celler och mus vävnader. Polysome fraktionering steget är väsentligen den samma för olika organismer som används i denna studie; lysate beredning har dock vissa skillnader. Leishmania celler växer i flytande kultur och samlas in genom centrifugering och celler räknas före Lys att säkerställa lika belastning på övertoningen. Mänskliga celler kan tvättas och lyserat direkt på plattan. Lika lastning styrs av optisk densitet. Mus vävnader kräver en Dounce Homogenisatorer för effektiv Lys medan det i Leishmania och mänskliga celler, är det tillräckligt att passera dem genom den 23-gauge kanylen.
Alla reagenser som används bör vara RNase och proteas gratis. Vi jämförde heparin och RNase inhibitor som hämmare av RNase aktivitet i den cytoplasmiska lysates. Vi hittade att båda reagenser effektivt kan blockera RNase. Dock påverkar heparin nedströms tillämpningar såsom cDNA förberedelse och RT-qPCR. Som ett resultat, kräver beredning av RNA en ytterligare reningssteg när heparin används. Enligt vår åsikt den RNase inhibitor är bekvämare val och kan användas effektivt i polysome profilering protokoll.
Polysomal profilering är arbetsintensivt, vilket är en stor begränsning för metoden. Upp till sex övertoningar kan tillagas samtidigt. Den lutning naftafraktioneringskolonn genererar 144 fraktioner som behöver bearbetas i en kort tidsperiod. Analys av enskilda fraktioner kan vara tidskrävande och dyrt också. Därför att kombinera enskilda fraktioner till pre-polysomes, lätta och tunga polysomes ger en snabb och mindre mödosamma sätt att uppskatta translationell aktiviteten av enskilda mRNA. Våra RTqPCR resultat på de kombinerade fraktionerna tillät oss att identifiera skillnader i översättbarhet av olika mRNA både Leishmania och HeLa cells (figurerna 2, 3). Dock om finare upplösning behövs, kan sedan analys av enskilda fraktioner utföras.
Ribosomen profilering är en annan metod att studera translationell status av mRNA och är baserad på mätning av proteinproduktion via sekvensering mRNA fragment skyddas av Ribosomen38. Denna teknik ger kvantitativ information associera mRNA sekvenser med specifika polysomal fraktioner översätts i ett prov, och kan ge exakt information om mRNA vid kodon upplösning i jämförelse med translationell status polysome profilering teknik. Dock polysome profilering kan användas för både RNA och protein analys, vilket ger ytterligare information om proteomet av polysomes och identifiera faktorer som bidrar till regleringen av översättning.
Därför är polysomal profilering en mångsidig teknik som kan användas för att analysera translationell delstaten enskilda mRNA, undersöka Ribosomen-associerade proteiner och studera translationell förordning i olika modellorganismer under olika experimentella villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Ching Lee för hjälp med ljudinspelning. Forskningen stöddes av de nystartade fonderna från Texas Tech University Health Sciences Center och av Center of Excellence för translationell neurovetenskap och Therapeutics (CTNT) bevilja PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; delvis genom NIH grant R01AI099380 K.Z. James C. Huffman och Kristen R. Baca var CISER (centrum för Integration av STEM utbildning & forskning) akademiker och stöddes av programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments: | |||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 | |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 | |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 | |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 | |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV | |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 | |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 | |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 | |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 | |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B | |
| Software | |||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | ||
| Materials: | |||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 | |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 | |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 | |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 | |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 | |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Chemicals: | |||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G | |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 | |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 | |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| Water | Sigma | W4502-1L | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 | |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML | |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G | |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 | |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 | |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L | |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G | |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 | |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 | |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL | |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG | |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG | |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S | |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN | |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
References
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
- Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
- Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
- Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
- Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
- Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
- Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
- Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
- Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
- De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A.
- Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
- De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
- Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
- McNicoll, F., et al. Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
- Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
- Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
- Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
