Summary
Identificatie van genetische varianten bij te dragen tot complexe ziekten bij de mens laat ons toe om nieuwe mechanismen te identificeren. Hier, aantonen wij een multiplex genotypering aanpak aan kandidaat-genen of gene traject analyse die maximaliseert de dekking tegen lage kosten en is vatbaar voor cohort gebaseerde studies.
Abstract
Complexe aandoeningen zijn vaak ondersteund door meerdere voorkomende genetische varianten die tot de gevoeligheid van de ziekte bijdragen. Hier beschrijven we een kosteneffectieve tag single nucleotide polymorphism (SNP) aanpak massaspectrometrie, een multiplexed genotypering assay met te onderzoeken gene traject verenigingen in klinische cohorten. We onderzoeken de voedsel allergie kandidaat-locus Interleukin13 (IL13) als voorbeeld. Deze methode maximaliseert efficiënt de dekking door gebruik te maken van gedeelde koppeling onevenwicht (LD) binnen een regio. Geselecteerde LD SNPs vervolgens beogen in een multiplexed assay, waardoor maximaal 40 verschillende SNPs te analyseren gelijktijdig, stimuleren van kosteneffectiviteit. Polymerase-kettingreactie (PCR) wordt gebruikt voor het versterken van de target loci, gevolgd door extensie van één nucleotide, en de waarbij vervolgens worden gemeten met behulp van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie-tijd van de Spectrometrie van de massa van de flight(MALDI-TOF). De ruwe uitvoer wordt geanalyseerd met het genotype aanroepen van software, met behulp van strikte kwaliteitscontrole definities en cut-offs, en hoge waarschijnlijkheid genotypen zijn bepaald en output voor data-analyse.
Introduction
In complexe ziekten bij de mens, genetische varianten bijdragen tot ziekte gevoeligheid en kwantificeren van deze varianten kunnen nuttig zijn voor begrip pathogenese, hoog risico patiëntengroepen, en behandeling-responders te identificeren. Inderdaad, de belofte van precisie geneeskunde is afhankelijk van het met behulp van genomische informatie ter identificatie van de patiënt subgroepen1. Helaas, binnen de complexe ziekte biologie ruimte, waar ziekte fenotypen geschraagd worden door een grote genetische heterogeniteit, lage doordringendheid en variabele expressiviteit, cohort formaat vereisten voor genoom-brede benaderingen te identificeren van de roman kandidaten zijn vaak onbetaalbaar grote2. U kunt ook begint een gerichte kandidaat-gen aanpak met een a priori hypothese over specifieke genen/studierichtingen in ziekte etiologie3. Traject analysehulpmiddelen worden vaak gebruikt om te onderzoeken de pathofysiologie van een vastgestelde doel loci, genereren van talrijke kandidaat-trajecten worden onderzocht. Wij aantonen hier een multiplexed genotypering aanpak waardoor voor het onderzoek van tientallen tot honderden SNPs met één assay, geschikt voor menselijke cohort studies4. Deze aanpak is relatief hoog door-put, toelaat van honderden tot duizenden DNA-monsters te worden gegenotypeerd voor nieuwe ontdekking studies en onderzoek van specifieke studierichtingen. De methoden die hier worden beschreven zijn nuttig voor identificeren risico allelen en hun verenigingen met klinische eigenschappen op een relatief snelle en goedkope manier. Dit platform is zeer voordelig zijn voor screening en diagnostische doeleinden5,6, en meer recentelijk, voor microbiële infectie7 en humaan papillomavirus8.
Dit protocol begint met de selectie van een aantal genen voor onderzoek, dwz., de doelregio's, meestal bepaald door de literatuur zoeken, of een priori hypothesen voor betrokkenheid bij het ziekteproces; of misschien geselecteerd voor replicatie als de toonaangevende verenigingen van een genoom-brede vereniging (GWA) studie van ontdekking. Uit de gene set, zal de onderzoeker een verfijnde lijst van tag SNPs selecteren. Dat wil zeggen wordt de koppeling onevenwicht (LD), of een correlatie, tussen varianten in de regio gebruikt ter aanduiding van een vertegenwoordiger van de 'tag SNP' voor een groep van SNPs in hoge LD, bekend als een haplotype. De hoge LD van de regio betekent dat de SNPs vaak samen zodat genotypering één SNP is voldoende om te vertegenwoordigen de variatie op alle SNPs in de haplotype worden overgenomen. Als alternatief, als uit vele regio's, bijvoorbeeldin aansluiting op een definitieve lijst van SNPs., replicatie voor een studie van GWA, dit proces onnodig kan zijn. Voor multiplexed genotypering, moet een bepaling vervolgens worden rond deze doelstellingen zodanig ontworpen dat de versterking inleidingen zijn verschillende massa aan die van de uitbreiding inleidingen en producten te produceren interpreteerbaar massa spectra. Deze parameters worden eenvoudig uitgevoerd door het programma voor het ontwerpen van een multiplexed genotypering assay. De voorwaartse en omgekeerde inleidingen van dit ontwerp worden gebruikt voor het richten van de markers van belang en het versterken van de volgorde waarin de SNP. De extensie inleidingen hechten rechtstreeks proximale aan de SNPs en een enkele, massa-gewijzigd, 'terminator'-base die is een aanvulling op de SNP is toegevoegd. De terminator-base voorkomt verdere uitbreiding van het DNA. De massa-wijziging van de base kunt fragmenten uiteenlopende door één voet worden gedetecteerd door de Spectrometrie van de massa. De plaat met de genotypering chemie wordt vervolgens toegepast op een chip voor meting op een platform van de Spectrometrie van de massa. Na het toepassen van geschikte kwaliteitscontroles op de oproep van de ruwe genotypering gedetecteerd door het systeem, kunnen de gegevens worden geëxporteerd en gebruikt voor statistische analyse om te testen voor vereniging met ziekte fenotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het genetische materiaal gebruikt hierin werd ethisch goedgekeurd voor gebruik door het Bureau voor kinderen HREC (menselijke ethiek Commissie onderzoek) (CDF/07/492), het departement van menselijke diensten HREC (10/07) en de Koninklijke kinder ziekenhuis (RCH) HREC (27047).
1. de ontwerpen van de Multiplexed Assay
- Een lijst van SNP voorbereiden assay ontwerp.
- Inbreng van de doel-regio in de muzikale functie van Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Gebruik de LD (correlatie, r2) tussen SNPs verspreid over de regio doel voor het genereren van een lijst van SNPs, die volledige dekking van het gewenste gebied met het laagste aantal vereiste varianten biedt. Genereer een lijst met SNPs zodanig dat alle allelen worden vastgelegd zijn gecorreleerd boven een door de gebruiker gedefinieerde drempel (bv., r2 ≥0.8).
- Identificatie van geschikte reeksen inleidingen vooruit, achteruit en uitbreiding
- Geef de gegenereerde lijst met SNPs in de assay design tool van keuze.
Opmerking: De volgende instructies gelden voor de assay design tool gebruikt om de representatieve resultaten, zoals aangegeven in de Tabel van materialente genereren. - Zodra het ontwerphulpmiddel assay is gelanceerd, selecteer Nieuwe genotypering ontwerp. Voer een naam voor het ontwerp van de bepaling in het veld Naam van het ontwerp .
- Bevat de lijst van de SNP door te klikken op de knop Bewerken tekst intoetsen met de instructies rs of FASTA links van de knop in stap 1.1.1 gegenereerd.
Opmerking: SNPs kunnen worden ingevoerd als een lijst van de tekst van verwijzing (rs) SNP-id's of geüpload in FASTA formaat, of de groep van de SNP-bestandsindeling gebruikt door het hulpprogramma. Selecteer de knop Bestand uploaden om dossiers te uploaden in deze indelingen. De bovengrens van de varianten die kunnen worden ontworpen in een enkele assay, aangeduid als 'goed', is 40 SNPs. Het is mogelijk om te specificeren SNPs die een prioriteit voor het ontwerp voordat u begint de termijn; Deze zal eerst worden ontworpen. Controle SNPs kunnen worden opgegeven: bijvoorbeeld, een bepaling te detecteren van gender in geval van monster mix ups of een besturingselement te bepalen die voldoende sjabloon is toegevoegd als werken met lage of slechte kwaliteit DNA. Echter moet worden opgemerkt dat het gebruiken van controle en prioriteit SNPs kan verminderen het aantal SNPs die goed kan worden ontworpen in een honkslag. - Selecteer de optie iPLEX hoog Multiplexing voorinstelling in het menu voorinstelling . Het organisme menu, selecteer het organisme waaruit het DNA te worden gegenotypeerd is afgeleid. Dit was voor de representatieve resultaten die hier gepresenteerd, mens.
Opmerking: Muis en boviene organismen zijn ook compatibel met het gereedschap. Men kan ook selecteren andere als werken met een alternatieve organisme zoals plantaardige of micro-organisme; echter de automatische stappen voor het vinden van de proximale SNPs en optimale primer gebieden zullen niet beschikbaar zijn vanwege het ontbreken van een verwijzing genoom. - Selecteer in het menu Database de laatste build van het genoom, of een alternatieve bouwen indien nodig, van de chemie -menu. Selecteer iPLEX en voer bij het veld Multiplex niveau het hoogste niveau van multiplexing: 40. Kies nu Beginnen lopen. "Stap 1" van de tool zal beginnen.
Opmerking: Tijdens stap 1, de tool haalt en formaten van de SNP-sequenties. Hier kunnen fouten omvatten opmaak van het bestand FASTA waarin geval het FASTA bestand moet worden gecontroleerd en zo nodig opgemaakt. Een andere fout is SNP rs getallen die zijn samengevoegd met een andere rs, in die geval de rs-nummer moet worden gezocht in een SNP-database zoals van de NCBI dbSNP te identificeren van het nieuwe nummer van SNP rs. Sequenties rond de SNP gezocht naar eventuele bekende proximale SNPs die met het ontwerp van de primer interfereren kunnen. Potentiële PCR inleidingsplaatsen zijn vergeleken met het genoom om te voorkomen dat niet-specifieke versterking als gevolg van meerdere hits in het genoom. - Wachten op de voltooiing van "Stap 2" van de design tool waarin proximale SNPs zal worden geïdentificeerd.
Opmerking: Als een organisme dat niet wordt ondersteund door deze stap, aantekeningen de sequenties met proximale SNPs in IUPAC-aantekening als deze informatie beschikbaar is. Er zijn zelden fouten tijdens deze stap; echter, kunnen fouten optreden als de verkeerde referentie organisme of genoom was geselecteerd, of als cDNA sequenties werden opgenomen in plaats van genomic DNA. Voor het optimaliseren van stap 2, onder Geavanceerde instellingen, is het mogelijk om te filteren op SNPs op basis van een populatie als werkt binnen een specifieke populatie. Zeldzame SNPs kunnen ook door met uitzondering van die met een frequentie minder dan 1% worden uitgefilterd. SNPs die een gevalideerde status niet bezitten of geen informatie van de bevolking kunnen ten slotte ook worden uitgesloten, indien gewenst. - Wachten op de voltooiing van "Stap 3" van de design tool waarmee optimale primer regio's. Desgewenst primer locaties zijn geïdentificeerd, of als werken met een ander organisme, handmatig ingang primer locaties door het toewijzen van aantekeningen aan de input sequentie (de SNP groepsbestanden) met de regio's de voorkeur primer in hoofdletters en de rest van de sequentie in lagere geval, selecteer Geval behouden in het menu van de geavanceerde instellingen voor deze stap.
Opmerking: Eventueel fouten voor stap 2 & 3: (1) A proximale SNP blokkeren van het ontwerp van een primer met de oplossing te maskeren met een niet-template-base en bestel een oligo met een universele basis zoals Isonine, of twee inleidingen, met elk van de allelen van het proxim ontwerpen al SNP of ontwerp een primer met alleen het gemeenschappelijk allel. (2) een andere veelgemaakte fout is het uitblijven van een unieke site voor de primer inleven in de oplossing wordt tot wijziging van de lengte van de amplicon om een unieke site identificeren. In het instrument dat wordt gebruikt voor dit papier, is de standaardwaarde 80-120 bp. Dit kan worden gewijzigd van 60-400 bp in de dialoog van de geavanceerde instellingen onder de Amplicon lengtestanden in "3. Optimale Primer gebieden herkennen"en ook onder het tabblad van de Amplicon van"4. Ontwerpen van testen." Controleer dat beide zijn gewijzigd. Echter, opgemerkt moet worden dat de verhoging van de lengte van de amplicon bij gebruik van gedegradeerd DNA wordt niet aanbevolen. - Wachten op de voltooiing van de assay ontwerp stap ("stap 4" van het ontwerp tool), hier het hulpprogramma streeft naar optimale pass scheiding tussen de extensie inleidingen en de allelen van alle SNPs in de multiplexed ontwerpen. Na deze stap voltooid is, exporteert u het bestand van Oligo volgorde, die is opgemaakt voor het eenvoudig bestellen via een oligo leverancier van keuze te bestellen.
Opmerking: Versterking inleidingen (vooruit (F) en Reverse (R)) zijn speciaal ontworpen om een optimale amplicon grootte van 80 tot 120 bp. De versterking primer massa mag afwijken van die van de uitbreiding primer en haar product om te voorkomen dat tegenstrijdige resultaten in de massaspectrum en voor de algehele prestaties van de PCR. De extensie primer moet 15 tot 30 nucleotiden lang (4500-9000 Da), zo ontworpen dat het 3'-eind direct op de site van het polymorfisme zal hechten. Al deze instellingen worden automatisch ingesteld in het instrument dat wordt gebruikt om de representatieve resultaten te genereren.
- Geef de gegenereerde lijst met SNPs in de assay design tool van keuze.
- Het ontwerp van de gekozen tool en volgorde inleidingen van een provider oligomeren exporteren: 25 nmol van elk van de PCR inleidingen (forward en reverse) en 100 nmol van elk van de extensie inleidingen. Zie tabel 1 voor de inleidingen gebruikt om de representatieve resultaten te genereren.
2. genotypering (1-2 dagen)
- Versterking inleidingen voor te bereiden.
- Als gelyofiliseerd inleidingen werden besteld, reconstrueren met moleculaire rang water. Gebruik een concentratie van 100 μM/μL voor voorwaartse en omgekeerde inleidingen en 500 μM/μL voor uitbreiding.
- Zwembad voorwaartse en omgekeerde inleidingen voor elke multiplexed assay in een voorraad primer mix, met elke primer op een concentratie van 0,5 mM.
Opmerking: bijvoorbeeld een zwembad van 400 μL primer voor 400 reacties:
2 μL van elke primer, bij een concentratie van 100 μM/μl, is vereist voor het zwembad voorraad primer. Voor een 30-plex assay met 60 voorwaartse en omgekeerde inleidingen, zou het totaal 120 μL van primer nodig (het geconcentreerde primer zwembad). 280 μL moleculaire-grade water zou vervolgens worden toegevoegd aan een eindvolume van 400 μL van primer mix maken.
- Versterking met behulp van Polymerase Chain Reaction (PCR)
- Maken van een master mix voor de PCR met 100 nM van de primer mix hierboven, 500 μM van dNTPs, 2 mM MgCl2en 0,5 U van een enzym DNA-polymerase. 1 U is vereist voor groter is dan 26-plex testen. Verwijzen naar de tabel 2.
- 4 μL van deze mix toevoegen aan elk putje van de plaat 384-well PCR, samen met 1 μL van genomic DNA bij een concentratie van 5-10 ng/μL.
Opmerking: kwaliteitscontroles moeten ook worden opgenomen op de plaat, zoals de controle van een niet-sjabloon en een positieve controle die eerder goed met de bepaling (tijdens een test) heeft uitgevoerd. Als meerdere platen, meerdere DNA monsters van de andere plate(s), bijv., in drievoud, moeten worden uitgevoerd als technische controles voor inter plaat variabiliteit. - Centrifugeer de plaat bij 200 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur met een cover van de plaat op zijn plaats om ervoor te zorgen dat alle vloeistof bevindt zich aan de onderkant van de putjes van de plaat.
- De PCR uitvoeren met de volgende thermocycler voorwaarden: 4 min incubatie bij 94 ° C tot het activeren van de polymerase van DNA; 45 cycles van de volgende handelingen uit (denaturatie bij 94 ° C gedurende 20 s, gloeien bij 56 ° C gedurende 30 s, en uitbreiding bij 72 ° C gedurende 1 min) en vervolgens een laatste uitbreiding bij 72 ° C gedurende 3 min. verwijs naar PCR programma in tabel 3.
- Agarose de Elektroforese van het gel om ervoor te zorgen dat de versterking van DNA is succesvol uit te voeren. Gebruik 1 µL van het PCR-product (met 3 µL van laden buffer) op een agarose gel 2% (g/v), gemaakt door het mengen van agarose poeder en 0,5% Tris boraat EDTA (FSME) buffer, en draaien voor 45 min op 100 V.
- Garnalen alkalisch fosfatase (SAP) zuivering stap
Opmerking: Deze stap wordt gebruikt voor het verwijderen van de designated nucleotiden. Het SAP-enzym cleaves fosfaat groepen om te voorkomen dat overtollige primer en designated dNTPs inmenging in de reactie van de komende uitbreiding.- Maak een meester Meng bevattende 1.7 eenheden/μL van garnalen alkalische fosfatase (SAP) enzym, 10 x SAP buffer en vul tot de maatstreep met moleculaire-grade water. Raadpleeg tabel 4.
- Voeg 2 μL van de vers gemaakte omhoog SAP master mix aan elk putje van de plaat al met 5 μl van het PCR-reactie. Kort centrifugeren en terugkeren naar thermocycler bij 37 ° C gedurende 40 minuten, waarna bij 85 ° C gedurende 5 min. voor inactivering van het enzym. Verwijzen naar de tabel 5.
- Primer extensie reactie
Opmerking: De concentratie van de extensie inleidingen in de extensie primer mix moet worden aangepast door grootte (lineaire Primer aanpassing – LPA). Dit is omdat er een omgekeerde relatie in de piek intensiteit (op de massaspectra) en product massa. Aanpassing van de concentratie van de primer extensie corrigeert voor deze relatie te produceren pieken van gelijke intensiteit. Aangepast inleidingen gebruikt voor het genereren van de vertegenwoordiger resultaten vindt u in de tabellen 6 & 7. De volumes die verstrekt zijn voor het genereren van 1,5 mL voor uitbreiding primer mix.- Berekenen verdunningsfactoren voor elke primer met een kleurovergang algoritme, beschikbaar vanaf Agena Biosciences ('lineaire Primer aanpassing'), die wordt aangepast voor de massa en de concentratie van de primers, en het totale aantal inleidingen in de multiplexed reactie (Zie Tabellen 6 & 7). Voer de UEP massa voor elke primer op het gebied van de UEP_MASS van het blad van de lineaire Primer aanpassing.
Opmerking: De massa gecorrigeerde concentratie voor de primer zal worden automatisch berekend in de cel met de koptekst "Target reactie concentratie (µM)." Het volume van de primer om te worden toegevoegd aan de pool van de primer zal worden output in de cel onder de koptekst "Volume Stock Primer worden toegevoegd aan de Pool (µL)." De hoeveelheid water moet worden toegevoegd aan de pool van de primer te halen van de berekende concentraties wordt uitgevoerd naar de cel naast de tekst "Volume van PCR Grade RNase gratis H2O worden toegevoegd Primer zwembad (µL)." - Nemen van het volume van elke primer zoals opgegeven in het bestand van de lineaire Primer aanpassing en make-up van een primer pool. De hoeveelheid water berekend door het algoritme om te verdunnen van het zwembad van de primer zoals bepaald in stap 2.4.1 toevoegen.
Opmerking: Als de kleurovergang algoritme-methode niet beschikbaar is, een andere methode is de inleidingen in lage massa en hoge massa verdelen en dubbel de concentratie van de hoge massa inleidingen ten opzichte van de lage massa group toevoegen. Drie of vier groepen kunnen worden vereist voor een hoge-plex assay (dat wil zeggen meer dan 19 SNPs). Deze methode zal echter niet toegeven als optimale tarieven als de kleurovergang algoritme-methode. - De extensie master mix samenstellen. Voor de lage plex assay (1-18 plex), 0,2 μL van buffer, 0.1 μL van beëindiging mix, 0.94 μL van de LPA aangepast primer mix en 0.0205 μL van enzym (bereid op ijs) toevoegen. Toevoegen voor de hoge plex assay (19-36 plex), dubbele concentratie van beëindiging mix en enzym (beëindiging mix 0.2 μL en iPLEX enzym 0,041 μL). Verwijzen naar de tabel 8.
- 2 μL van de extensie reactie master mix toevoegen aan de plaat uit de vorige reactie, het totale volume van nu om met 9 μl per putje. Kort centrifugeren en plaats in het thermocycler: 94 ° C gedurende een 30 s eerste incubatie, 40 cycli van 1 x 94 ° C voor 5 s met 5 x (52 ° C gedurende 5 s, gevolgd door de 80 ° C gedurende 5 s), en vervolgens 72 ° C gedurende 3 min. doorverwijzen naar tabel 9.
- Berekenen verdunningsfactoren voor elke primer met een kleurovergang algoritme, beschikbaar vanaf Agena Biosciences ('lineaire Primer aanpassing'), die wordt aangepast voor de massa en de concentratie van de primers, en het totale aantal inleidingen in de multiplexed reactie (Zie Tabellen 6 & 7). Voer de UEP massa voor elke primer op het gebied van de UEP_MASS van het blad van de lineaire Primer aanpassing.
- Hars zuivering.
Opmerking: Teveel zouten kunnen nu worden verwijderd uit de reactie met het gebruik van hars.- Voeg 16 μL van gedeïoniseerd water toe aan de putjes van de opgehaalde plaat, waardoor het volume in de plaat tot 25 μL.
- Toepassing van hars, meestal 6 mg kuiltje hars plaat (apart aangekocht), gelijkmatig aan de hele plaat. Laat de hars in de hars kuiltje plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur drogen voordat u toepast op de plaat van de reactie. Na toevoeging van de hars, draaien plaat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met de hand of met een schorsing mixer op een lage snelheid (bijv., 7,5 rpm).
Opmerking: Voordat het laden van de analyt genotypering op de genotypering-chip, de monsters en de bepaling lay-out moeten worden ingevoerd in de software-interface. Dit kan worden bereikt met behulp van het bestand van de ontwerp-samenvatting van de assay design tool.
- Meting op een platform van de Spectrometrie van de massa.
- Centrifugeer de plaat bij 3200 x g gedurende 5 minuten om te voorkomen dat de toepassing van hars op de chip van massaspectra.
- Upload de plaat lay-out van de monsters naar software-interface van het systeem voorafgaand aan de run.
Opmerking: Stap 2.6.3 moet alleen worden uitgevoerd door geschoold personeel. - Breng het mengsel van de analyt genotypering van de plaat naar de genotypering-chip met een doseersysteem. Vervolgens laadt u de chip op de MALDI-TOF-systeem voor het genereren van de massaspectra van de analyt mengsel, die vervolgens met behulp van de interface van de software van het platform kan worden geïnterpreteerd.
Opmerking: Het systeem genereert de massaspectra door regie korte pulsen van UV-licht op elke 'pad,' overeenkomt met een enkel putje van de plaat genotypering, van de massaspectra chip. Deze impuls resulteert in desorptie en ionisatie van de analyt. Deze geïoniseerd DNA moleculen worden vervolgens naar de top van de vacuümbuis aangedreven door een hoog voltage elektrostatisch veld, scheiden van lichtere ionen, die sneller reizen en het bereiken van de detector eerst vanaf de zwaardere ionen. De "tijd van de vlucht" van deze analyten worden geregistreerd door het systeem, waaruit de massa van elke fragment van DNA kan worden bepaald en dus de nucleotide base de SNP bijwonen kan worden afgeleid.
3. genotypering gegevens
Opmerking: kwaliteitscontrole en data interpretatie zijn niet de focus van deze methodologie papier. De volgende zal kort dekken echter interpretatie van de massaspectra.
- Handmatige inspectie en controle van de kwaliteit van massaspectra.
Opmerking: De ruwe massaspectra worden gegenereerd door het systeem en geanalyseerd met de software zoals deze wordt weergegeven in de Tabel van materialen. Een Gaussiaanse mengsel clustering van de methode wordt toegepast op deze uitgang probabilistische genotypering gesprekken tot stand brengen.- Open de analysesoftware. Selecteer Typer Analyzer. In het menu bestand , selecteer Open putten uit bestand en selecteer het XML-bestand met de gegevens van de spectrum gegenereerd in stap 2.6.3. De chip-naam voor de run moet worden weergegeven, selecteert u deze en een "verkeerslicht"-deelvenster van de plaat 384-well wordt weergegeven met een lijst van de SNPs in de geselecteerde goed. Selecteer de Bel Cluster Plots een scatterplot van gegevenspunten weergeven voor elke SNP hiervandaan.
Opmerking: Het wordt aanbevolen dat het resultaat van een 'geen call' lage intensiteit SNPs worden aangevraagd. In de software die wordt gebruikt voor de representatieve resultaten, wordt een clustering omvang licht-donkerscheiding van 5, die hoger dan standaard is, voorgesteld voor strikte kwaliteitscontrole. Deze instelling kan worden aangepast in het veld grootte Cutoff onder Parameters in het deelvenster Post verwerking Clusters . Selecteer Autocluster in het tabblad hulpprogramma's uit te voeren op een cluster-analyse. - Handmatige inspectie van genotype oproepen door het onderzoek van de Cartesische percelen in het Post verwerken deelvenster uitvoeren Klik in het deelvenster Assay Selecteer de SNP van belang en klik op het tabblad Post-Processing Clusters , een cluster perceel met genotype clustering zullen zichtbaar met monster IDs en bijbehorende genotypen voor de SNP.
- Het genotype oproep clusters onderzoeken en beoordelen hoe goed per afzonderlijke oproep clusters met de andere oproepen voor de SNP. De software voorziet in sommige grenzen op het perceel elk genotype voor begeleiding; Zie voorbeeld van een genotype oproepen cluster plot uit een IL13 SNP (Figuur 1). Als de aanroep doet niet strak cluster met andere oproepen en zit duidelijk buiten een cluster, of als het heeft zeer lage intensiteit, klik met de rechtermuisknop de datapoint en selecteer Verandering Bel handmatig in te stellen het niet noemen.
- Om ervoor te zorgen dat gegevens van de genotypering van hoge kwaliteit wordt gebruikt voor downstream analyse, uitsluiten SNPs en particulieren met beltarieven drempel een QC, bijvoorbeeld 90%. Zodra de nodige aanpassingen hebben aangebracht in de gegevens van de oproep, de gegevens voor statistische toepassingen exporteren. In de software die wordt gebruikt voor het genereren van de representatieve resultaten (vermeld in de Tabel van materialen) wordt dit bereikt met de selectie van de Plaat gegevens uit het weergave-menu en selecteren van Opslaan als.
- Open de analysesoftware. Selecteer Typer Analyzer. In het menu bestand , selecteer Open putten uit bestand en selecteer het XML-bestand met de gegevens van de spectrum gegenereerd in stap 2.6.3. De chip-naam voor de run moet worden weergegeven, selecteert u deze en een "verkeerslicht"-deelvenster van de plaat 384-well wordt weergegeven met een lijst van de SNPs in de geselecteerde goed. Selecteer de Bel Cluster Plots een scatterplot van gegevenspunten weergeven voor elke SNP hiervandaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met het protocol zoals hierboven beschreven, label we gegenotypeerde SNPs over het Th2 immuun gen IL13 in een cohort van voedsel allergie gevallen en besturingselementen9. We logistische regressieanalyse, gecorrigeerd voor het voorgeslacht en andere potentiële covariates, om te testen of de genetische varianten binnen de regio van belang voedsel allergie risico toegenomen toegepast. Tabel 10 9 ziet u dat één variant rs1295686 is gekoppeld aan uitdaging-bewezen voedselallergie en we bevestigd deze vereniging in een cohort van replicatie met behulp van hetzelfde multiplexed genotypering aanpak. Een meta-analyse van de resultaten van de twee cohorten verstrekt sterk bewijs van vereniging van IL13 met FA (tabel 11)9. We genetisch afgeleid en aangepast voor afkomst in de analyse met behulp van een afkomst informatieve SNP marker panel, aangepast van een gepubliceerde paneel-10. We gegenotypeerde hettoezichtpanel gebruiken dezelfde multiplexed assay aanpak.
De bijbehorende variant, rs1295686, heeft eerder is aangemerkt als een astma risico loci11 en andere allergische immunologische parameters12, suggereren dat is het mogelijk een algemene allergische ziekte risico loci is gekoppeld. De volgende stappen zou moeten voeren van verdere studies, zoals analyse van differentiële expressie, mapping van de fysieke interacties met een methode van chromatine vastleggen, fijne in kaart brengen van de regio, en haplotype analyse, pin punt de functionele variant en karakteriseren de biologie achter de waargenomen associatie met voedselallergie.
Figuur 1: cartesiaanse cluster perceel voor de IL13 SNP-rs1295686. Gele clusters vertegenwoordigen homozygoot genotype dringt aan op de A-allel, blauw voor de G-allel en groen voor heterozygoot oproepen. De paar genotype telefoontjes die deed niet clusteren met ofwel de homozygoot of heterozygoot massaspectra werden ingesteld op "geen gesprek."
Tabel 1: Primer sequenties gebruikt voor het genereren van de representatieve resultaten voor IL13. De kolom naam bevat de ID van de SNP, de goed nummer (zoals eerder vermeld, het "goed" nummer verwijst naar de ID van de multiplexed assay), en het soort primer (F voor forward, R voor reverse en UEP voor de uitbreiding primer). De volgende kolommen bevatten de volgorde van de primer, de grootte van de primer en het type van de reiniging. Opgemerkt moet worden dat SPINK5 en een panel voorgeslacht informatieve Markers (AIM) gegenotypeerde gebruikend de zelfde test, hoewel deze resultaten niet met de gepresenteerde representatieve resultaten besproken zijn waren. SNPs eindigt in _CEU en _CHB verwijzen naar doel SNPs voor de Noord-Europeanen uit Utah en de Han-Chinezen in Beijin, China populaties uit de 1000 genoom project respectievelijk. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Master Mix | Lage Plex (≤26 SNPs) | Hoge Plex (> 26 SNP) | |||
| Reagens | Conc. in 5 µL | × 1 | × 200 | × 1 | × 200 |
| Water (gedeïoniseerd) | 1.9 | 380 | 1.8 | 360 | |
| Buffer | 1 × (2 mM MgCl2) | 0,5 | 100 | 0,5 | 100 |
| MgCl2 | 2 mM | 0.4 | 80 | 0.4 | 80 |
| dNTPs | 500 ΜM | 0.1 | 20 | 0.1 | 20 |
| Primer mix ** | 100 nM | 1 | 200 ** | 1 | 200 ** |
| Taq polymerase | 0,5 U / 1 U | 0.1 | 20 | 0.2 | 40 |
| Totaal | 4 ΜL | 800 ΜL | 4 ΜL | 800 ΜL | |
| ** al verdund met gedeïoniseerd H20 als gedetailleerde in 2.1.2 | |||||
Tabel 2: reagentia en concentraties die nodig zijn om de PCR versterking primer mix. De master mix volumes zijn voor 200 reacties gegeven, omdat 400 (genoeg ter dekking van een 384-well-plate) het niet in een buis 1,5 µL passen zal en dus 2 x 200 moet worden gemaakt in afzonderlijke buizen. Volumes opgegeven onder lage Plex moeten worden gebruikt als de multiplexed assay "goed" minder dan of gelijk aan 26 SNPs, indien groter bevat dan 26 SNPs in het goed gebruik van de hoge Plex volumes.
| Thermocycler voorwaarden |
| 94 ° C gedurende 4 minuten |
| 45 cycles (56 ° C 30 s, 94 ° C 20 s, 72 ° C 1 min) |
| 72 ° C gedurende 3 minuten |
| 4 ° C houden |
Tabel 3: Thermocycler voorwaarden voor PCR versterking.
| Master Mix | × 1 | × 410 |
| Water (gedeïoniseerd) | 1.53 | 627.3 |
| 10 × buffer | 0,17 | 69,7 |
| SAP enzym (1.7 U/µL) | 0.3 | 123 |
| Totaal | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tabel 4: reagentia en concentraties voor de master mix voor de SAP reactie. Master mix volumes worden gegeven voor 410 reacties op een 384-well afdekplaat met een marge voor pipetting fout.
| Thermocycler voorwaarden |
| 37 ° C gedurende 40 min |
| 85 ° C gedurende 5 minuten |
| 4 ° C houden |
Tabel 5: Thermocycler voorwaarden voor de SAP-reactie.
| # | Uitbreiding Primers | Originele voorraad concentratie (µM) | Misc. | UEP_ MASSA | Doelgroep reactie concentratie (µM) | EXT Primer zwembad concentratie (µM) | Volume Stock Primer moet worden toegevoegd aan de Pool (µL) |
| 1 | rs36110_CHB | 500 | 4359.8 | 0.560 | 5.36 | 16.09 | |
| 2 | rs10488619_CHB | 500 | 4546 | 0.602 | 5,76 | 17.29 | |
| 3 | rs1986420_CEU | 500 | 4761.1 | 0.648 | 6.21 | 18.62 | |
| 4 | rs2934193_CEU | 500 | 4964.3 | 0.690 | 6.61 | 19.82 | |
| 5 | rs4968382_CEU | 500 | 5047.3 | 0.707 | 6.77 | 20.30 uur | |
| 6 | rs1227647_CEU | 500 | 5136.4 | 0.724 | 6.93 | 20.80 | |
| 7 | rs1402851_CEU | 500 | 5338.5 | 0.763 | 7.30 | 21.91 | |
| 8 | rs4705054 | 500 | 5476.6 | 0.788 | 7.55 | 22.64 | |
| 9 | rs6928827 | 500 | 5678.7 | 0.824 | 7,89 | 23.68 | |
| 10 | rs9325072 | 500 | 5762.8 | 0.839 | 8,03 | 24.10 | |
| 11 | rs4841401_CHB | 500 | 5853.9 | 0.855 | 8.18 | 24.55 | |
| 12 | rs11098964_CHB | 500 | 6052.9 | 0.888 | 8,50 | 25,51 | |
| 13 | rs2416504_CHB | 500 | 6174 | 0.908 | 8,69 | 26.08 | |
| 14 | rs1860933 | 500 | 6264.1 | 0.923 | 8.83 | 26,50 | |
| 15 | rs2193595_CHB | 500 | 6391.2 | 0.943 | 9.03 | 27.08 | |
| 16 | rs1519260_CHB | 500 | 6469.2 | 0.955 | 9.14 | 27,43 | |
| 17 | rs11184898_CHB | 500 | 6588.3 | 0.973 | 9.32 | 27,95 | |
| 18 | rs679832_CEU | 500 | 6757.4 | 0.998 | 9.56 | 28.68 | |
| 19 | rs326626_CEU | 500 | 6765.4 | 1,000 | 9,57 | 28.71 | |
| 20 | rs1612904 | 500 | 6873.5 | 1.015 | 9,72 | 29.17 | |
| 21 | rs862942 | 500 | 6960.5 | 1.028 | 9.84 | 29.53 | |
| 22 | rs2486448_CHB | 500 | 7169.7 | 1.058 | 10.13 | 30.38 | |
| 23 | rs4824001_CEU | 500 | 7341.8 | 1.081 | 10.35 | 31.06 | |
| 24 | rs6552216_CEU | 500 | 7465.9 | 1.098 | 10,51 | 31.54 | |
| 25 | rs1488299_CHB | 500 | 7620 | 1.119 | 10.71 | 32.13 | |
| 26 | rs1347201_CHB | 500 | 7626 | 1.119 | 10.72 | 32.15 | |
| 27 | rs315280_CHB | 500 | 7747 | 1.135 | 10,87 inch | 32.60 | |
| 28 | rs11203006_CHB | 500 | 7834.1 | 1.146 | 10.97 | 32.92 | |
| 29 | rs4240793_CHB | 500 | 8036.3 | 1.172 | 11.22 | 33.66 | |
| 30 | rs9325071 | 500 | 8219.4 | 1.194 | 11.43 | 34.30 | |
| 31 | rs12678324_CEU | 500 | 8394.5 | 1,215 | 11.64 | 34.91 | |
| 32 | rs4653130_CEU | 500 | 8455.5 | 1.223 | 11.71 | 35.12 | |
| 33 | rs9275596 | 500 | 8537.6 | 1.232 | 11,80 | 35.39 | |
| 34 | rs12595448_CHB | 500 | 8603.6 | 1.240 | 11.87 | 35.62 | |
| Volume van PCR Grade Rnase gratis H2O wordt toegevoegd Primer zwembad (µL) | 561.78 | ||||||
Tabel 6: goed 1 aangepaste inleidingen gebruikt om de representatieve resultaten te genereren. Een inhoudsopgave extensie inleidingen aangepast door omvang, met inbegrip van de concentratie van de doelgroep, het volume dat wordt gebruikt in de pool van de primer en eindconcentratie voor elke primer in het zwembad van de primer voor goed 1. De hoeveelheid water moet tot het eindvolume is verstrekt aan de onderkant van de tabel. Het totale volume van de primer zwembad was 1,5 mL.
| # | Uitbreiding Primers | Originele voorraad concentratie (µM) | Misc. | UEP_ MASSA | Doelgroep reactie concentratie (µM) | EXT Primer zwembad concentratie (µM) | Volume Stock Primer moet worden toegevoegd aan de Pool (µL) |
| 1 | rs10515597 | 500 | 4482.9 | 0.588 | 5,63 | 16.89 | |
| 2 | rs2759281_CEU | 500 | 4921.2 | 0.681 | 6.52 | 19.57 | |
| 3 | rs17641748 | 500 | 5080.3 | 0.713 | 6.83 | 20.48 | |
| 4 | rs1698042_CEU | 500 | 5201.4 | 0.737 | 7,05 | 21.16 | |
| 5 | rs5753625_CHB | 500 | 5411.6 | 0.776 | 7.43 | 22.30 uur | |
| 6 | rs3912537_CEU | 500 | 5811.8 | 0.848 | 8.12 | 24.35 | |
| 7 | rs6141319_CEU | 500 | 5883.8 | 0.860 | 8.23 | 24.70 | |
| 8 | rs1002587_CEU | 500 | 6026.9 | 0.884 | 8.46 | 25.39 | |
| 9 | rs1295686 | 500 | 6172 | 0.908 | 8,69 | 26.07 | |
| 10 | rs16877243_CEU | 500 | 6386.2 | 0.942 | 9.02 | 27.05 | |
| 11 | rs1103811 | 500 | 6595.3 | 0.974 | 9.33 | 27,98 | |
| 12 | rs6510332_CEU | 500 | 6790.4 | 1.003 | 9.61 | 28.82 | |
| 13 | rs6595142_CHB | 500 | 6874.5 | 1.016 | 9,72 | 29.17 | |
| 14 | rs4484738_CEU | 500 | 6966.5 | 1.029 | 9.85 | 29.55 | |
| 15 | rs1432975 | 500 | 7028.6 | 1.038 | 9.94 | 29,81 | |
| 16 | rs10879311_CEU | 500 | 7317.8 | 1.078 | 10.32 | 30.97 | |
| 17 | rs864481 | 500 | 7416.9 | 1.092 | 10,45 | 31.35 | |
| 18 | rs1295687 | 500 | 7447.8 | 1.096 | 10.49 | 31,47 | |
| 19 | rs12644851_CHB | 500 | 7634 | 1.120 | 10,73 | 32.18 | |
| 20 | rs4265409_CHB | 500 | 7926.2 | 1.158 | 11.09 | 33.26 | |
| 21 | rs2927385_CHB | 500 | 7997.2 | 1.167 | 11.17 | 33.52 | |
| 22 | rs1538956_CHB | 500 | 8286.4 | 1.202 | 11.51 | 34.54 | |
| Volume van PCR Grade Rnase gratis H2O wordt toegevoegd Primer zwembad (µL) | 899.42 | ||||||
Tabel 7: goed 2 aangepaste inleidingen gebruikt om representatieve resultaten te genereren. Een inhoudsopgave extensie inleidingen aangepast door omvang, met inbegrip van de concentratie van de doelgroep, het volume dat wordt gebruikt in de pool van de primer en eindconcentratie voor elke primer in het zwembad van de primer voor goed 2. De hoeveelheid water moet tot het eindvolume is verstrekt aan de onderkant van de tabel. Het totale volume van de primer zwembad was 1,5 mL.
| Master Mix | Lage Plex (1-18) | Hoge Plex (19-36) | ||
| Reagens | × 1 | × 410 | × 1 | × 410 |
| Water (gedeïoniseerd) | 0.7395 | 303.195 | 0,619 | 253.79 |
| Buffer | 0.2 | 82 | 0.2 | 82 |
| Beëindiging mix | 0.1 | 41 | 0.2 | 82 |
| Primer mix (LPA aangepast) | 0.94 | 385.4 | 0.94 | 385.4 |
| iPLEX enzym * | 0.0205 | 8.405 | 0,041 | 16.81 |
| Totaal | 2 ΜL | 820 ΜL | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tabel 8: reagentia en concentraties voor de extensie reactie master mix. In dit geval moeten de volumes voor lage-Plex reacties worden gebruikt als er 18 of minder SNPs in de put. Gebruik de hoge Plex reacties volumes voor 19 of meer SNPs. Dit is anders dan de eisen van de SNP van lage-plex en hoge-plex van de amplificatie PCR master mix gedetailleerd in tabel 2.
| Thermocycler voorwaarden |
| 94 ° C gedurende 30 s |
| 40 cycli van (94 ° C 5 s, (5 cycli van 52 ° C 5 s, 80 ° C 5 s)) |
| 72 ° C gedurende 3 minuten |
| 4 ° C houden |
Tabel 9: Thermocycler voorwaarden voor de uitbreiding-reactie
| Voedsel allergische gevallen versus niet-voedsel allergische besturingselementen | |||||
| SNP | A1 | P | OR | L95 | U95 |
| rs1295686 | A | 0.003 | 1,75 | 1.2 | 2,53 |
| rs2243297 | A | 0.13 | 2.1 | 0.8 | 5.51 |
| rs1295687 | G | 0.19 | 1.63 | 0.78 | 3.41 |
| rs2243211 | A | 0.22 | 1.45 | 0.8 | 2,64 |
| rs1295683 | T | 0,25 | 1.32 | 0.82 | 2.13 |
| rs2243248 | G | 0.51 | 1.21 | 0.69 | 2.11 |
| rs2243300 | T | 0.51 | 1.19 | 0,7 | 2.02 |
| rs1800925 | T | 0.6 | 1.11 | 0,75 | 1.63 |
| rs3091307 | G | 0.62 | 1.1 | 0,75 | 1.6 |
Tabel 10: Variant rs1295686 van de IL13 locus wordt geassocieerd met uitdaging-bewezen voedselallergie. Logistische regressieanalyse, gecorrigeerd voor afkomst, geslacht en aanwezigheid van atopic eczema, bleek dat variant rs1295686 wordt geassocieerd met uitdaging bewezen voedselallergie in de ontdekking cohort (n = 367 gevallen en 156 niet-allergische besturingselementen). De SNP-kolom staan de markeringen bestudeerd, in de A1-kolom staan de kleine allel, gebruikt als het referentie-allel voor de vereniging test. De P-kolom staan de P-waarden uit de regressie-analyse, de OR-kolom staan de corresponderende odds ratio's en L95 en U95 zijn de grenzen van het boven- en ondergrenzen van het 95% betrouwbaarheidsinterval van de analyse. Gegevens gereproduceerd van Ashely et al., 20179.
| A. replicatie analyse: voedsel allergische gevallen versus niet-voedsel allergische besturingselementen | B. Meta-analyse-ontdekking en replicatie | ||||||||||
| SNP | A1 | OR | L95 | U95 | P | P | P(R) | OR | OR(R) | Q | Ik |
| rs1295686 | A | 1.37 | 1.03 | 1.82 | 0.03 | 0.0005 | 0.0006 | 1.5 | 1.5 | 0.31 | 3.32 |
| rs1295687 | C | 1.1 | 0.68 | 1.78 | 0,7 | 0.3 | 0.3 | 1.24 | 1.24 | 0.38 | 0 |
Tabel 11: Replicatie in een onafhankelijke bevolking bevestigt associatie tussen IL13 variant rs1295686 en uitdaging-bewezen voedselallergie. Logistische regressie, gecorrigeerd voor de belangrijkste componenten van de afkomst, geslacht en atopische eczeem, in een onafhankelijke bevolking (n = 203 voedsel allergische gevallen en 330 niet-allergische besturingselementen) bevestigd van de associatie tussen variant rs1295686 en voedselallergie. Meta-analyse werd vervolgens uitgevoerd, bieden van het hoogste niveau van bewijs voor een associatie tussen de SNP en resultaat, met weinig bewijs van heterogeniteit in feite maten tussen de twee risicopopulaties deze SNP. Hier de kolommen zijn volgens de tabel 10, met extra P(R) en OR(R) waarden voor de willekeurige effecten meta-analyse model versus het model van de vaste effecten (P of). Q en ik zijn respectievelijk de P-waarde voor de Cochrane-test en de ik-index, beide zijn maatregelen van de heterogeniteit in effect maten tussen de studies. Gegevens gereproduceerd van Ashely et al., 20179.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier tonen we de methode van multiplexed genotypering met behulp van spectrometrie van de massa. De representatieve resultaten werden gegenereerd met behulp van PCR MALDI-TOF massa spectrometrie4 met assay chemie in de Tabel van materialen13genoemde gekoppeld. Met dit platform, we genereerden een totaal van 11,295 genotypen op 1,255 personen voor 9 SNPs binnen 40 h in het lab.
We illustreren het nut van de techniek bij de beantwoording van genetische hypotheses genereren en analyseren van SNP gegevens voor de kandidaat-gen IL13 in een ontdekking klinische cohort phenotyped voor voedselallergie en met onafhankelijke replicatie. Het platform is relatief robuust te verlagen van DNA kwaliteit en vereist minimale grondstof, een input van slechts 10 ng. Kritische stappen in het protocol zijn de volgende: voorzichtig oplossen van de problemen van het ontwerpproces van de bepaling om ervoor te zorgen maximale SNP opneming in de multiplexed testen, succesvolle versterking van de doelregio's tijdens de amplificatie van PCR, succesvolle single de uitbreiding van de nucleotide tijdens het uitbreiding reactie, en laden van de test en monster plaat lay-out in de analysesoftware om de software nauwkeurig de massaspectra gegevens toewijzen.
Zoals eerder vermeld is de assay design tool compatibel met het gebruik van de muis en boviene polymorfismen, daarnaast aan mens. Voor andere organismen zoals microbe of plant, kan "andere" in het menu "Organisme" worden geselecteerd. De automatische stappen voor het vinden van proximale SNPs en optimale primer gebieden identificeren zal echter niet mogelijk.
Tijdens het ontwerpproces, als een proximale SNP is het blokkeren van de identificatie van een optimale primer-ruimte, een kan ofwel de SNP verwijderen uit het ontwerp van en selecteert u een ander in hoge LD (bijvoorbeeld, r2 = 1), of ervoor kiezen om twee inleidingen, één met de referentie ontwerpen allel van de SNP en één met de alternatieve allel, het ontwerpen van een primer met het gemeenschappelijk allel of maskeren de SNP met een universele base (b.v., Inosine). Als er een probleem met het identificeren van een unieke site voor de primer, kunt een de amplicon lengte-instellingen om een unieke site te zoeken. De standaardinstelling is 80-120 bp, maar dit kan worden gewijzigd van 60-400 bp. Echter, opgemerkt moet worden dat als werken met aangetaste DNA (bvuit FFPE weefsel), is het niet ideaal de amplicon verlengen.
Fouten tijdens de assay ontwerp stap van het hulpprogramma bijvoorbeeld hoge haarspeld of primer dimeer potentiële. Beide instellingen kunnen worden versoepeld om te proberen een plaats de ontwerpen. Het wordt echter aanbevolen dat de drempels niet worden versoepeld hieronder 0.8; begin met 0.9 om te zien of deze instelling voldoende verminderen aan 0.8 alleen indien nodig te redden van de SNPs. In de geavanceerde instellingen is het mogelijk om te veranderen van het aantal ontwerp iteraties (maximaal 10) onder het Multiplex tabblad van de "4. Design Assays", evenals de beste selectie stopcriterium Hoogste gemiddelde Multiplex of Minst verwerpt door lage Plex. Verhoging van het aantal ontwerp iteraties kan nuttig zijn omdat de tool vindt de eerste SNP in de volgorde waarin deze zijn verstrekt en een bepaling zal ontwerpen. Vervolgens wordt het getest als de volgende SNP compatibel voor de dezelfde multiplex assay is. Dus de volgorde van de SNPs zaak. Meerdere iteraties optie is geselecteerd, zal de software de volgorde van SNPs randomize en probeer andere iteraties. Dit kan het verhogen van het aantal SNPs kunnen zodanig zijn ontworpen in elke multiplex of kan verminderen het aantal SNP verwerpt. Het komt echter ook op een tijd kosten, aangezien de design tool veel langer bij deze stap duren zal.
Multiplexed genotypering is een snelle en betaalbare aanpak voor onderzoek van de loci van belang. De methode is gestroomlijnd en kan de werking van ongeveer 760 monsters van maximaal 40-plex SNPs in 10 uur, tienduizenden genotypen moeten worden gegenereerd in minder dan een dag14het toelaat. De massaspectra kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd met hulpprogramma's die worden geboden door het platform.
Er zijn enkele beperkingen aan het platform bevatten een geschatte verlies van 5-10% van SNPs die het ontwerpproces assay zal mislukken. Dit kan soms worden gecorrigeerd door de selectie van een alternatieve tag of proxy SNP. De brede Instituut van SNP annotatie en Proxy zoeken (breuk)-database is een dergelijk instrument dat identificatie van proxy SNPs15wordt vergemakkelijkt. Een andere beperking van het systeem is dat het is een gerichte platform en daarom niet mogelijk is om uitgebreide nieuwe ontdekking, met genoom-brede benaderingen worden tot stand gebracht. Bovendien, zoals de aanpak tag-SNP proxy's gebruikt voor het maximaliseren van dekking over genen, boete-mapping studies kunnen vervolgens worden nodig om te bepalen de precieze causale variant.
Multiplexed genotypering is nog steeds een nuttig platform voor de ondervraging van ziekte geassocieerde SNPs geïdentificeerd in GWA studie benaderingen of hypothese gedreven kandidaat-lidstaten en traject gene exploratie. Toekomstige toepassingen voor de platform dreigen te worden van nieuwe toepassingen voor diagnostiek en screening op gebieden zoals kanker en klinische virologie. Over het geheel genomen is multiplexed genotypering met massaspectrometrie een snelle, rendabele en betrouwbare medium-doorvoer methode voor genotypering kandidaat loci.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen bevestigingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA | - | - | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | - | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | - | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
- Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
- Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).
- Kwon, J. M., Goate, A. M.
- Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY). Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).
- Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research. Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).
- Cricca, M., et al. High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method. New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).
- Ashley, S., et al. Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy. Clinical & Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).
- Bousman, C. A., et al. Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis. Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).
- Moffatt, M. F., et al. A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).
- Granada, M., et al. A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).
- Oeth, P., et al. iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators. Sequenom application note. 27, (2005).
- Ellis, J. A., Ong, B. The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping. Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).
- Johnson, A. D., et al. SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap. Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).
