Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Enkelt celle Multiplex Reverse transkription Polymerase Chain Reaction efter Patch-klemme

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57627
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver de kritiske trin og forholdsregler, der kræves for at udføre enkelt celle multiplex reverse transkription polymerase kædereaktion efter patch-klemme. Denne teknik er en enkel og effektiv metode til at analysere udtryk profil af en på forhånd fastlagt sæt af gener fra en enkelt celle karakteriseret ved patch-clamp optagelser.

Abstract

Hjernebarken er sammensat af mange celletyper udviser forskellige morfologiske, fysiologiske og molekylære funktioner. Denne mangfoldighed hæmmer nem identifikation og karakterisering af disse celletyper, forudsætninger for at studere deres specifikke funktioner. Denne artikel beskriver multiplex enkelt celle reverse transkription polymerase kæde reaktion (RT-PCR) protokol, som giver efter patch-clamp optagelse i skiver, at opdage samtidigt udtryk for snesevis af gener i en enkelt celle. Denne enkle metode kan gennemføres med morfologiske karakterisering og er almindeligt anvendes til at bestemme de fænotypiske træk af forskellige celletyper og deres særlige cellulære miljø, som i nærheden af blodkar. Princippet om denne protokol er for at optage en celle med patch-clamp-teknik til høst og vende transskribere sine cytoplasmatisk indhold, og for at opdage kvalitativt udtryk for et foruddefineret sæt af gener ved multiplex PCR. Det kræver en omhyggelig design af PCR primere og intracellulære patch-clamp løsning kompatibel med RT-PCR. For at sikre en selektiv og pålidelige udskrift kræver påvisning, denne teknik også passende kontrol fra cytoplasmaet høst til forstærkning trin. Selv om forholdsregler drøftet her skal følges nøje, kan stort set alle elektrofysiologiske laboratorium bruge den multiplex enkelt celle RT-PCR teknik.

Introduction

Hjernebarken består af mange celletyper involveret i forskellige fysiologiske processer. Deres identifikation og karakterisering, en forudsætning for forståelsen af deres specifikke funktioner, kan være meget udfordrende givet de store morfologiske, fysiologiske og molekylær mangfoldighed, der kendetegner kortikale celle typer1 ,2,3,4.

Encellede multiplex RT-PCR er baseret på kombinationen af patch-clamp og RT-PCR teknikker. Det kan sonde samtidigt udtryk for mere end 30 foruddefinerede gener i electrophysiologically identificerede celler5. Optagelse af neuronal røbestof i optagelse pipette yderligere tillader den morfologiske karakterisering af de optagne celler efter histokemiske åbenbaring6,7,8,9, 10. det er en meget nyttig teknik til klassifikation af neuronal baseret på multivariat analyse af deres fænotypisk træk5,9,10,11,12 ,13,14. Enkelt celle multiplex RT-PCR er også velegnet til karakterisering af ikke-neuronale celler såsom astrocytter15,16,17, og kan anvendes stort set hver hjerne struktur18, 19,20,21,22,23 og celle type, forudsat at de kan registreres i hele-celle konfiguration.

Denne teknik er meget bekvemt for identifikation af cellulære kilder og/eller mål for transmission systemer7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, især når specifikke antistoffer mangler. Det bygger på patch-clamp optagelser fra visuelt identificerede celler29, og dermed giver også mulighed for målretning af celler i en specifikke cellulære miljø8,15,16. Desuden da cytoarchitecture af hjernevæv er bevaret i hjernen skiver, denne tilgang giver også mulighed for undersøgelse af de anatomiske relationer karakteriseret celler med neuronal og ikke-neuronal elements7,8 , 18.

Da denne teknik er begrænset af mængden af høstede cytoplasma og af effektiviteten af RT, kan påvisning af mRNA udtrykt på lav kopi antallet være svært. Selv om andre strategier baseret på RNaseq teknologi gør det muligt for at analysere den hele transkriptom af enkelt celler3,4,30,31, de har brug for høj overførselshastighed dyre sequencere ikke nødvendigvis rådighed for hvert laboratorium. Da enkelt celle multiplex RT-PCR teknik bruger end-point PCR, kræver det kun bredt tilgængelige termocyklere. Det nemt kan udvikles i laboratorier udstyret med elektrofysiologiske set-ups og kræver ikke dyrt udstyr. Det kan give, inden for en dag, en kvalitativ analyse af udtryk af et foruddefineret sæt af gener. Således, denne tilgang tilbyder nem adgang til molekylær karakterisering af enkelt celler i en hurtig måde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer ved hjælp af dyr blev udført i nøje overensstemmelse med fransk lovgivning (kode landdistrikterne R214/87 til R214/130) og i overensstemmelse med de etiske retningslinjer for både det europæiske økonomiske Fællesskab (86/609/EØF) og det franske nationale Charter om de etiske aspekter af dyreforsøg. Alle protokoller blev godkendt af Charles Darwin etiske udvalg og forelagt det franske ministerium for uddannelse og forskning (godkendelse 2015 061011367540). IBPS dyr facilitet er akkrediteret af de franske myndigheder (A75-05-24).

1. indledende betragtninger

Bemærk: For at undgå kontaminering, svare til de følgende anbefalinger, før virksomheden enkelt celle RT-PCR efter patch-klemme.

  1. Brug ikke plasmider indeholder gener af interesse i laboratoriet, som de er en potentiel kilde til forurening.
  2. Reservere en lab bænk fra gel elektroforese værelse at forberede PCR'er.
  3. Dedikere et sæt pipetter og aerosol resistente filter tips til at manipulere DNA og RNA ved koncentrationer lavere end 1 ng/µL. Aldrig bruge disse til at analysere PCR produkter.
  4. Altid bruge RNase - og DNase-fri produkter og handsker.
  5. Bruge dedikeret kemikalier for at forberede interne patch-clamp løsninger. Aldrig brug en spatel, men snarere vejer papir for at vejer pulvere.
  6. Bruge en dedikeret pH elektrode og pH standard løsninger, som de kan være en kilde til forurening (fxRNase).
  7. Butik borsilikatglas kapillærerne; 20 µL lange, fine og fleksibel tips; en 20 µL mikropipette; en hjemmelavet kage (patch-clamp pipette indehaveren er knyttet til en 10 mL sprøjte); 500 µL PCR rør; 10 µL aerosol resistente filter tips; og tynde permanent markører i en dedikeret boks (figur 1).

2. primer Design

Bemærk: Multiplex RT-PCR bygger på to forstærkning trin. Under den første PCR forstærkes alle gener af interesse Co ved at blande sammen alle PCR primere. For at registrere pålideligt udskrifter fra enkelte celler, er det vigtigt at udforme effektive og selektiv PCR primere. Brug af indlejrede (intern) primere for de anden runder af PCR forbedrer både specificitet og effektiviteten af forstærkningen.

  1. Hente kurateret mRNA sekvenser af gener af interesse i NCBI Reference Sequence Database32 samt deres relaterede familiemedlemmer (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. Angiv navnet på molekylærgenetisk og arter af interesse som en forespørgsel og klik på den hentede relevante sekvens.
    2. For at begrænse analysen til den kodende sekvens af molekylærgenetisk, klik på Send til (øverste højre hjørne) og vælg kodning sekvenser og FASTA nukleotid som format. Derefter Klik på Oprette fil og Gem FASTA sekvensen ved hjælp af filtypenavnet ".nt".
  2. Brug MACAW software33 (flere justering byggeri & analyse Workbench) eller enhver anden flere justering software til at bestemme regionerne af homologi.
    1. Klik på fil | Nyt projekt... og vælg DNA som sekvens. Hvis du vil importere gensekvenser, Vælg sekvens | Importer sekvens... og indlæse en fil med ".nt". Gentag proceduren for alle relaterede sekvenser.
    2. Klik og træk alle sekvenser i den skematiske vindue til at vælge de hele sekvenser.
    3. Søg regioner af homologi ved at vælge justering | Søg efter blokke... (CTRL + S). Vælg Segment par overlapper i Søgemetode. Justere den Pairwise score cutoff til en forholdsvis høj værdi (fx1.000) og Min. seqs. pr. blok til det samlede antal sekvenser til at justere, og klik på begynder.
    4. I vinduet vises Søgeresultatet vælge resultat med den højeste MP-score og klikke på linket. Hvis intet resultat er fundet, mindske den Pairwise score cutoff og/eller Min. seqs. pr blok.
    5. For at lette visualisering af homologe regioner, Vælg justering | Skygge | Betyde score.
    6. Vælg ikke-sammenkædede dele af sekvenser og gentage trin 2.2.3–2.2.4 Bestem potentielt andre regioner af homologi med en lavere MP-score.
    7. For at opnå de mest specifikke primere, Vælg regioner med den mindste sekvens homologi.
  3. Lange sekvenser af alle splice varianter og gentage trin 2.2.1–2.2.6. Vælg deres fælles områder for en overordnet registrering. Overveje alternative kassetter til dedikeret splice varianter analyser20,34,35,36.
  4. Juster mRNA sekvenser på dyremodel genom ved hjælp af BLAST37 genomer (grundlæggende lokale Alignment Søg Tool) til at bestemme strukturen intron-exon af gener (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. Vælg BLAST mus genom ved at klikke på musen og overføre den hentede FASTA sekvens i afsnittet Indtaste forespørgslen sekvens . I Programmet udvælgelse, vælge Optimer for meget lignende sekvenser (megablast), og klik derefter på knappen BLAST .
    2. Vælg justering med det højeste identitet i afsnittet beskrivelser (op til 100%). Sørg for, at det svarer til gen af interesse som anført i funktioner i afsnittet linjeføringer .
    3. Sortere justering af forespørgsel startposition i samme afsnit at opnå exons arven af den kodende sekvens. Bemærk, at start- og slutpositioner af alle hits, der nogenlunde svarer til placeringen af introns på forespørgsel sekvens (figur 2A).
  5. Vælg to forskellige exons for de følelse og antisensstoffer primere til at differentiere nemt cDNA fra genomisk DNA (gDNA) forstærkning baseret på en størrelse kriterium (figur 2).
    Bemærk: Forstærkning af gDNA kan forekomme på en lav frekvens, når kernen er høstet med cytoplasma. Det er således vigtigt at designe intron overspanning primer par (figur 2A). I tilfælde af intron-mindre gener er indsamling af kernen problematisk, da det kan føre til potentielt forstyrrende resultater. For at løse dette problem, omfatte et sæt primere sigter mod at forstærke en intronic sekvens til probe for tilstedeværelsen af gDNA25. Hvis kontrolelementet genomisk er positive, skal resultater for alle intron-mindre gener kasseres.
  6. For at opnå en effektiv forstærkning, skal du vælge primere generere amplikoner med en længde, der er ideelt sammensat mellem 200 og 400 basepar (figur 2).
  7. For at forstærke samtidig forskellige cDNAs under trinnet multiplex-PCR, design primere med en længde mellem 18 og 24 nukleotider og en smeltende temperatur (Tm) mellem 55 og 60 ° C.
  8. For at minimere dannelsen af sekundære strukturer, der reducerer forstærkning udbytte, Vælg følelse og antisense primere med minimal hårnål og duplex længder (figur 2B).
  9. Design indre primere ved hjælp af de samme kriterier (trin 2,5-2,8).
  10. Kontrollere specificiteten af PCR-primere ved at tilpasse primere på referencedatabase RNA sekvens af organisme af interesse ved hjælp af et nukleotid BLAST.
    1. I BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), klik på nukleotid BLAST. Indsæt sekvensen af en primer i Indtaste forespørgslen sekvens.
    2. I afsnittet Vælg Søg indstille Klik på andre (nr etc.), Vælg Reference RNA sekvenser (refseq_rna) i den Database og angive organismen (f.eks. Mus musculus (taxid:10090) ) at begrænse analysen til den ønskede arter.
    3. Vælg Optimer for noget lignende sekvenser (blastn)i Programmet udvalg . Reducere ord størrelse ned til 7 for at øge chancen for at få hits i afsnittet algoritme parametre .
  11. Hold kun dem, hvis rækkefølge har mindst 3 uoverensstemmelser med uønskede cDNAs når det er muligt for at designe selektiv primere.
  12. Bestil afsaltede primere i en relativt høj koncentration (fx, 200 µM) at sikre, at alle eksterne primere kan være blandet sammen i en endelig koncentration på 1 µM.

3. forberedelse af RT reagenser

  1. 5 x RT-mix: forberede i RNase-fri vand 400 µL af arbejder RT mix løsning (5 x) der indeholder tilfældige primere på 25 µM og dNTP'er på 2,5 mM. Gemme dette arbejde mix som 20 µL delprøver i 500 µL rør.
  2. 20 x Dithiothreitol (DTT): forberede 1 mL 0,2 M DTT i RNase-fri vand og gemme det som 50 µL delprøver.
  3. Gemme 2.500 U af RNase inhibitor (40 U/µL) og 10.000 U af reverse transkriptase (RTase, 200 U/µL) som 5 µL delprøver.
  4. For at sikre en optimal kvalitet af RT reagenserne, lagre alikvoter ved-80 ° C. Bruge dem til op til 10 celler og kun én dag.

4. PCR validering

  1. Forberede cDNAs ved at gøre en reverse transkription på en forholdsvis stor mængde af total RNA (typisk 1 µg) udvundet38 fra strukturen af interesse.
    1. Brug ikke pipetter dedikeret til enkelt celle RT-PCR til disse indledende trin, men bruge RNase-fri pipetter. Fortynd total RNA ned til 1 µg/µL.
    2. I en 500 µL PCR rør, tilsæt 1 µL fortyndede total RNA og 8 µL af RNase-fri vand. Denaturere ved 95 ° C i 1 min og køle ned i røret på is.
    3. Tilføj 4 µL af RT 5 x buffer leveret af fabrikanten, 4 µL af RT mix løsning, 1 µL af RTase, 1 µL af RNase inhibitor og 1 µL af 200 mM DTT (Se afsnit 3).
    4. Svip til røret, spinde det, og der inkuberes natten over ved 37 ° C.
    5. Opbevar cDNAs ved-80 ° C i op til flere år. Forberede en alikvot af cDNAs fortyndet til 1 ng/µL af samlede RNA'er ækvivalenter.
  2. Blandes og fortyndes hvert primer par på 1 µM med pipetter dedikeret til enkelt celle RT-PCR. Bruge 20 µL af hver primer mix for 100 µL PCR'er.
  3. På is, forberede for hvert tabelpar, primer en premix indeholder: vand (Qs, 80 µL), 10 µL af 10 X buffer, 1 µL af 100 x dNTPs (50 µM hver), 500-1.000 pg af cDNA fortyndet til 1 ng/µL og 0,5 µL (2,5 U, 5 U/µL) af Taq-polymerase.
  4. Brug PCR rør, der stramt passer wells af PCR-maskine til en optimal temperaturkontrol. Tilsæt 2 dråber (~ 100 µL) af mineralsk olie til premix uden at røre væggen eller hætten af PCR rør.
  5. For at minimere dannelsen af primer-dimerer, udføre en hot start ved at placere PCR-rør i thermocycler forvarmet ved 95 ° C. Efter 30 s, hurtigt udvise 20 µL af primer blanding på toppen af olien.
  6. Efter 3 min. ved 95 ° C, køre 40 cyklusser (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) efterfulgt af en sidste brudforlængelse trin ved 72 ° C i 5 min.
  7. Analysere 10 µL af hver PCR produkter ved agarosegelelektroforese gel elektroforese (2%, vægt/volumen)39. Hvis nogle PCR produkter ikke har den forventede størrelse, re-designe andre primere (Se afsnit 2).
    Forsigtig: Ethidiumbromid er et intercalating kemikalie, der kan fremkalde DNA mutationer. Konsultere den lokale sikkerhed kontor før du bruger den. Altid bære handsker, når manipulere den. Brug en kommercielt anvendelig løsning af ethidium bromid (10 mg/mL) løsning i stedet for pulver til at minimere risikoen for indånding. På samme måde, UV-lys kan være skadelige, så sørg for at bære UV beskyttelse sikkerhedsbriller eller en maske. Trække snavset geler, tips, handsker og buffer i beholdere dedikeret til ethidium affald.
  8. Når alle primer par har valideret individuelt, teste multiplex-protokollen (figur 3).
    1. Blandes og fortyndes alle eksterne primere sammen på 1 µM. butik multiplex-primere blandes ved-20 ° C i op til flere uger.
    2. På is, forberede en premix indeholder: vand (Qs, 80 µL), 10 µL af 10 X buffer, 1 µL af 100 x dNTPs (50 µM af hver), 500-1.000 pg af cDNAs fortyndes 1 ng/µL og 0,5 µL (2,5 U, 5 U/µL) af Taq-polymerase.
    3. Svirp PCR rør og spinde det tilsættes to dråber (~ 100 µL) af mineralsk olie.
    4. Udføre en hot start som beskrevet i trin 4.5 med 20 µL af multiplex primer mix. Efter 3 min. ved 95 ° C, køre 20 PCR cyklusser identiske med dem i trin 4.6.
    5. Forberede en række PCR rør identisk med antallet af gener til at analysere. Forberede en premix som i trin 4.8.2, men bruger 1 µL af den første PCR produkt pr. gen som skabelon. Justere alle diskenheder efter antallet af gener til at analysere og overveje at bruge 10% ekstra volumen til at kompensere for pipettering fejl.
    6. Ryst forsigtigt, spin røret, afsende 80 µL af premix i hver PCR rør og tilføje to dråber (~ 100 µL) af mineralsk olie pr tube uden at røre væggen eller hætten af rørene.
    7. Udføre en varm start (Se trin 4.5) ved at smide 20 µL af interne primer blanding forberedt i trin 4.2. Køre 35 PCR cyklusser identisk med trin 4.6.
    8. Analysere de anden PCR produkter ved agarosegelelektroforese gelelektroforese. Sørg for, at hver anden PCR genererer en amplikon af den forventede størrelse. I tilfælde af ineffektive eller uspecifik klarlægger, re-designe nye primere (trin 2,5-2.12) og validere dem. (trin 4.2-4.8).

5. udarbejdelse og validering af intracellulære Patch-clamp løsning

Bemærk: Følgende protokol beskriver udarbejdelse og validering af en K+/gluconate baseret intern løsning, men stort set alle typer af patch-clamp løsning kan bruges, så længe det ikke hæmmer effektiviteten af RT-PCR. Iført handsker er obligatorisk for at opnå en RNase-fri intern løsning.

  1. 60 mL intern patch-clamp optagelse opløsning, forberede dyrlægeordination 10 mL af 0,1 M KOH.
  2. 11,4 mg EGTA (0,5 mM endelige) i 0,9 mL af 0,1 M KOH opløses.
  3. Tilsættes 40 mL RNase-fri vand og opløse 2,02 g K-gluconat (144 mM endelige), 143 mg af HEPES (10 mM endelige) og 180 µL 1 M MgCl2 (3 mM endelige).
  4. PH indstilles til 7.2 ved at tilføje ~ 6 mL af 0,1 M KOH.
  5. Justere osmolaritet til 295 mOsm med ~ 13 mL RNase-fri vand.
  6. Da den interne løsning bruges også som en buffer til reverse transkription, omhyggeligt kontrollere Mg2 + koncentration. Kompensere for lavere Mg2 + koncentration i opløsningen indre ved at tilføje MgCl2 bagefter for at nå frem til en endelig koncentration på 2 mM i RT reaktion.
  7. For at mærke cellen høstet efter patch-clamp optagelse, skal du tilføje 2-5 mg/mL af RNase-fri biocytin til den interne løsning beskrevet ovenfor (trin 5.1-5.5).
  8. Interne Opløsningen filtreres (0,22 µm porestørrelse) og gemme det på-80 ° C som 100 – 250 µL delprøver.
  9. For at godkende brugen af den interne løsning til én celle RT-PCR, tilføje 0,5 µL af samlede RNA'er fortyndet til 1 ng/µL til 6 µL af patch-clamp løsning og forlade det på bænken i ca 30 min.
  10. Med en 2 µL mikropipette, tilføje 2 µL af 5 x RT-mix, 0,5 µL af 20 x DDT, 0,5 µL RNase inhibitor og 0,5 µL RTase, og der inkuberes natten over ved 37 ° C.
  11. Spin røret. Tilsæt vand (Qs, 80 µL), 10 µL af 10 X buffer og 0,5 µL (2,5 U, 5 U/µL) af Taq-polymerase på is.
  12. Udføre 40 cyklusser af PCR ved hjælp af et sæt af validerede primere (trin 4,4-4,6).
  13. Analysere PCR produkter ved agarosegelelektroforese gelelektroforese (Se trin 4.7), og kontroller, at de har den forventede størrelse.
    Bemærk: Udelade de 0,5 µL af total RNA og erstatte det med 0,5 µL RNase-fri vand vil sikre, at den interne løsning er fri for RNA og/eller DNA forureninger.

6. akut skive forberedelse

Bemærk: Denne protokol beskriver udskæring proceduren for juvenile (dvs.mindre end 28 postnatal dage) mandlige og kvindelige mus. Andre skære løsninger, såsom saccharose-baserede kunstige cerebrospinalvæske (aCSF) er også brugbar40.

  1. Forberede 2 L af aCSF der indeholder (i mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 glukose og 15 saccharose. For at reducere glutamatergic aktivitet under skive forberedelse, forberede en skæring løsning ved at tilføje 1 mM af kynurenic syre.
  2. Før udskæring, forberede en dissektion kit indeholdende kirurgisk saks, fine iris saks, to spatler, pincet, en skive af papirfilter og ren lim.
  3. Bruge iskold skæring løsning mættet med O2/CO2 (95% / 5%) og køle ned Skærekammer ved-20 ° C.
  4. Bedøver musen med et lille stykke køkkenrulle gennemblødt med isofluran. Efter ~ 2 min, Sørg for, at musen er under dyb anæstesi ved at verificere fravær af svar til pote knivspids.
  5. Hurtigt halshugge musen. Fjerne hovedbunden og åbne kraniet. Uddrag hjernen omhyggeligt og læg det i et lille bæger, fyldt med iskolde (~ 4 ° C) skære løsning iltet med O2/CO2.
  6. Fjerne Skærekammer fra-20 ° C betingelser og fjerne fugt med et stykke køkkenrulle.
  7. Omhyggeligt dissekere hjernen for at isolere det pågældende område, lim det på Skærekammer og tilføje iskold skæring løsning iltet med O2/CO2.
  8. Skåret 300 µm tykke skiver ved hjælp af en vibratome. Overføre dem ved stuetemperatur i en hvilende kammer fyldt med iltet skæring løsning og tillade dem at genvinde til mindst 0,5 h.

7. enkelt celle RT-PCR efter Patch-clamp optagelse

  1. Rense perfusion system regelmæssigt med ~ 100 mL 30% H2O2 løsning og skyl grundigt med ~ 500 mL destilleret vand for at undgå bakterievækst, da det er en overset kilde af RNase forurening.
  2. Chlorinate glødetråden med patch pipette fyldt med koncentreret blegemiddel dagligt høst. Brug ikke en mikropipette til at fylde patch pipette, men snarere en 20 µL lange, fine, bøjelige spids knyttet til en 1 mL sprøjte. Derefter skylle det grundigt med RNase gratis vand og tør det med en gas duster.
  3. Forberede en lille kasse med isen indeholdende 5 x RT-mix og 20 x DTT delprøver. Gemme RTase og RNase hæmmer alikvoter ved-20 ° C i en benchtop køligere.
  4. Overføre en skive i optagelse kammer perfunderet på 1-2 mL/min. med iltet aCSF.
  5. Træk patch pipetter (1 – 2 µm åbne tip diameter, 3 – 5 MΩ) fra borsilikatglas mens iført handsker og fyld en af dem med 8 μL af intern løsning. Husk på at knopper af pipette puller er en kilde af RNase forurening.
  6. Placere pipetten i indehaveren pipette mens iført nye handsker og ikke røre glødetråden med fingrene.
  7. Nærme sig patch pipetten med et positivt pres og udføre hele-celle optagelse for at karakterisere den målrettede celle (figur 4).
  8. For at bevare mRNAs, begrænse tid i hele-celle konfiguration til 20 min.41.
  9. I slutningen af optagelsen, forberede en 500 µL PCR rør fyldt med 2 µL af 5 x RT Mix og 0,5 µL af 20 x DTT, spinde det, og opbevar den på is.
  10. Høste cellen cytoplasma ved at anvende en blid undertryk (figur 4). Visuelt kontrollere, at cellens indhold kommer inde pipetten samtidig opretholde en tæt forsegling.
    1. Undgå så vidt muligt indsamle kernen, hvis nogle intron-mindre gener betragtes. I sådanne tilfælde altid omfatte et sæt primere sigter mod at forstærke gDNA at sonden for genomisk forurening.
    2. Hvis kernen kommer tæt på spidsen af pipetten, den negative trykket og flytte pipette fra kernen. Sikre, at den stramme segl er bevaret og genstarte for at indsamle cytoplasma på det nye sted, pipette.
  11. Stop høst når ikke er mere materiale der kommer og/eller før du mister en tæt forsegling.
  12. Trække pipette forsigtigt for at danne en udenfor-out programrettelse til at begrænse forurening af de ekstracellulære vragrester (figur 4) og at favorisere lukningen af cellemembranen til efterfølgende histokemiske analyse.
  13. Husk på, at knopper, micromanipulators, computertastatur, eller computermus er potentielle forureningskilder RNase. Hvis de har været rørt under optagelsen, ændre handsker.
  14. Vedhæfte pipetten til kage og udvise sin indhold ind i PCR rør ved at anvende et positivt pres (figur 1).
  15. Bryde spidsen af pipetten ind i PCR rør til at hjælpe med indsamlingen af dens indhold.
  16. Kort centrifugeres røret, tilsæt 0,5 µL af RNase hæmmer og 0,5 µL af RTase, blandes forsigtigt, centrifugeres igen, og der inkuberes natten over ved 37 ° C.
  17. Spin røret og opbevar den ved-80 ° C i op til flere måneder indtil PCR analyse.
  18. Udfør den første forstærkning trin direkte i rør indeholdende ~ 10 µL af RT produkter ved tilsætning af vand (Qs, 80 µL), 10 µL af 10 x buffer og 0,5 µL (2,5 U) af Taq-polymerase. Følg derefter de instruktioner, der er beskrevet i trin 4.8.2–4.8.8.

8. histokemiske farvning af den registrerede celle (valgfri)

  1. Efter de elektrofysiologiske optagelser, opretholde skive i 20 min. i iltet aCSF at tillade udbredelse af biocytin i træet cytoskeletale og dendritiske.
  2. Placer udsnittet i et godt af en 24-godt plade og fix det natten over ved 4 ° C med 1 mL af 4% PARAFORMALDEHYD i 0,1 M fosfat Buffer.
  3. Vask skiver 4 gange, 5 min hver, med 1 mL fosfat Buffered saltvand (PBS).
  4. I det samme godt, permeabilize og mætte skive i 1 time ved stuetemperatur med 1 mL PBS suppleret med 0,25% Triton X-100 og 0,2% gelatine fra koldt vand fisk hud (PBS-GT).
  5. Der inkuberes natten over med en fluorescently mærket begærlighed fortyndet på 1/400 i 250-500 µL af PBS-GT.
  6. Vask 5 gange, 5 min hver med 1 mL PBS og montere skiver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En repræsentativ validering af multiplex RT-PCR er vist i figur 3. Protokollen var designet til at probe samtidigt udtryk for 12 forskellige gener. Vesikulær glutamat transporter vGluT1 blev taget som en positiv kontrol for glutamatergic neuroner42. GABA syntese enzymer (GAD65 og GAD 67), neuropeptid Y (NPY) og Somatostatin (SOM) blev brugt som markører for GABAergic interneurons3,5,11. Cyclooxygenase-2 enzym (COX-2) blev brugt som en markør for pyramideformede celle delpopulation3,16.

ATP1α1-3 underenheder af Na+/K+ ATPase og Kir6.2 og SUR1 underenheder af ATP-følsomme K+ kanaler blev valgt at vurdere forholdet mellem neuronal aktivitet og metaboliske stater43. Da Kir6.2 er en intron-mindre gen, blev SOM intron inkluderet som en genomisk kontrol. Protokollen er blevet testet på 1 ng af reverse transskriberede total RNA ekstraheret fra mus hele hjernen, hvilket svarer ca til udskrifter af 20 celler44. Multiplex-PCR produceret 12 amplikoner af den forventede størrelse (figur 3 og tabel 1) demonstrere følsomhed og effektivitet i protokollen. Den negative kontrol udføres uden RNA produceret ingen amplikon (data ikke vist).

Et lag V pyramideformet neuron var visuelt identificeret ved sin store soma og en fremtrædende apikale dendrit (figur 5A, inset). Hele cellen optagelse afslørede typisk elektrofysiologiske egenskaber af lag V regelmæssig spiking neuroner5,45,46 , især, en lav input modstand, langvarig handling potentialer og udtalt spike frekvens tilpasning (figur 5A). Molekylær analyse af dette neuron afslørede udtryk for vGluT1 (figur 5B), bekræfter sin glutamatergic fænotype42,46. Dette neuron også udtrykt SOM, ATP1α1 og 3 underenheder af Na+/K+ ATPase. Biocytin mærkning af de registrerede neuroner bekræftet en pyramideformet morfologi (fig. 5 d).

Som forventet fra glutamatergic neuroner, afsløret Molekylær analyse af 26 lag V pyramideformet celler udtryk for VGluT1, men ingen af de to GADs (figur 5 c). Markører for interneurons blev sjældent observeret5,42,46. COX-2, hovedsagelig udtrykt af layer II-III pyramideformet celler3,16, blev ikke fundet i lag V pyramideformet celler. ATP1α1 og 3 underenheder blev mere hyppigt bemaerket end ATP1α2 subunit3. Kir6.2 og SUR1 underenheder blev sjældent fundet i lag V pyramideformet neuroner, som er i overensstemmelse med deres privilegerede udtryk i øverste lag3,43. Omhu ikke at høste de kerner, hvilket resulterer i en sjælden påvisning af SOM introner (3 ud af 26 celler, dvs., 12%).

Figure 1
Figur 1: dedikeret boks for enkelt celle RT-PCR. Liste over materialer forbeholdt RT-PCR efter patch-klemme. (1) borsilikatglas kapillærer, (2) 20 µL lange, fine, bøjelige tips, (3) 20 µL mikropipette, (4) hjemmelavet kage, (5) 500 µL PCR rør, (6) 10 µL aerosol resistente filter tips, og (7) permanent markører. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: PCR primer design strategi. (A) skematisk fremstilling af den kodende sekvens af COX 2 cDNA justeret til musen kromosom 2 sekvens indeholdende COX 2-genet. Exons er repræsenteret af sorte bokse og introner på gDNA ved hvide bokse. Bemærk hullerne i cDNA svarende til de intronic sekvenser på gDNA. Repræsentative eksempler på dårlig og god oligonukleotider repræsenteret som røde og grønne pile, henholdsvis. Højre og venstre pile betegne frem og bak primere. (B) sekvenser og sekundære strukturer af oligonukleotider vist i (A). Venstre og højre paneler angiver hårnål self-komplementaritet og self-dimer dannelse, henholdsvis. B1 oligonukleotid viser både en stærk hårnål self-komplementaritet og dimer dannelse, mens B2 oligonukleotid viser kun dimer dannelse. Både B3 og B4 oligonukleotider har ingen hårnål self-komplementaritet og ingen dimer dannelse; de er intron overspanning (A) og er blevet udvalgt som potentiel PCR-primere (Se tabel 1). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: validering af multiplex PCR. 1 ng af total RNA fra mus hele hjernen blev udsat for en reverse transkription efterfulgt af to runder af PCR-amplifikation. De 12 PCR produkter blev løst i separate baner ved agarosegelelektroforese gelelektroforese parallelt med Φx174 fordøjet af HaeIII. De anden PCR produkter havde størrelser (i bp) forudsagt af sekvenser: 153 (vGluT1), 248 (GAD65), 255 (GAD67), 181 (COX 2), 220 (NPY), 146 (AS), 183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2), 128 (ATP1a3), 342 (Kir6.2), 211 (SUR1) og 182 (SOMint). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Patch-clamp høst i hjernen skiver. Når en celle er visuelt identificeret, er optagelsen pipette nærmede sig med et positivt pres for at undgå celleaffald forurening på spidsen af en pipette. Bemærk dimple på membranen af dette neuron. Overtryk er derefter afbrydes for at danne en celle-attached konfiguration med et Gigaohm tæt forsegling. Korte sugeledninger anvendes for at skifte til hele-celle konfiguration. I slutningen af optagelsen, er cytoplasma høstet ved at anvende en blid undertryk i pipetten samtidig opretholde en tæt forsegling. Bemærk svind af cellen kroppen under den høstning procedure. Optagelse pipette trækkes derefter forsigtigt for at danne en udenfor-out patch, som favoriserer cellemembranen lukning for efterfølgende biocytin åbenbaring, og bevarelse af høstede materiale i patch pipette. Gengivet fra Cauli og Lambolez47 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Karakteristik af lag V neocortical pyramideformet celler. (A) membran potentielle respons af et lag V pyramideformet celler induceret af nuværende pulser af -100,-40, -10, + 60, 120 og + 500 pA (bunden spor). Neuron viser en svag potentielle fordrejning efter den første hyperpolarizing reaktion (øvre spor). Som svar på en supraliminal depolarisering udledes neuron langvarig handling potentialer med langsomt udvikle efter hyperpolarisering (øvre trace). I nærheden af mætning, neuron udledes på en lav frekvens og udstillet en udtalt tilpasning (øvre grå trace). Indsatser: infrarøde billeder af registrerede lag V pyramideformet neuron. Pial overfladen er opad. Skalalinjen: 20 µm. (B) Multiplex RT-PCR analyse afsløre udtryk for vGluT1, SOM, ATP1α1 og ATP1α3. (C) gen expression profil i en stikprøve på 26 lag V pyramideformet celler. vGluT1 kom til udtryk i alle neuroner mens GAD65, GAD67 og COX2 blev aldrig opdaget. NPY, SOM, Kir6.2, SUR1 og SOMint observeret sjældent. Pyramideformet celler udtrykt ATP1α3, 1 underenhed af Na+/K+ ATPase, og ATP1α2 i et mindre omfang. (D) maksimal intensitet projektion af Konfokal billeder viser biocytin mærkning af neuron registreres i (A). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Gen / GenBank antallet Eksterne primere Størrelse (bp) Interne primere Størrelse (bp)
vGlut1
NM_182993		 Forstand,-113 259 Forstand,-54 153
GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC ATTCGCAGCCAACAGGGTCT
Antisense, 126 Antisense, 79
CCAGCCGACTCCGTTCTAAG TGGCAAGCAGGGTATGTGAC
GAD65
NM_008078		 Forstand, 99 375 Forstand, 219 248
CCAAAAGTTCACGGGCGG CACCTGCGACCAAAAACCCT
Antisense, 454 Antisense, 447
TCCTCCAGATTTTGCGGTTG GATTTTGCGGTTGGTCTGCC
GAD67
NM_008077		 Forstand, 529 598 Forstand, 801 255
TACGGGGTTCGCACAGGTC CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC
Antisense, 1109 Antisense, 1034
CCCAGGCAGCATCCACAT AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC
COX 2
NM_011198		 Forstand, 199 268 Forstand, 265 181
CTGAAGCCCACCCCAAACAC AACAACATCCCCTTCCTGCG
Antisense, 445 Antisense, 426
CCTTATTTCCCTTCACACCCAT TGGGAGTTGGGCAGTCATCT
NPY
NM_023456		 Forstand, 16 294 Forstand, 38 220
CGAATGGGGCTGTGTGGA CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT
Antisense, 286 Antisense, 236
AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA
SOM
NM_009215		 Forstand, 43 208 Forstand, 75 146
ATCGTCCTGGCTTTGGGC GCCCTCGGACCCCAGACT
Antisense, 231 Antisense, 203
GCCTCATCTCGTCCTGCTCA GCAAATCCTCGGGCTCCA
ATP1Α1
NM_144900 		Forstand, 1287 288 Forstand, 1329 183
CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA TAAGCGGGCAGTAGCGGG
Antisense, 1556 Antisense, 1492
CCGTGGAGAAGGATGGAGC AGGTGTTTGGGCTCAGATGC
ATP1Α2
NM_178405		 Forstand, 1392 268 Forstand, 1430 213
AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG AAATCCCCTTCAACTCCACCA
Antisense, 1640 Antisense, 1623
ACAGAAGCCCAGCACTCGTT GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC
ATP1Α3
NM_144921		 Forstand, 127 216 Forstand, 158 128
CGGAAATACAATACTGACTGCGTG TGACACACAGTAAAGCCCAGGA
Antisense, 324 Antisense, 264
GTCATCCTCCGTCCCTGCC CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA
Kir6.2
NM_010602		 Forstand, 306 431 Forstand, 339 342
CGGAGAGGGCACCAATGT CATCCACTCCTTTTCATCTGCC
Antisense, 719 Antisense, 663
CACCCACGCCATTCTCCA TCGGGGCTGGTGGTCTTG
SUR1
NM_011510		 Forstand, 1867 385 Forstand, 2041 211
CAGTGTGCCCCCCGAGAG ATCATCGGAGGCTTCTTCACC
Antisense, 2231 Antisense, 2231
GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG
SOMint
X51468		 Forstand, 8 240 Forstand, 16 182
CTGTCCCCCTTACGAATCCC CTTACGAATCCCCCAGCCTT
Antisense, 228 Antisense, 178
CCAGCACCAGGGATAGAGCC TTGAAAGCCAGGGAGGAACT

Tabel 1. Sekvenser af første og anden PCR primere. Placeringen af hvert PCR primer og deres sekvenser er givet fra 5' til 3'. Med undtagelse af somatostatin intron svarer position 1 til den første base af start codon af hvert Gen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Enkelt celle multiplex RT-PCR efter patch-clamp kan samtidigt og pålideligt sonde udtryk for mere end 30 gener i electrophysiologically identificerede celler5. Analysere genekspression på enkelt celle-plan kræver højeffektive PCR primere. En af de mest begrænsende trin er indsamling af cellens indhold. Dens effektivitet afhænger af diameteren af patch pipette tip, som skal være så stor som muligt mens matchende Cellestørrelse. Pipetter med en 1-2 µm åben tip diameter blev vist sig for at være egnet til de fleste neuronal typer. Det er også vigtigt at sikre, at der indsamles kun de cellulære indhold, og ikke det omgivende væv. Dette opnås ved at kontrollere electrophysiologically bevarelsen af en tæt forsegling under høsten. Dannelsen af en udenfor-out patch configuration under pipette tilbagetrækning yderligere beskytter den høstede cytoplasma fra celleaffald. Succesraten for den enkelt celle multiplex RT-PCR afhænger også af mRNAs overflod af de undersøgte celletype. For eksempel, udbyttet fremstillet med astrocytter, som express mRNAs i relativt lave beløb3, er generelt lavere end den, der er opnået med neuroner og kræver derfor større stikprøve størrelse15,16. Reverse transkription, som har en lav effektivitet i rør48, er den begrænsende reaktion af enkelt celle multiplex RT-PCR. Derfor er det afgørende at bruge top kvalitet reagenser, gemme dem som alikvoter ved-80 ° C, og bruge dem kun til én dag. Endelig er DNA polymerase aktivitet af RTase ofte en overset kilde af primer-dimer dannelse. For at løse dette problem, er udfører en hot start med primere afgørende for at øge forstærkning effektivitet. Dette vil endvidere reducere den hæmmende effekt af RTase på Taq DNA polymerase aktivitet49.

Enkelt celle multiplex RT-PCR teknik er meget alsidigt. Det har været flittigt brugt i gnavere10,11,13,19,20,34,50,51,52 ,53,54 , men kan tilpasses til stort set alle dyremodeller og gener under forudsætning af at væv og gen sekvenser er tilgængelige. Forskellige patch-clamp løsninger kan bruges, så længe de ikke interfererer med RT-PCR på celle gratis assays. For eksempel er interne løsninger baseret på K+ eller Cs+ kationer, Cl- eller gluconat blevet med held brugt6,36,41,55.

Klassisk falsk negative resultater skyldes RNase kontaminering af patch pipette glødetråd og/eller interne patch-clamp løsning. Omhyggeligt datafangstssystem glødetråden og validere det interne løsning generelt løser dette problem. Falske negative resultater kan også opstå, når et gen er udtrykt på en lav enkelt celle plan, da kun en del af cytoplasma er høstet. Høst kvalitet kan øges ved hjælp af større pipetter og/eller ved at reducere hele-celle indspilning. Høst kvalitet kan vurderes ved at inddrage et gen, der er kendt for at være udtrykt på et lavt niveau i enkelt celler20. Falske positive resultater kan forekomme med dårlig væv kvalitet, hvor mængden af kontaminerende celleaffald er høj. Prøvning af tilstedeværelsen af vragrester er gjort ved at indsætte en patch pipette i Skive uden at udføre nogen sæl og frigive overtryk før pipette fjernelse. Tilstedeværelsen af amplifiable materialer er derefter aftestede multiplex RT-PCR42. Silanisering patch pipette er også blevet brugt til at reducere indsamlingen af ekstracellulære forureninger56. Enkelt celle PCR er en meget følsom teknik, som kan afsløre så lidt som en enkelt kopi af dobbelt strandede DNA57. I tilfælde af intron-mindre gener, kan gDNA indeholdt i kernen også producere falske positiver. Undgå indsamling af gDNA ved at placere pipette fra kernen under de høstning hjælper med at løse dette problem. Tilstedeværelsen af gDNA kan pålideligt aftestede ved at forstærke en intronic sekvens25.

Påvisning af mRNA molekyler af RT-PCR bliver upålidelige på 10 eksemplarer44, formentlig på grund af den lave effektivitet af RTase48, og kan føre til en under påvisning af lav-overflod udskrifter26,42. Dette kan være problematisk for intron-mindre gener. Faktisk, at undgå høst af kernen reducerer mængden af cytoplasma, som kan indsamles og derfor påvisning følsomhed. Kombinationen af encellede RT-PCR efter patch-klemme med biocytin mærkning kræver, at formen af cellen bibeholdes så meget som muligt (figur 3). Uundgåeligt, reducerer det mængden af materiale, der kan indsamles, hvorved succesraten. Et kompromis mellem cytoplasma indsamling og bevaring af celle morfologi er obligatorisk.

Multiplex encellede RT-PCR data er ikke kvantitative, da de kun giver oplysninger om, hvorvidt cDNAs er til stede eller fraværende i det indsamlede materiale. På grund af påvisningsgrænserne beskrevet ovenfor, kan forekomsten af afsløring på befolkningsniveau afspejler overfloden af gener på enkelt celle-niveau. Alternative tilgange tillader generation af flere kvantitative data, men de tekniske begrænsninger, der af deres specifikke forstærkning strategier (dvs., relative kvantificering af homologe gener eller RT-qPCR) stort set begrænser antallet af gener, der kan være samtidig analyseret41,53,55,58,59,60,61,62,63 ,64,65,66. Den seneste kombination af patch-clamp optagelser og enkelt celle RNaseq, omtales som Patch-seq30,31, giver kvantitative transkriptom analyse af electrophysiologically karakteriseret celler. Det er en ny og lovende tilgang, men det kræver adgang til høj overførselshastighed sequencere og data genereret kræver tidskrævende analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Alexandre Mourot for hans kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 og ANR-17-CE37-0010-03), BLG understøttes af stipendium fra Fondation pour la Recherche sur Alzheimers. Vi takker Dyrefacilitet af IBPS (Paris, Frankrig).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series - 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series - 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series - 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13 (2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

Tags

Neurovidenskab sag 136 Gene expression profil neuroner astrocytter hjernen skiver hele-celle konfiguration indlejrede Polymerasekædereaktionen (PCR)
Enkelt celle Multiplex Reverse transkription Polymerase Chain Reaction efter Patch-klemme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet,… More

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter