Summary
複雑な人間の病気に貢献する遺伝的変異の同定機構を識別することができます。ここでは、候補者の遺伝子または遺伝子パスウェイ解析低コストでカバレッジを最大化、コホートに基づく研究に従う方法多重遺伝子型を示します。
Abstract
複雑な病気の多くの場合疾患感受性に貢献する複数の一般的な遺伝子変異によって支えられています。ここでは、ジェノタイピング マルチプレックス アッセイ質量分析法を用いた臨床コホートで遺伝子経路の連合を調査するコスト効果の高いタグ単一ヌクレオチド多型 (SNP) アプローチについて述べる。例として食品アレルギー候補遺伝子座Interleukin13 (IL13) を調べた。このメソッドは、領域内の共有連鎖不平衡 (LD) を利用して効率的にカバレッジを最大化します。選択した LD SNPs、設計されています多重アッセイに同時に分析するまで 40 の異なる Snp の有効化費用対効果を高めます。ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) は単一のヌクレオチドの拡張子、ターゲット遺伝子を増幅するため使用され、amplicons マトリックス支援レーザー脱離/イオン化-時間 flight(MALDI-TOF) 質量分析装置を使用して測定されます。Raw 出力を厳格な品質管理の定義と切り取りトレードオフを使用してソフトウェアを呼び出す遺伝子で解析、確率が高い遺伝子型の決定しデータ分析のための出力します。
Introduction
人間の複雑な疾患の遺伝的変異が疾患感受性に貢献、これらの亜種の定量化は理解病因、治療レスポンダーの高リスク患者のグループを識別するために有用かもしれない。確かに、精密医療の約束は患者サブグループ1を識別するためにゲノム情報を利用したに依存しています。残念ながら、どこ疾患表現型の相当な遺伝的多様性、低浸透度と変数表現力によって支えられている、複雑な病気の生物学領域内コホート サイズ ゲノム全体小説的なアプローチのための要件候補者は、しばしば膨大2です。また、標的候補遺伝子アプローチから始まる疾患病因3に固有の遺伝子/経路について事前の仮説。経路解析ツールは、探検するために多数の候補経路を生成する標的遺伝子座の病態生理学を調査するため使用されます。ここで人間のコホート研究4に適した 1 つの試金と Snp の数百人に数十の調査を可能にする多重遺伝子型アプローチを紹介します。このアプローチは比較的高スループット、数百、数千の新規探索研究誘因する DNA サンプルや特定経路の調査を許可します。ここで説明する方法は、比較的迅速かつ安価な方法で識別リスク対立遺伝子および臨床特徴との関連付けに役立ちます。このプラットフォームは、微生物感染症7ひと乳頭腫ウイルス8スクリーニングおよび診断目的5,6と最近では非常に有利にされています。
調査の結果、すなわち遺伝子のセットを選択から始まるこのプロトコル、文献検索、または病気プロセスに関与の先験的な仮説によって通常決定対象地域。または、おそらく選択した探索ゲノム広い連合 (GWA) 研究の主要な団体としてレプリケーション。遺伝子セットから研究者はタグ SNPs の洗練されたリストを選択します。つまり、連鎖不平衡 (LD)、または地域での亜種間で相関が高い LD、ハプロタイプと呼ばれる中の Snp のグループの代表的な 'タグを SNP を識別するために使用されます。地域の高い LD 継承を意味します、SNPs がしばしば一緒に遺伝子型 1 つの SNP がハプロタイプですべての Snp で変化を表すために十分になるよう。また、フォロー アップ SNPs の決定的なリストから多くの地域、例えば場合。、GWA 研究のレプリケーションでは、このプロセス必要がありますされません。多重遺伝子型は増幅プライマー拡張プライマーの質量が異なるは、解釈を生成する製品の質量スペクトル、アッセイは、これらのターゲットの周り設計されなければなりません。これらのパラメーターは、多重遺伝子型分析設計ツールによって簡単に実装されます。このデザインから前方および逆のプライマーは、SNP を含むシーケンスを増幅して興味のマーカーをターゲットに使用されます。拡張プライマーを直接 SNPs に近位付 SNP に補足である単一、大量更新、'ターミネーター' ベースが追加されます。ターミネーター ベース DNA の拡張をできなくなります。ベースの質量の変更により、質量分析による検出を 1 つのベースが異なるフラグメント。ジェノタイピング化学を含むプレート質量分析プラットフォームに測定用チップに適用されます。適切な品質管理をシステムによって検出された生ジェノタイピング呼び出しに適用すると、データをエクスポートし、疾患表現型との関連付けをテストするのには統計分析に使用できます。
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Protocol
ここで使用される遺伝物質倫理的によって承認された使用するためオフィス子供 HREC (人間研究倫理委員会) (CDF/07/492)、人間サービス HREC 部の (10/07) と王立子供病院 (RCH) HREC (27047)。
1. 設計多重アッセイ
- 試金のデザインの SNP リストを準備します。
- Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads) のタガー機能にターゲット領域を入力します。必要なバリエーションの数が少ない目的の地域の完全なカバレッジを提供する SNPs のリストを生成するターゲット地域にまたがる SNPs 間 LD (相関, r2) を使用します。など、キャプチャするすべての対立遺伝子がユーザー定義のしきい値を超える関連 SNPs のリストを生成 (e.g。、r2 ≥0.8)。
- フォワード、リバース、および拡張子のプライマーに適したシーケンスの同定
- 選択の分析設計ツールに SNPs の生成するリストを入力します。
注: 次の手順は、材料のテーブルで指定されている、代表的な結果を生成するために使用アッセイ デザイン ツールに適用されます。 - 分析設計ツールを起動すると、新しい遺伝子型のデザインを選択します。デザインの名前フィールドに試金のデザインの名前を入力します。
- テキスト入力の編集と分類、指示rs または FASTAボタンの左側にボタンをクリックしてステップ 1.1.1 で生成された SNP リストを提供します。
注: SNPs (rs) SNP Id の参照のテキスト リストとして入力したり FASTA 形式でアップロードや SNP グループ ファイル形式が、ツールによって使用されます。これらの形式でファイルをアップロードするには、ファイルをアップロードボタンを選択します。'よく' と呼ばれる単一のアッセイにデザインできるバリエーションの上限は 40 Snp です。実行を開始する前に、設計の優先順位は、SNPs を指定することが可能です。これらは最初にデザインされます。コントロールの SNPs を指定できます: たとえば、サンプル ミックス アップまたは十分なテンプレートを決定するコントロールの場合性別を検出するアッセイを追加しました低や貧しい品質の DNA を使用して場合。ただし、制御および優先順位の SNPs を使用してシングルにもデザインできる Snp の数を減らすことができます。 - プリセットメニューからプリセットの iPLEX の高多重化オプションを選択します。生物メニューから誘因する DNA の派生元である生物を選択します。代表的な結果をここに提示、これは人間だった。
注: ツールと互換性がまたマウスとウシの生物です。1 つ選択もできますその他植物や微生物のような代替生物での作業ただし、近位 SNPs と最適なプライマー領域を検索するための自動化された手順で参照ゲノムの不在のためことはできません。 - [データベース] メニューで、ゲノムの最新のビルドまたは化学メニューから必要な場合は、別のビルドを選択します。IPLEXを選択し、多重レベルフィールドの多重の最高レベルを入力: 40。今、実行開始を選択します。「ステップ 1」のツールを開始します。
注: ステップ 1 の間にツールが取得し、SNP の系列の書式を設定します。ここでは、エラーは FASTA ファイル場合は FASTA ファイルをチェック、必要に応じて再フォーマットの書式などがあります。別のエラーは、SNP データベース NCBI の dbSNP 新しい SNP rs 番号を識別するなどの場合 rs 番号を検索する必要があります別の rs 数にマージされている SNP rs 番号です。SNP 周辺はプライマー デザインを妨げるすべての知られている近位 SNPs が検索されます。潜在的な PCR プライマー サイトは、ゲノムの多重衝突のための非特異的増幅を避けるためにゲノムと比較されます。 - 近位の SNPs を識別するデザイン ツールの「ステップ 2」の完了を待っています。
注: この手順によってサポートされていない生物を使用している場合は、この情報が利用可能な場合 IUPAC の注釈で近位の SNPs とシーケンスを注釈します。この手順中にエラーがほとんどただし、誤った参照、生物やゲノムを選択した場合、または cDNA 配列は DNA ではなく入力された場合、エラーが発生します。[詳細設定]のステップ 2 を最適化するために特定の人口の内で働く場合、人口に基づく Snp をフィルターで除外することが可能です。まれな SNPs は、1% 以下の周波数を持つものを除くによっても除外できます。最後に、検証済み状態がないか、人口情報を持っていない SNPs は、必要な場合は除外することも。 - 「ステップ 3」最適なプライマーを識別するデザイン ツールの領域の完了を待っています。大文字で最寄りのプライマー領域と下のシーケンスの残りの部分が入力シーケンス (SNP のグループ ファイル) に注釈を付けるプライマー場所が手動で入力優先するプライマーの場所を特定したら、異なる生物での作業する場合や、場合に、選択を保持する場合このステップの [詳細設定] メニューから。
注: 手順 2 と 3 のエラーがあります: (1) A 近位 SNP 非テンプレート ベースでマスクと Isonine のような普遍的な基盤を持つオリゴを注文または、それぞれのプロキシムの対立遺伝子の 2 つのプライマーを設計されているソリューションとプライマーの設計をブロックアル SNP または、共通の対立遺伝子だけを持つ 1 つのプライマーをデザインします。(2) もう一つの一般的なエラーは、一意のサイトを識別するために私アンプリコンの長さを変更するのにはされているソリューションとプライマーのユニークなサイトを識別するために失敗です。このドキュメントで使用するツールでデフォルトは 80-120 bp です。これを 60 400 bp 増幅長の設定は"3 [高度な設定ダイアログから変更できます.最適なプライマー領域を識別する"と"4私アンプリコンタブの下にも。デザインの試金」両方が変更されたことを確認します。ただし、DNA を低下を使用してとき、私アンプリコンの長さを増やすことは推奨されません。 - アッセイの設計手順 (「ステップ 4」デザインのツール) の完了を待っていますここでツール拡張プライマーと多重化のデザインですべての Snp の対立遺伝子間の最適なパス分離を提供すること目的とします。この手順が完了したら、簡単に最適なベンダーを注文、オリゴをご注文フォーマット オリゴ注文ファイルをエクスポートします。
注: 増幅プライマー (前方 (F) やリバース (R))、最適な増幅サイズ 80 に 120 を生成する設計されています bp。増幅プライマー拡張プライマーと PCR パフォーマンスを全体的な質量スペクトルで競合する結果を避けるためにその製品の質量が異なる必要があります。拡張プライマーは、15 に 30 ヌクレオチドが長い (4,500 9,000 Da) の時に 3' 末端が多態性のサイトに直接隣接して接続できるように設計をする必要があります。これらの設定は自動的に代表的な結果を生成するためのツールで設定されます。
- 選択の分析設計ツールに SNPs の生成するリストを入力します。
- オリゴマー プロバイダーから選択したツールと順序プライマーからデザインをエクスポート: 各 PCR のプライマー (前方および後方) の 25 nmol と拡張プライマーのそれぞれの 100 nmol。代表的な結果を生成するために使用されるプライマーの表 1を参照してください。
2. 遺伝子型 (1-2 日)
- 増幅プライマーを準備します。
- 凍結乾燥のプライマーが命じられた場合を分子グレード水で再構築します。前方および逆のプライマーとの拡張子は 500 μ/μ L に 100 μ/μ L の濃度を使用します。
- 株式入門に各多重アッセイ用プール前方 & 逆プライマー ミックス、0.5 mM の濃度で各プライマーを含みます。
注: たとえば、400 の反応のために 400 μ L プライマー プール。
各プライマーは、100 μ M/μ L の濃度で 2 μ L は在庫プライマー プールに必要です。60 の前方および逆プライマー 30 プレックス アッセイ、プライマーの 120 μ L の合計だろう (集中プライマー プール) が必要があります。280 μ L グレード分子水を混合プライマーの 400 μ L の最終巻を作るに追加されますでしょう。
- ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) による増幅
- 100 を含む PCR 用マスター ミックスを作るプライマー ミックスの nM 上記、MgCl2、2 mM の dNTPs の 500 μ M と 0.5 U DNA ポリメラーゼ酵素。1 U 26 プレックス試金以上の場合に必要です。表 2を参照してください。
- 5-10 ng/μ L の濃度でゲノム DNA の 1 μ L と一緒に、384 ウェル PCR プレートの各ウェルにこのミックスの 4 μ L を追加します。
注: 品質管理が非テンプレート コントロールなどは以前 (中にテストの実行) アッセイでよく行われて肯定的な制御のプレートにも含まれます。複数の DNA サンプルから他のプレートは、例えば複数の板を実行している場合。、千九百六十八でプレート間の可変性を技術的な制御、実行する必要があります。 - プレート カバー プレートのウェルの底にすべての液体が含まれていることを確認する場所に室温で 1 分 200 x g でプレートを遠心します。
- 次のたちの条件で PCR を実行: DNA のポリメラーゼをアクティブに 94 ° C で 4 分インキュベーション次の 45 サイクル (変性 94 ° c 20 s、30 s、および拡張子は 72 ° C 1 分で 56 ° C で熱処理) と 72 ° C、3 分参照表 3に PCR プログラムで、最後の拡張。
- アガロース電気泳動 DNA 増幅が成功したことを確認するを実行します。アガロース粉末および 0.5 %tris ホウ酸 EDTA (TBE) バッファーを混合することによって作られた 2% (w/v) agarose のゲルに 1 μ L (読み込みバッファーの 3 μ L) で PCR の製品を使用して 100 V で 45 分間実行します。
- エビのアルカリホスファターゼ (SAP) の精製ステップ
注: この手順は、非法人のヌクレオチドを削除する使用されます。SAP の酵素は、余分なプライマーおよび非法人の dNTPs が今後拡張反応に干渉するを防ぐためにリン酸基を裂きます。- エビ アルカリ性ホスファターゼ (SAP) 酵素の 1.7 単位/μ L、10 x SAP バッファーを含むミックスし、水分子グレードでボリュームを構成するマスターを確認します。表 4を参照してください。
- 2 追加の SAP をたて μ L マスターすでに PCR の反作用から 5 μ L を含むプレートの各ウェルにミックス。遠心分離機の簡潔にしたち 40 分の 37 ° C で、その後酵素不活性化のため 5 分間 85 ° C に戻ります。表 5を参照してください。
- プライマー拡張反応
注意: 拡張プライマー ミックス拡張プライマー濃度は、(線形プライマー調整-LPA) のサイズによって調整する必要があります。(質量スペクトル) のピーク強度と製品に反比例の関係があるのでこれは大量。拡張プライマー濃度の調整は、等しい強度のピークを生成するこの関係を修正します。テーブル 6 & 7の代表の結果の生成に使用するプライマーを調整します。提供されているボリュームは、拡張プライマー ミックス 1.5 mL を発生することです。- アゲナ バイオ サイエンス (「線形プライマー調整」)、質量と、プライマーおよび多重反応 (を参照してくださいのプライマーの合計数濃度を調整するから利用可能な勾配アルゴリズムを使用して各プライマーの希釈倍率を計算します。テーブル 6 & 7)。各プライマーの線形プライマー調整シートの UEP_MASS フィールドに UEP の質量を入力します。
注: プライマーの質量調整濃度が自動的に計算するセルにヘッダー テキスト「ターゲット反応濃度 (μ m)」でプライマー プライマー プールに追加する量をヘッダー テキスト」(μ L) をプールに追加するボリューム株式入門」の下のセルに出力されます。計算される濃度を補うためプライマー プールに追加する水の量はテキストの横のセルに"PCR グレード RNase フリー H2O のボリュームを追加された出力プライマー プール (μ L)" - 線形のプライマー調整ファイルに指定された各プライマーのボリュームを取るし、プライマーのプールを構成します。2.4.1 の手順で決定されたプライマー プールを希釈するアルゴリズムで算出された水の量を追加します。
注: 勾配法が使用できない別の方法は低質量と高質量にプライマーを分割し、低質量グループに対して相対的な高質量プライマー濃度 2 倍を追加は。3 つまたは 4 つのグループ高プレックスの試金のため必要があります (つまり、以上 19 SNPs)。ただし、このメソッドは、グラデーション法として最適な通話料金としては得られません。 - テンション マスター ミックスを組み立てます。(1-18 プレックス) [低プレックス試金のためバッファーの 0.2 μ L、終了組合せの 0.1 μ L、LPA 調整プライマー ミックスの 0.94 μ L と 0.0205 μ L の酵素 (氷の上準備) を追加します。高プレックス アッセイ (19-36 プレックス)、終了ミックスと酵素 (終了ミックス 0.2 μ L と iPLEX 酵素 0.041 μ L) のダブルの濃度を追加します。表 8を参照してください。
- 今 9 μ L/ウェルに総量をもたらす以前の反応から拡張反応のマスター ミックスの 2 μ L をプレートに追加します。簡単に遠心し、たちの配置: 94 ° C、30 秒最初の孵化、5 の 1 x 94 ° C の 40 のサイクル 5 x と s (52 ° C、5 s、5 の 80 ° C に続いて s) と、72 ° C、3 分の表 9を参照してください。
- アゲナ バイオ サイエンス (「線形プライマー調整」)、質量と、プライマーおよび多重反応 (を参照してくださいのプライマーの合計数濃度を調整するから利用可能な勾配アルゴリズムを使用して各プライマーの希釈倍率を計算します。テーブル 6 & 7)。各プライマーの線形プライマー調整シートの UEP_MASS フィールドに UEP の質量を入力します。
- 樹脂精製。
注: 余分な塩は、使用樹脂の反応から今削除できます。- 16 μ L の脱イオン水を 25 μ L までプレートにボリュームをもたらす取得したプレートの井戸に追加します。
- 樹脂、6 mg の通常全体の板に均等にディンプル樹脂板 (別売) を適用します。室温で 20 分間樹脂ディンプル プレートに反板に適用する前に乾燥する樹脂を残します。手でまたは懸濁液ミキサー低速で回転部屋の温度で 5 分間プレートを樹脂の付加の後で (e.g。、7.5 rpm)。
注: 遺伝子型チップに遺伝子型試料をロードする前にサンプルとアッセイ レイアウトする必要があります入力するソフトウェア インターフェイスに。これは、アッセイ デザイン ツールから設計のまとめファイルを使用して実現できます。
- 質量分析プラットフォームで測定。
- 樹脂の質量スペクトル チップへの適用を避けるために 5 分間 3,200 x g でプレートを遠心します。
- サンプルの板レイアウトを実行する前にシステムのソフトウェア インターフェイスにアップロードします。
注: 手順 2.6.3 は、訓練を受けた専門家のみ実行する必要があります。 - 調剤システムと遺伝子型チップにプレートからのジェノタイピング試料混合物を適用されます。次に、プラットフォームのソフトウェア インターフェイスの援助と解釈できる試料の混合物から質量スペクトルを生成する MALDI-TOF システムにチップを読み込みます。
注: 各 'パッドで、「質量スペクトル チップのジェノタイピング プレート単一井戸に対応する紫外光の短パルスを送ることで質量スペクトルが生成されます。このパルスは、脱離と試料のイオン化の結果します。これらは DNA をイオン分子は、速く移動軽いイオンより重いイオンから最初に、検出器に到達を分離する高電圧静電界による真空チューブの先頭に推進されます。これらの検体の飛行の「時間」は、そこから各 DNA 断片の質量を決定することができ、SNP であるヌクレオチド塩基を推論できるため、システムによって記録されます。
3. 遺伝子型データ
注: 品質管理とデータ解釈本の方法論の研究の焦点ではなくです。ただし、次にも触れます質量スペクトルの解釈。
- 手動検査と質量スペクトルの品質管理。
注: 生の質量スペクトルにシステムによって生成される、テーブルの資料に記載されているソフトウェアで解析。ガウス混合物クラスタ リング手法は、確率的ジェノタイピング通話をするこの出力に適用されます。- 解析ソフトウェアを開きます。Typer アナライザーを選択します。[ファイル] メニューからファイルから開放井戸し 2.6.3 の手順で生成されたスペクトル データを xml ファイルを選択します。チップ名実行が表示する必要がありますそれを選択し、384 ウェル プレートの「信号機」ペインが選択した SNPs 一覧が表示されますも。ここから、各 SNP の散布図のデータ ポイントを表示するクラスターのプロットを呼び出すを選択します。
注: 低強度 SNPs の 'なしの呼び出し' の結果を適用することをお勧めします。代表的な結果を得るのために使用するソフトウェアの厳格な品質管理はデフォルトよりも高い、5 のクラスタ リング大きさカットオフが示唆されました。この設定は、ポスト処理クラスターペインでパラメーターの下の大きさカットオフ フィールドで調整できます。クラスター分析を実行するには、[ツール] タブからAutoclusterを選択します。 - ポスト処理ウィンドウでデカルト プロットを調べることで遺伝子型コール手動検査を実行します。分析ウィンドウに SNP の関心と後処理クラスター ] タブをクリックを選択、遺伝子型クラスターとクラスターのプロットはサンプル Id と対応する SNP 遺伝子型を表示されます。
- 遺伝子型呼び出しクラスターを確認し、どれだけ個々 の呼び出しクラスター SNP のための他の呼び出しを評価します。ソフトウェア指導の各遺伝子型のプロットのいくつかの境界線を提供します。IL13 SNP (図 1) から遺伝子型の呼び出しクラスター プロットの例を参照してください。呼び出しは、別のコールをしっかりとクラスターは、明らかに、クラスターの外に座って、または非常に低強度がある場合は、右クリック、datapoint しNoを呼び出すそれを手動で設定変更を呼び出すを選択します。
- 下流解析の質の高い遺伝子型データを使用するには、SNPs と QC のしきい値、例えば90% 以下の通話料金で個人を除外します。呼び出しデータに適切な調整を行った後は、統計のアプリケーションのデータをエクスポートします。(テーブルの材料に上場) 代表的な結果を生成するために使用するソフトウェアでこれは [表示] メニューから名前を付けて保存を選択するプレート データ選択で達成されます。
- 解析ソフトウェアを開きます。Typer アナライザーを選択します。[ファイル] メニューからファイルから開放井戸し 2.6.3 の手順で生成されたスペクトル データを xml ファイルを選択します。チップ名実行が表示する必要がありますそれを選択し、384 ウェル プレートの「信号機」ペインが選択した SNPs 一覧が表示されますも。ここから、各 SNP の散布図のデータ ポイントを表示するクラスターのプロットを呼び出すを選択します。
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Representative Results
上記プロトコルを使用我々 は誤は食品アレルギーの場合とコントロール9のコホートにおける Th2 免疫遺伝子IL13の SNPs をタグ付け。関心領域内の遺伝的変異が食品アレルギー リスクを増加させるかどうかをテストするのには、祖先とその他の潜在的な共変量調整後のロジスティック回帰分析を行った。テーブル 109は、1 つのバリアント rs1295686 チャレンジで実績のある食物アレルギーに関連付けられていることを示し同じを使用してレプリケーション コホートにおけるこの協会多重遺伝子型アプローチを確認しました。2 つのコホートから結果のメタ分析は、FA (表 11)9 IL13の協会の強力な証拠を提供されています。我々 は遺伝子と推測、祖先有益な SNP マーカー パネルを使用して公開されたパネル10から適応における祖先の調整。同じを使用してパネルの多重データの我々 のアプローチの試金します。
関連付けられたバリアント、rs1295686 が以前喘息リスク遺伝子座11として識別され、その他アレルギー免疫学的パラメーター12、一般的なアレルギー疾患リスク遺伝子座があります示唆しているに関連付けられています。次のステップにさらなる研究、発現解析、クロマチン キャプチャ方法と物理的相互作用のマッピングなどを行い、地域のマッピングを高級になるとピンのハプロタイプ解析機能のバリアントをポイントし、特徴付ける、食物アレルギーと観測会の背後にある生物学。
図 1: IL13 SNP rs1295686 のデカルト クラスター プロットします。黄色のクラスターは、A 対立遺伝子、G の対立遺伝子のための青およびヘテロ接合体の呼び出しのための緑のホモ接合体遺伝子型の呼び出しを表します。ホモまたはヘテロ質量スペクトルのいずれかのクラスター化したいくつかの遺伝子型呼び出しが「ないコール」に設定されて
表 1: プライマー シーケンスIL13の代表的な結果を生成するために使用します。[名前] 列に SNP ID、井戸数が含まれています (前述のように、「も」数を指します多重アッセイの ID)、およびプライマー (前方の F R は逆、および拡張プライマーの UEP) の種類。次の列には、プライマーのシーケンス、プライマーと浄化型のサイズが含まれます。SPINK5と家系報知的なマーカー (目的) パネルが誘因の代表的な結果が発表されると、これらの結果は説明しませんが、同じアッセイを使用するに注意してください。_CEU と _CHB で終わる SNPs 目的 SNPs に北のヨーロッパ人のためユタ州から北京、中国人口 1000 ゲノム プロジェクトからのハンの中国語それぞれ参照します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
| マスター ミックス | 低プレックス (≤26 SNPs) | 高プレックス (> 26 SNP) | |||
| 試薬 | 濃度 5 μ L | × 1 | × 200 | × 1 | × 200 |
| (脱イオン) 水 | 1.9 | 380 | 1.8 | 360 | |
| バッファー | 1 × (2 mM MgCl2) | 0.5 | 100 | 0.5 | 100 |
| MgCl2 | 2 mM | 0.4 | 80 | 0.4 | 80 |
| dNTPs | 500 Μ M | 0.1 | 20 | 0.1 | 20 |
| プライマー ミックス * * | 100 nM | 1 | 200 * * | 1 | 200 * * |
| Taq のポリメラーゼ | 0.5 U/1 U | 0.1 | 20 | 0.2 | 40 |
| 合計 | 4 Μ L | 800 Μ L | 4 Μ L | 800 Μ L | |
| * 既に脱イオン H20 2.1.2 に示すとおりで希釈 | |||||
表 2: 試薬および濃度混合増幅 PCR プライマーを作る必要があります。400 (384 ウェル プレートをカバーするために十分な) が 1.5 μ 管に収まらないために個別のチューブでの 2 x 200 の凝らし、200 反応のマスター ミックス ボリュームが与えられます。多重アッセイ「まあ」26 SNPs がよく使用高プレックス ボリュームより大きい場合 26 SNPs は、以下が含まれている場合、低プレックスの下で指定したボリュームを使用ください。
| たちの条件 |
| 4 分 94 ° C |
| 45 サイクル (94 ° C 20 s、56 ° C 30 s, 72 ° C 1 分) |
| 72 ° C、3 分 |
| 4 ° C ホールド |
表 3: 増幅 PCR の条件をたち。
| マスター ミックス | × 1 | × 410 |
| (脱イオン) 水 | 1.53 | 627.3 |
| 10 × バッファー | 0.17 | 69.7 |
| SAP の酵素 (1.7 U/μ L) | 0.3 | 123 |
| 合計 | 2 Μ L | 820 Μ L |
表 4: 試薬および SAP の反作用のためのマスターの組合せのための集中します。マスター ミックス ボリュームは、ピペッティング エラーのマージンを持つ 384 ウェル プレートをカバーする 410 の反作用のために与えられています。
| たちの条件 |
| 40 分の 37 ° C |
| 85 ° C、5 分 |
| 4 ° C ホールド |
表 5: SAP 反応に必要なたち条件。
| # | 拡張プライマー | オリジナル ストック濃度 (μ M) | その他 | UEP_ 質量 | ターゲット反応濃度 (μ M) | EXT プライマー プール濃度 (μ M) | プール (μ L) を追加するボリューム株式入門 |
| 1 | rs36110_CHB | 500 | 4359.8 | 0.560 | 5.36 | 16.09 | |
| 2 | rs10488619_CHB | 500 | 4546 | 0.602 | 5.76 | 17.29 | |
| 3 | rs1986420_CEU | 500 | 4761.1 | 0.648 | 6.21 | 18.62 | |
| 4 | rs2934193_CEU | 500 | 4964.3 | ウェバー 0.690 | 6.61 | 19.82 | |
| 5 | rs4968382_CEU | 500 | 5047.3 | 0.707 | 6.77 | 20.30 | |
| 6 | rs1227647_CEU | 500 | 5136.4 | 0.724 | 6.93 | 20.80 | |
| 7 | rs1402851_CEU | 500 | 5338.5 | 0.763 | 7.30 | 21.91 | |
| 8 | rs4705054 | 500 | 5476.6 | 0.788 | 7.55 | 22.64 | |
| 9 | rs6928827 | 500 | 5678.7 | 0.824 | 7.89 | 23.68 | |
| 10 | rs9325072 | 500 | 5762.8 | 0.839 | 8.03 | 24.10 | |
| 11 | rs4841401_CHB | 500 | 5853.9 | 0.855 | 8.18 | 24.55 | |
| 12 | rs11098964_CHB | 500 | 6052.9 | 0.888 | 8.50 | 25.51 | |
| 13 | rs2416504_CHB | 500 | 6174 | 0.908 | 8.69 | 26.08 | |
| 14 | rs1860933 | 500 | 6264.1 | 0.923 | 8.83 | 26.50 | |
| 15 | rs2193595_CHB | 500 | 6391.2 | 0.943 | 9.03 | 27.08 | |
| 16 | rs1519260_CHB | 500 | 6469.2 | 0.955 | 9.14 | 27.43 | |
| 17 | rs11184898_CHB | 500 | 6588.3 | 0.973 となった | 9.32 | 27.95 | |
| 18 | rs679832_CEU | 500 | 6757.4 | 0.998 | 9.56 | 28.68 | |
| 19 | rs326626_CEU | 500 | 6765.4 | 1.000 | 9.57 | 28.71 | |
| 20 | rs1612904 | 500 | 6873.5 | 1.015 | 9.72 | 29.17 | |
| 21 | rs862942 | 500 | 6960.5 | 1.028 | 9.84 | 29.53 | |
| 22 | rs2486448_CHB | 500 | 7169.7 | 1.058 | 10.13 | 30.38 | |
| 23 | rs4824001_CEU | 500 | 7341.8 | 1.081 | 10.35 | 31.06 | |
| 24 | rs6552216_CEU | 500 | 7465.9 | 1.098 | 10.51 | 31.54 | |
| 25 | rs1488299_CHB | 500 | 7620 | 1.119 | 10.71 | 32.13 | |
| 26 | rs1347201_CHB | 500 | 7626 | 1.119 | 10.72 | 32.15 | |
| 27 | rs315280_CHB | 500 | 7747 | 1.135 | 10.87 | 32.60 | |
| 28 | rs11203006_CHB | 500 | 7834.1 | 1.146 | 10.97 | 32.92 | |
| 29 | rs4240793_CHB | 500 | 8036.3 | 1.172 | 11.22 | 33.66 | |
| 30 | rs9325071 | 500 | 8219.4 | 1.194 | 11.43 | 分 34 秒 30 | |
| 31 | rs12678324_CEU | 500 | 8394.5 | 1.215 | 11.64 | 34.91 | |
| 32 | rs4653130_CEU | 500 | 8455.5 | 1.223 | 11.71 | 35.12 | |
| 33 | rs9275596 | 500 | 8537.6 | 1.232 | 11.80 | 35.39 | |
| 34 | rs12595448_CHB | 500 | 8603.6 | 1.240 | 11.87 | 35.62 | |
| PCR グレード Rnase フリー H2O のボリューム追加プライマー プール (μ L) | 561.78 | ||||||
表 6: 代表的な結果を生成するために使用さて 1 調整プライマー 。ターゲット濃度、よく 1 のプライマー プールで各プライマー プライマー プールと最終濃度で使用されるボリュームを含むサイズで調整拡張プライマーのテーブル。最終巻に必要な水の量は、テーブルの下部に提供されます。プライマー プールの容量 1.5 mL であった。
| # | 拡張プライマー | オリジナル ストック濃度 (μ M) | その他 | UEP_ 質量 | ターゲット反応濃度 (μ M) | EXT プライマー プール濃度 (μ M) | プール (μ L) を追加するボリューム株式入門 |
| 1 | rs10515597 | 500 | 4482.9 | 0.588 | 5.63 | 16.89 | |
| 2 | rs2759281_CEU | 500 | 4921.2 | 0.681 | 6.52 | 19.57 | |
| 3 | rs17641748 | 500 | 5080.3 | 0.713 | 6.83 | 20.48 | |
| 4 | rs1698042_CEU | 500 | 5201.4 | 0.737 | 7.05 | 21.16 | |
| 5 | rs5753625_CHB | 500 | 5411.6 | 0.776 | 7.43 | 22.30 | |
| 6 | rs3912537_CEU | 500 | 5811.8 | 0.848 | 8.12 | 24.35 | |
| 7 | rs6141319_CEU | 500 | 5883.8 | 0.860 | 8.23 | 24.70 | |
| 8 | rs1002587_CEU | 500 | 6026.9 | 0.884 | 8.46 | 25.39 | |
| 9 | rs1295686 | 500 | 6172 | 0.908 | 8.69 | 26.07 | |
| 10 | rs16877243_CEU | 500 | 6386.2 | 0.942 | 9.02 | 27.05 | |
| 11 | rs1103811 | 500 | 6595.3 | 0.974 | 9.33 | 27.98 | |
| 12 | rs6510332_CEU | 500 | 6790.4 | 1.003 | 9.61 | 28.82 | |
| 13 | rs6595142_CHB | 500 | 6874.5 | =1.016 | 9.72 | 29.17 | |
| 14 | rs4484738_CEU | 500 | 6966.5 | 1.029 | 9.85 | 29.55 | |
| 15 | rs1432975 | 500 | 7028.6 | 1.038 | 9.94 | 29.81 | |
| 16 | rs10879311_CEU | 500 | 7317.8 | ウェバー 1.078 | 10.32 | 30 秒 97 | |
| 17 | rs864481 | 500 | 7416.9 | 1.092 | 10.45 | 31.35 | |
| 18 | rs1295687 | 500 | 7447.8 | 109.6万 | 10.49 | 31.47 | |
| 19 | rs12644851_CHB | 500 | 7634 | 1.120 | 10.73 | 32.18 | |
| 20 | rs4265409_CHB | 500 | 7926.2 | 1.158 | 11.09 | 33.26 | |
| 21 | rs2927385_CHB | 500 | 7997.2 | 1.167 | 11.17 | 33.52 | |
| 22 | rs1538956_CHB | 500 | 8286.4 | 12.02 | 11.51 | 34.54 | |
| PCR グレード Rnase フリー H2O のボリューム追加プライマー プール (μ L) | 899.42 | ||||||
表 7: 代表的な結果を生成するために使用さて 2 調整プライマー 。ターゲット濃度、よく 2 プライマー プールで各プライマー プライマー プールと最終濃度で使用されるボリュームを含むサイズで調整拡張プライマーのテーブル。最終巻に必要な水の量は、テーブルの下部に提供されます。プライマー プールの容量 1.5 mL であった。
| マスター ミックス | 低プレックス (1-18) | 高プレックス (19-36) | ||
| 試薬 | × 1 | × 410 | × 1 | × 410 |
| (脱イオン) 水 | 0.7395 | 303.195 | 0.619 | 253.79 |
| バッファー | 0.2 | 82 | 0.2 | 82 |
| 終了ミックス | 0.1 | 41 | 0.2 | 82 |
| プライマー ミックス (LPA 調整) | 0.94 | 385.4 | 0.94 | 385.4 |
| iPLEX 酵素 * | 0.0205 | 8.405 | 0.041 | 16.81 |
| 合計 | 2 Μ L | 820 Μ L | 2 Μ L | 820 Μ L |
テーブル 8: マスター ミックス試薬および拡張反応の濃度.ここで井戸に 18 以下の Snp がある場合低プレックス反応のボリュームを使用する必要があります。19 以上の SNPs 高プレックス反応ボリュームを使用します。これは低プレックスの SNP の要件と表 2に詳細な増幅 PCR マスター ミックスの高プレックスに異なります。
| たちの条件 |
| 94 ° C、30 秒 |
| (94 ° C 5 秒、(52 ° C 5 秒、80 ° C 5 秒の 5 サイクル)) の 40 のサイクル |
| 72 ° C、3 分 |
| 4 ° C ホールド |
表 9: たち条件拡張反応
| 食品アレルギー例 vs 非食品アレルギー コントロール | |||||
| SNP | A1 | P | または | L95 | U95 |
| rs1295686 | A | 0.003 | 1.75 | 1.2 | 2.53 |
| rs2243297 | A | 0.13 | 2.1 | 0.8 | 5.51 |
| rs1295687 | G | 0.19 | 1.63 | 0.78 | 3.41 |
| rs2243211 | A | 0.22 | 1.45 | 0.8 | 2.64 |
| rs1295683 | T | 0.25 | 1.32 | 0.82 | 2.13 |
| rs2243248 | G | 0.51 | 1.21 | 0.69 | 2.11 |
| rs2243300 | T | 0.51 | 1.19 | 0.7 | 2.02 |
| rs1800925 | T | 0.6 | 1.11 | 0.75 | 1.63 |
| rs3091307 | G | 0.62 | 1.1 | 0.75 | 1.6 |
表 10:のバリアント rs1295686、IL13軌跡はチャレンジで実績のある食物アレルギーに関連付けられています。ロジスティック回帰分析、祖先、セックスとアトピー性湿疹のプレゼンスの調整をそのバリアント rs1295686 は実証済みの発見のコホートにおける食物アレルギーの挑戦に関連付けられて明らかにした (n = 367 例と 156 非アレルギー コントロール)。SNP 列リストを検討されているマーカー、A1 列リスト協会テストの参照アレルとして使用、マイナーな対立遺伝子。P 列回帰分析から P 値の一覧、または列リスト対応するオッズ比および L95 U95、分析から 95% 信頼区間の下限と上限の制限。データは、Ashely et al., 20179から再現。
| A. レプリケーションの分析: 食品アレルギー例 vs 非食品アレルギー コントロール | B. メタ分析 – 検出とレプリケーション | ||||||||||
| SNP | A1 | または | L95 | U95 | P | P | P(R) | または | OR(R) | Q | 私 |
| rs1295686 | A | 1.37 | 1.03 | 1.82 | 0.03 | 0.0005 | 0.0006 | 1.5 | 1.5 | 0.31 | 3.32 |
| rs1295687 | C | 1.1 | 0.68 | 1.78 | 0.7 | 0.3 | 0.3 | 1.24 | 1.24 | 0.38 | 0 |
表 11:独立した人口のレプリケーションの間の関連付けを確認します。IL13バリアント rs1295686 とチャレンジで実績のある食物アレルギー 。ロジスティック回帰は、祖先の主成分、セックス、アトピー性湿疹の独立した人口の修正 (n = 203 食物アレルギー症例と 330 非アレルギー コントロール) バリアント rs1295686 と食物アレルギーの関係を確認しました。メタ分析は、行われた、SNP と結果の関係のための証拠の最高レベルを提供すると不均一性の証拠がない有効にこの SNP で 2 つの集団の間のサイズします。ここで列はテーブル 10、追加 P(R) に従って、およびランダム効果メタ分析のための OR(R) 値モデル対固定効果モデル (P や)。Q と私はコクラン テストと私はインデックスの P 値をそれぞれ、両方効果サイズ研究間の不均質性の測定。データは、Ashely et al., 20179から再現。
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Discussion
ここでは、質量分析法による多重遺伝子型解析法を示します。代表的な結果は、MALDI-TOF 質量分析法4分析化学と材料表13に掲げると共に PCR を使用して生成されました。このプラットフォームでは、合計 40 時間以内 9 SNPs の 1,255 個人 11,295 遺伝子型をラボで生成されます。
生成し、食物アレルギーと独立した複製 phenotyped 探索臨床コホート研究における候補遺伝子IL13の SNP データの分析によって遺伝的仮説に答える手法の有用性を示す.プラットフォームは DNA の品質を下げるため比較的堅牢で、最小限の出発原料、唯一 10 の入力を必要とする ng。プロトコルで重要な手順次のとおりです: 最大多重アッセイに SNP 含める対象地域の成功したシングル PCR 増幅器の増幅成功を確保するためのアッセイ デザイン プロセスのトラブルシューティングの注意ヌクレオチド拡張子拡張反応と質量スペクトル データを正確に割り当てるソフトウェア解析ソフトウェアへのアッセイとサンプル プレート レイアウトの読み込み中。
前述したように、分析設計ツール使用してマウスとウシの多型と互換性さらには人間に。微生物や植物など他の生物の「その他」は「生物」メニューで選択できます。ただし、近位の SNPs を見つけて最適なプライマー領域を識別するための自動化された手順は利用できません。
デザイン プロセス中に近位 SNP 最適なプライマー領域の同定をブロックしている場合 1 つのデザインから SNP を削除してか高い LD で別の選択 (例えばr2 = 1)、または参照のいずれか 2 つのプライマーを設計することを選択SNP と代替対立遺伝子、または共通の対立遺伝子と 1 つのプライマーを設計やユニバーサル ベース (例えばイノシン) と SNP をマスキングに 1 つの対立遺伝子。プライマーのユニークなサイトを識別するのに問題がある場合は、一意のサイトを検索する私アンプリコン長さ設定を変更できます 1 つ。既定の設定は 80-120 bp が、これは 60 400 bp から変更することができます。ただし、劣化 DNA (例えば、FFPE 組織から) を使用して場合、それが私アンプリコンを長く理想的でないことに注意してください。
高ヘアピンやプライマー二量体の潜在的なツールのアッセイの設計手順の間にエラーがあります。デザイン、サポートをしようとする設定の両方を緩和できます。ただし、しきい値は 0.8; 以下緩和されていないお勧めこの設定、SNPs を救助し、0.8 必要な場合のみに削減するのに十分です参照してくださいに 0.9 を開始します。高度な設定でそれは"4多重タブの下 (最大 10) 設計の反復計算の回数を変更することが可能.デザイン試金」、だけでなく、最高平均多重または低プレックスで最少を拒否する最高の反復選択基準。ツールが提供されたアッセイを設計する、順序で最初の SNP をかかりますので、設計の反復回数を増やすことは有利。次回の SNP 同じマルチプレックス アッセイのために互換性がある場合、それをテストします。したがって、SNPs 問題の順序。複数のイテレーション オプションを選択、ソフトウェアは SNPs の順序をランダム化し、他の反復処理をしようと。これは SNPs 各多重に設計することができるの数を増やす可能性があります。 または SNP 不良品の数を減らすかもしれない。しかし、それはまた時間のコストで来るが、デザイン ツールはこのステップで長くかかる。
多重遺伝子型は、興味の遺伝子の調査のため迅速かつ手頃な価格のアプローチです。メソッドは、合理化され、1 日14未満で生成される遺伝子の数万人を許せば 10 時間で SNPs 40 プレックスまで約 760 サンプルを実行させます。質量スペクトルは、プラットフォームによって提供されるツールで簡単に分析できます。
プラットフォームにいくつかの制限には、アッセイ デザイン プロセスは失敗します SNPs の 5-10% の推定損失が含まれます。これは、代替タグまたはプロキシ SNP の選択によっても修正できます。ブロード研究所の SNP のアノテーションとプロキシ検索 (スナップ) データベースは、SNPs15プロキシの識別を容易にするようなツールです。システムのもう一つの制限は、ゲノムワイドなアプローチで達成と対象となるプラットフォームは、それとそのため広範な新しい発見を許可しません。さらに、アプローチは、遺伝子全体のカバレッジを最大限にタグ SNP プロキシを使用して、微細マッピング研究はその後必要正確な因果のバリアントを決定するかもしれない。
多重遺伝子型は、まだ GWA 研究アプローチまたは仮説駆動型経路と候補者の遺伝子探索に記された疾患 SNPs の尋問のため便利なプラットフォームです。プラットフォームの将来のアプリケーションは、診断・検診がんなど臨床ウイルス学分野の小説を使用する可能性があります。全体的な質量分析と多重遺伝子型、遺伝子多型候補遺伝子座の費用効果の高い迅速かつ信頼性の高い媒体スループット方法です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者の謝辞があります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA | - | - | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | - | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | - | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
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