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Neuroscience

Única célula transcrição reversa Multiplex cadeia da polimerase após Patch-clamp

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57627
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo descreve os passos críticos e as precauções necessárias para executar a única célula multiplex transcrição reversa reação em cadeia da polimerase após remendo-braçadeira. Esta técnica é um método simples e eficaz para analisar o perfil de expressão de um conjunto predeterminado de genes de uma única célula caracterizada por gravações de remendo-braçadeira.

Abstract

O córtex cerebral é composto de numerosos tipos de células exibindo várias características morfológicas, fisiológicas e moleculares. Esta diversidade dificulta a fácil identificação e caracterização destes tipos de células, os pré-requisitos para estudar suas funções específicas. Este artigo descreve o multiplex única célula transcrição reversa do polymerase reação em cadeia (RT-PCR) protocolo, que permite, depois da gravação em fatias, remendo-braçadeira para detectar, simultaneamente, a expressão de dezenas de genes em uma única célula. Este método simples pode ser implementado com caracterização morfológica e é amplamente aplicável para determinar as características fenotípicas de vários tipos de células e seu ambiente celular particular, como na proximidade de vasos sanguíneos. O princípio do presente protocolo é gravar uma célula com a técnica patch-clamp, colheita e inverter transcreva seu conteúdo citoplasmático, e para detectar qualitativamente a expressão de um conjunto predefinido de genes por multiplex PCR. Requer um design cuidadoso dos iniciadores de PCR e intracelular remendo-braçadeira solução compatível com RT-PCR. Para garantir uma transcrição seletiva e confiável detecção, esta técnica também exige controles apropriados do citoplasma colheita às etapas de amplificação. Embora discutido aqui deve ser rigorosamente as precauções, praticamente qualquer laboratório eletrofisiológico pode usar célula única técnica de RT-PCR multiplex.

Introduction

O córtex cerebral é composto por numerosos tipos de células envolvidos em vários processos fisiológicos. Sua identificação e caracterização, um pré-requisito para a compreensão de suas funções específicas, podem ser muito desafiadoras dada a grande diversidade morfológica, fisiológica e molecular que caracteriza tipos de célula cortical1 ,2,3,4.

Célula única multiplex RT-PCR baseia-se na combinação da remendo-braçadeira e técnicas de RT-PCR. Ele pode sondar simultaneamente a expressão de mais de 30 genes predefinidos em células electrophysiologically identificadas5. A inclusão de um marcador neuronal em gravação pipeta mais permite a caracterização morfológica das células gravadas após a revelação histochemical6,7,8,9, 10. é uma técnica muito útil para a classificação dos tipos neuronais com base na análise multivariada de suas características fenotípicas5,9,10,11,12 ,13,14. Única célula multiplex RT-PCR é também adequado para a caracterização de células não-neuronais como astrócitos15,16,17e pode ser aplicado virtualmente a cada cérebro estrutura18, 19,20,21,22,23 e célula tipo, supondo que eles podem ser gravados em configuração de células inteiras.

Esta técnica é muito conveniente para a identificação das fontes de celulares e/ou alvos de transmissão sistemas7,8,15,16,20,21, 24,25,26,,27,28, especialmente quando os anticorpos específicos são escassos. Ele se baseia em gravações de remendo-braçadeira de células visualmente identificados29e assim também permite a segmentação de células em um ambiente celular específico8,15,16. Além disso desde a cytoarchitecture do tecido cerebral é preservada em fatias do cérebro, essa abordagem também permite que o estudo das relações anatômicas das células caracterizadas com elementos neuronais e não-neuronal7,8 , 18.

Uma vez que esta técnica é limitada pela quantidade de citoplasma colhida e pela eficiência do RT, a detecção de mRNA, expressado em número de cópia baixa pode ser difícil. Embora outras abordagens baseadas na tecnologia RNaseq permitem analisar a transcriptoma inteira de células únicas3,4,30,31, não necessariamente precisam de sequenciadores caros elevado-throughput disponível para todos os laboratórios. Desde que a técnica de RT-PCR multiplex única célula usa pontos de extremidade do PCR, exige somente thermocyclers amplamente disponível. Ele pode ser facilmente desenvolvido em laboratórios equipados com instalações eletrofisiológicas e não requer equipamento caro. Ele pode fornecer, dentro de um dia, uma análise qualitativa da expressão de um conjunto predefinido de genes. Assim, esta abordagem oferece um fácil acesso para a caracterização molecular das células individuais de forma rápida.

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Protocol

Todos os procedimentos experimentais utilizando animais foram realizados em estrita conformidade com os regulamentos franceses (Código Rural R214/87-R214/130) e em conformidade com as diretrizes éticas da Comunidade Económica Europeia (86/609/CEE) e a carta nacional francês sobre a ética da experimentação animal. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de ética de Charles Darwin e enviados para o Ministério da educação e pesquisa (aprovação 2015 061011367540). As instalações de animais IBPS é credenciada pelas autoridades francesas (A75-05-24).

1. preliminares considerações

Nota: Para evitar contaminações, de acordo com as seguintes recomendações antes de célula única empresa RT-PCR após remendo-braçadeira.

  1. Não use plasmídeos contendo genes de interesse em laboratório, como eles são uma fonte potencial de contaminação.
  2. Reserve uma bancada de laboratório, longe da sala de eletroforese de gel de preparar PCRs.
  3. Escreve um conjunto de pipetas e aerossol resistentes filtro dicas para manipular o DNA e RNA em concentrações inferiores a 1 ng / µ l. Nunca usá-los para analisar os produtos de PCR.
  4. Sempre use produtos livre de RNase e DNase e luvas.
  5. Use produtos químicos dedicados para a preparação de soluções de remendo-braçadeira interna. Nunca use uma espátula, mas prefiro pesando papel para pesar os pós.
  6. Use um eletrodo de pH dedicados e soluções padrão de pH, como eles podem ser uma fonte de contaminação (por exemplo, RNase).
  7. Capilares de vidro de borosilicato de loja; 20 dicas µ l longo, fino e flexível; uma micropipeta de 20 µ l; um expulsor caseiras (remendo-braçadeira pipeta titular ligado a uma seringa de 10 mL); 500 µ l da polimerase; 10 µ l dicas filtro resistente aerossol; e fina marcadores permanentes em uma caixa dedicada (Figura 1).

2. primer Design

Nota: Multiplex RT-PCR baseia-se em duas etapas de amplificação. Durante a primeira PCR, todos os genes de interesse co são amplificados pela mistura de todos os iniciadores de PCR. Para detectar confiavelmente transcrições de células únicas, é essencial para projetar primers PCR eficientes e seletivas. O uso de primers (internos) aninhadas para a segunda ronda do PCR melhora tanto a especificidade e a eficiência da amplificação.

  1. Recupere as sequências de mRNA com curadoria de genes de interesse em sequência de dados do NCBI referência32 , bem como aqueles de sua família relacionada (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. Digite o nome dos genes e as espécies de interesse como uma consulta e clique na sequência relevante obtida.
    2. Para restringir a análise à sequência de codificação dos genes, clique em Enviar para (canto superior direito) e selecione codificação de sequências e FASTA Nucleotide como formato. Em seguida, clique em Criar arquivo e salvar a sequência FASTA usando uma extensão de arquivo ".nt".
  2. Use o MACAW software33 (construção de alinhamento múltiplo & Analysis Workbench) ou qualquer outro software de alinhamento múltiplo para determinar as regiões de homologia.
    1. Clique no arquivo | Novo projeto... e selecione o DNA como o tipo de sequência. Para importar as sequências do gene, selecione sequência | Sequência de importação... e carregar um arquivo de ".nt". Repita o procedimento para todas as sequências relacionadas.
    2. Clique e arraste todas as sequências na janela esquemático para selecionar as sequências inteiras.
    3. As regiões de homologia da pesquisa selecionando alinhamento | Busca de blocos... (CTRL + S). Selecione o par de segmento se sobrepõem no Método de pesquisa. Ajustar o Pairwise marcar limite para um valor relativamente elevado (por exemplo, 1.000) e o min. seqs. por bloco , o número total de sequências para alinhar e clique em começar.
    4. Na janela de Resultado da pesquisa aparece, selecione o resultado (s) com a maior pontuação-MP e clique no Link. Se nenhum resultado for encontrado, diminua a Pairwise marcar o corte e/ou o min. seqs. por bloco.
    5. Para facilitar a visualização de regiões homólogas, selecione alinhamento | Sombreamento | Quer dizer a pontuação.
    6. Selecionar partes desvinculadas das sequências e repita os passos 2.2.3–2.2.4 para potencialmente determinar outras regiões de homologia com uma MP-pontuação mais baixa.
    7. Para obter os primers mais específicos, selecione as regiões com a homologia de sequência a menos.
  3. Buscar as sequências de todas as variantes da tala e repita etapas 2.2.1–2.2.6. Selecione suas regiões comuns para uma deteção global. Considere a alternativas cassettes para tala dedicado variantes análises20,34,35,36.
  4. Alinhe as sequências de mRNA no genoma de modelo animal usando genomas de37 explosão (básica Local Alignment Search Tool) para determinar a estrutura intron-exon dos genes (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. Selecione o genoma do rato explosão clicando no rato e carregar a sequência FASTA obtida na seção Digite a sequência de consulta . Na Seleção do programa, selecione otimizar para sequências altamente similares (Megarajada)e, em seguida, clique no botão de explosão .
    2. Na seção de descrições , selecione o alinhamento com a identidade mais alto (até 100%). Certifique-se de que ele corresponde ao gene de interesse conforme indicado nas características da seção de alinhamentos .
    3. Classificar o alinhamento por consulta posição inicial na mesma seção para obter a sucessão de exões da sequência de codificação. Observe as posições inicial e final de todos os hits que correspondem aproximadamente à posição dos intrões na sequência de consulta (Figura 2A).
  5. Selecione dois exões diferentes para os sentido e antisentido primers para diferenciar facilmente do cDNA de amplificação de DNA (gDNA) genômica com base num critério de tamanho (Figura 2).
    Nota: A amplificação de gDNA pode ocorrer com pouca frequência quando o núcleo é colhido com o citoplasma. Assim, é essencial para projetar intrão overspanning pares da primeira demão (Figura 2A). No caso de genes intrão-menos, a coleção do núcleo é problemática, pois pode levar à confusão potencialmente os resultados. Para resolver esse problema, incluem um conjunto de primers vista amplificar uma sequência intrônicas para investigar a presença de gDNA25. Se o controle de genômico é positivo, os resultados para todos intrão-menos genes devem ser rejeitados.
  6. Para conseguir uma amplificação eficiente, selecione as primeiras demão gerando amplicons com um comprimento ideal compreendido entre 200 e 400 pares de base (Figura 2).
  7. Para amplificar simultaneamente vários cDNAs durante a etapa de PCR multiplex, projetar primers com um comprimento entre 18 e 24 nucleotídeos e uma temperatura de fusão (Tm) entre 55 e 60 ° C.
  8. Para minimizar a formação de estruturas secundárias, que reduzem o rendimento de amplificação, selecione sentido e anti-sentidos primers com prendendor mínima e comprimentos de frente e verso (Figura 2B).
  9. Projetar primers internos, usando os mesmos critérios (etapas 2.5-2.8).
  10. Verifique se a especificidade dos primers PCR, alinhando os primers no banco referência de sequência de RNA do organismo de interesse usando um nucleotídeo explosão.
    1. Na explosão (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), clique no nucleotídeo explosão. Cole a sequência de um primer na Sequência de consulta digite.
    2. Na seção Escolha o conjunto de pesquisa , clique em outros (nr etc.), selecione sequências de RNA de referência (refseq_rna) na opção de banco de dados e especificar o organismo (por exemplo, Mus musculus (taxid:10090) ) para restringir a análise à espécie desejada.
    3. No Programa de seleção selecione otimizar para sequências algo semelhantes (blastn). Na seção parâmetros de algoritmo reduza o tamanho da palavra até 7 para aumentar a chance de obter sucessos.
  11. Para projetar primers seletivas, manter apenas aqueles cuja sequência tem pelo menos 3 incompatibilidades com os cDNAs indesejadas quando possível.
  12. Ordenar as primeiras demão demolhadas numa concentração relativamente elevada (por exemplo, 200 µM) para garantir que todos os fixadores externos podem ser misturados em uma concentração final de 1 µM.

3. preparação dos reagentes RT

  1. 5 x RT-mistura: preparar em água livre de RNase 400 µ l de solução de mistura de RT (5x) contendo primers aleatórios em 25 µM e dNTPs 2,5 mm para cada trabalho. Armazene esta mistura de trabalho como 20 alíquotas µ l em tubos de 500 µ l.
  2. 20 x ditiotreitol (DTT): preparar 1 mL de 0,2 M TDT em RNase-livre água e armazená-lo como 50 alíquotas µ l.
  3. Loja 2.500 U de inibidor de RNase (40 U / µ l) e 10.000 U de transcriptase reversa (RTase, 200 U / µ l) como 5 alíquotas µ l.
  4. Para garantir uma qualidade óptima dos reagentes RT, armazenar as alíquotas a-80 ° C. Usá-los para até 10 células e apenas por um dia.

4. PCR validação

  1. Prepare os cDNAs, fazendo uma transcrição reversa em uma quantidade relativamente grande de total do RNA (tipicamente 1 µ g) extraído38 da estrutura de interesse.
    1. Não utilize as pipetas dedicadas a única célula RT-PCR para essas etapas preliminares, mas usar as pipetas RNase-livre. Dilua o RNA total até 1 µ g / µ l.
    2. Em um tubo PCR 500 µ l, adicione 1 µ l de RNA total diluído e 8 µ l de água livre de RNase. Desnaturar a 95 ° C por 1 min e refrigerar para baixo o tubo no gelo.
    3. Adicionar 4 µ l de buffer de 5 x RT fornecido pelo fabricante, 4 µ l da solução de mistura de RT, 1 µ l de RTase, 1 µ l de inibidor de RNase e 1 µ l de 200 mM DTT (ver secção 3).
    4. Agite o tubo, girar e incubar durante uma noite a 37 ° C.
    5. Armazene os cDNAs a-80 ° C por até vários anos. Prepare-se uma alíquota de cDNAs diluídos a 1 ng / µ l de equivalentes de RNAs totais.
  2. Misturar e diluir cada par de primer em 1 µM com as pipetas dedicadas a única célula RT-PCR. Use 20 µ l de cada mistura de cartilha para 100 µ l PCRs.
  3. No gelo, prepare-se para cada par de primer uma pré-mistura contendo: água (QS, 80 µ l), 10 µ l de 10x buffer, 1 µ l de 100 x dNTPs (50 µM cada), 500 – 1.000 pg do cDNA diluído a 1 ng / µ l e 0,5 µ l (2,5 U, 5 U / µ l) da Taq polimerase.
  4. Use tubos PCR que encaixam firmemente os poços da máquina do PCR para um controle de temperatura ideal. Adicione 2 gotas (~ 100 µ l) de óleo mineral a pré-mistura sem tocar a parede ou a tampa do tubo do PCR.
  5. Para minimizar a formação de dímeros de cartilha, executar um começo quente, colocando os tubos PCR no thermocycler pre-aquecido a 95 ° C. Após 30 s, rapidamente expulsar 20 µ l do mix primeira demão em cima do óleo.
  6. Após 3 min a 95 ° C, executar 40 ciclos (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) seguido por uma etapa de alongamento final a 72 ° C por 5 min.
  7. Analise 10 µ l de cada produtos PCR por agarose gel de electroforese (2%, peso/volume)39. Se alguns produtos PCR não tem o tamanho esperado, re-projetar outros primers (ver secção 2).
    Cuidado: Brometo de etídio é um químico intercalante que pode induzir mutações de DNA. Consulte o escritório local de segurança antes de usá-lo. Use sempre luvas quando manipular isso. Use uma solução comercial de solução (10 mg/mL) de brometo de etídio em vez de pó para minimizar o risco de inalação. Da mesma forma, a luz UV pode ser prejudicial, então certifique-se de usar uma máscara ou óculos de proteção UV. Retire géis sujos, dicas, luvas e buffer em contentores de resíduos de etídio.
  8. Uma vez que todos os pares da primeira demão foram validados individualmente, teste o protocolo multiplex (Figura 3).
    1. Misturar e diluir todos os fixadores externos juntos loja 1 µM. os primers multiplex misturam a-20 ° C por até várias semanas.
    2. No gelo, preparar um premix contendo: água (QS, 80 µ l), 10 µ l de 10x buffer, 1 µ l de 100 x dNTPs (50 µM de cada), 500 – 1.000 pg de cDNAs diluídos a 1 ng / µ l e 0,5 µ l (2,5 U, 5 U / µ l) da Taq polimerase.
    3. Agite o tubo do PCR, girá-lo e adicionar duas gotas (~ 100 µ l) de óleo mineral.
    4. Execute um começo quente conforme descrito na etapa 4.5 com 20 µ l do mix de multiplex da primeira demão. Depois de 3 min a 95 ° C, execute 20 ciclos PCR idênticas da etapa 4.6.
    5. Prepare um número de tubos PCR idênticos ao número de genes para analisar. Prepare um premix como passo 4.8.2, mas usando 1 µ l do primeiro produto do PCR por gene como modelo. Ajuste todos os volumes de acordo com o número de genes para analisar e considerar o uso de 10% do volume extra para compensar erros de pipetagem.
    6. Agite, girar o tubo, expedir 80 µ l de pré-mistura em cada tubo PCR e adicionar duas gotas (~ 100 µ l) de óleo mineral pelo tubo sem tocar a parede ou a tampa dos tubos.
    7. Executar um quente começar (consulte a etapa 4.5) pela expulsão 20 µ l de mistura interna cartilha preparada na etapa 4.2. Execute 35 ciclos PCR idêntico ao passo 4.6.
    8. Analise os produtos PCR segundo por eletroforese em gel de agarose. Certifique-se de que cada segundo PCR gera um amplicon do tamanho esperado. Em caso de amplificações ineficientes ou inespecíficas, re-projetar novas Cartilhas (etapas 2.5 – 2.12) e validá-los (passos 4.2 – 4.8).

5. preparação e validação da solução de Patch-clamp intracelular

Nota: O seguinte protocolo descreve a preparação e validação de um /gluconate K+baseado solução interna, mas virtualmente qualquer tipo de solução de remendo-braçadeira pode ser usado, desde não impeça a eficiência de RT-PCR. Uso de luvas é obrigatória para obter uma solução interna livre de RNase.

  1. 60 mL de solução de gravação interna da remendo-braçadeira, prepare extemporaneamente 10ml de 0,1 M de KOH.
  2. Dissolva 11,4 mg de EGTA (0,5 mM final) em 0,9 mL de 0.1 M de KOH.
  3. Adicionar 40 mL RNase-livre de água e dissolver 2,02 g de K-gluconato (144 mM final), 143 mg de HEPES (final de 10 mM) e 180 µ l de 1m MgCl2 (final de 3 mM).
  4. Ajuste o pH para 7.2 Adicionando ~ 6 mL de 0.1 M de KOH.
  5. Ajuste a osmolaridade para 295 mOsm com ~ 13 mL de água livre de RNase.
  6. Desde que a solução interna é usada também como um amortecedor para a transcrição reversa, controle cuidadosamente a concentração de Mg2 + . Compensa uma menor concentração de Mg2 + na solução interna adicionando MgCl2 depois para chegar a uma concentração final de 2 mM na reação de RT.
  7. Para rotular a célula colhida após a gravação da remendo-braçadeira, adicione 2 – 5 mg/mL de biocytin RNase-livre para a solução interna descrita acima (etapas 5.1 – 5.5).
  8. A solução interna do filtro (tamanho de poros de 0,22 µm) e armazená-lo a-80 ° C alíquotas de mais de 100 – 250 µ l.
  9. Para validar o uso da solução interna para célula única RT-PCR, adicionar 0,5 µ l de RNA total, diluído a 1 ng / µ l a 6 µ l da solução da remendo-braçadeira e deixá-lo no banco por cerca de 30 min.
  10. Com uma micropipeta de 2 µ l, adicionar 2 µ l de 5 x RT-mistura, 0,5 µ l de 20 x DDT, inibidor de RNase 0,5 µ l e 0,5 µ l RTase e incubar durante uma noite a 37 ° C.
  11. Gire o tubo. No gelo, adicione água (QS, 80 µ l), 10 µ l de tampão de 10x e 0,5 µ l (2,5 U, 5 U / µ l) da Taq polimerase.
  12. Execute 40 ciclos de PCR usando um conjunto de primers validados (etapas 4.4 – 4.6).
  13. Analisar os produtos PCR por eletroforese em gel de agarose (consulte a etapa 4.7) e verifique se eles têm o tamanho esperado.
    Nota: Omitindo a 0,5 µ l de RNA total e substituindo-o por água livre de RNase a µ l 0,5 irão garantir que a solução interna está livre de contaminações de RNA ou DNA.

6. aguda fatia preparação

Nota: Este protocolo descreve o procedimento de corte para juvenil (ou seja, menos de 28 dias pós-parto) ratos machos e fêmeas. Outras soluções de corte, como baseados em sacarose artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) também são utilizáveis40.

  1. Prepare-se 2 L de aCSF contendo (em mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, CaCl 22, 1 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 glicose e sacarose 15. Para reduzir a atividade de glutamatérgico durante a preparação da fatia, prepare uma solução de corte pela adição de 1 mM de ácido cinurênico.
  2. Antes de cortar, prepare um kit de dissecação contendo tesoura cirúrgica, tesoura íris fina, duas espátulas, pinças, um disco de papel filtro e cola de cianoacrilato.
  3. Usar solução de corte gelada saturada com O2/CO2 (95/5%) e de arrefecimento da câmara de corte a-20 ° C.
  4. Anestesia o mouse com um pequeno papel toalha embebida com isoflurano. Depois de ~ 2 min, certifique-se de que o mouse está sob anestesia profunda, verificando a ausência de resposta a pitada de pata.
  5. Rapidamente decapitar o mouse. Retire o couro cabeludo e abrir o crânio. Extrair o cérebro com cuidado e coloque-o num pequeno copo preenchido com solução de corte de gelo frio (~ 4 ° C) oxigenada com O2/CO2.
  6. Remova a câmara de corte de condições de-20 ° C e umidade com uma toalha de papel.
  7. Cuidadosamente, disseca o cérebro para isolar a região de interesse, cola-lo na câmara de corte e adicionar a solução de corte gelada oxigenada com O2/CO2.
  8. Corte 300 µm de espessura utilizando um vibratome. Transferi-los à temperatura ambiente em uma descanso câmara cheia de solução de corte oxigenado e permitir a recuperação pelo menos 0,5 h.

7. única célula RT-PCR após a gravação do Patch-clamp

  1. Limpe o sistema de perfusão regularmente com ~ 100 mL de solução de 30% H2O2 e enxágue extensivamente com ~ 500 mL de água destilada para evitar o crescimento de bactérias, como é uma fonte negligenciada de contaminação de RNase.
  2. Cloração do filamento com uma pipeta de remendo cheia de lixívia concentrada cada dia de colheita. Não utilize uma micropipeta para encher a pipeta de remendo, mas prefiro uma 20 µ l longo, fino, flexível dica ligado a uma seringa de 1 mL. Em seguida, enxágue extensivamente com água livre de RNase e seque-o com um espanador de gás.
  3. Prepare uma pequena caixa de gelo contendo 5 x RT-mix e 20 alíquotas de x DTT. Armazene as alíquotas de inibidor de RTase e RNase a-20 ° C em uma bancada mais fresca.
  4. Transferi uma fatia para a câmara de gravação perfundida em 1 a 2 mL/min com aCSF oxigenado.
  5. Puxe pipetas de remendo (1-2 µm abrir diâmetro de ponta, MΩ de 3 – 5) de vidro de borosilicato usando luvas e encha um com 8 μL da solução interna. Tenha em mente que os botões do extrator a pipeta são uma fonte de contaminação de RNase.
  6. Coloca a pipeta no suporte pipeta enquanto vestindo luvas novas e não tocar o filamento com os dedos.
  7. Abordagem da pipeta de remendo com uma pressão positiva e realizar a gravação de células inteiras para caracterizar a célula alvo (Figura 4).
  8. Para preservar os mRNAs, limitar o tempo de configuração de células inteiras de 20 min41.
  9. No final da gravação, prepare um tubo PCR de 500 µ l cheio de 2 µ l de 5 x RT Mix 0,5 µ l de 20 x DTT, girá-lo e armazená-lo no gelo.
  10. Colha o citoplasma da célula, aplicando uma ligeira pressão negativa (Figura 4). Controle visualmente que o conteúdo da célula vem dentro da pipeta, mantendo um selo apertado.
    1. Evite tanto quanto possível, coletando o núcleo se consideram-se alguns genes intrão-menos. Nesse caso sempre incluem um conjunto de primers vista amplificar gDNA para investigar contaminação genômica.
    2. Se o núcleo está chegando perto a ponta da pipeta, liberar a pressão negativa e mover a pipeta longe do núcleo. Certifique-se de que o selo apertado é preservado e reinicie para coletar o citoplasma na localidade nova pipeta.
  11. Pare a colheita, quando não há mais material está vindo e/ou antes de perder o selo apertado.
  12. Retire a pipeta suavemente para formar um patch fora-fora para limitar a contaminação, os detritos extracelular (Figura 4) e a favorecer o fechamento da membrana celular para análises histoquímicas subsequentes.
  13. Tenha em mente que os botões, Micromanipuladores, teclado de computador, ou rato do computador são fontes potenciais de contaminação de RNase. Se eles foram tocados durante a gravação, mude as luvas.
  14. Anexar a pipeta para o bagaço e expulsar o seu conteúdo dentro do tubo PCR, aplicando uma pressão positiva (Figura 1).
  15. Quebre a ponta da pipeta no tubo do PCR para ajudar a coleção de seu conteúdo.
  16. Brevemente o tubo de centrifugação, adicionar 0,5 µ l de inibidor de RNase e 0,5 µ l de RTase, misture delicadamente, centrifugue novamente e incubar durante uma noite a 37 ° C.
  17. Girar o tubo e armazená-lo a-80 ° C por até diversos meses até análise PCR.
  18. Execute a primeira etapa de amplificação diretamente no tubo contendo o ~ 10 µ l de produtos RT pela adição de água (QS, 80 µ l), 10 µ l de tampão de x 10 e 0,5 µ l (2,5 U) da Taq polimerase. Em seguida, siga as instruções descritas em etapas 4.8.2–4.8.8.

8. histochemical coloração da célula gravada (opcional)

  1. Após as gravações eletrofisiológicas, manter a fatia por 20 min em aCSF oxigenado para permitir a difusão do biocytin na árvore dendrítica e axonal.
  2. Coloque a fatia em um poço de uma placa de 24 e corrigir isso durante a noite a 4 ° C, com 1 mL de paraformaldeído 4% em 0,1 M de tampão de fosfato.
  3. Lave as fatias 4 vezes, 5 min cada, com 1 mL de solução salina tampão de fosfato (PBS).
  4. No mesmo bem, permeabilize e saturar a fatia durante 1 h em temperatura ambiente com 1 mL de PBS suplementado com 0,25% Triton X-100 e 0,2% de gelatina de pele de peixe de água fria (PBS-GT).
  5. Incubar durante uma noite com uma fluorescente etiquetada avidin diluído a 1/400 em 250-500 µ l de PBS-GT.
  6. Lavar 5 vezes, 5 min cada, com 1 mL de PBS e montar as fatias.

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Representative Results

Uma validação representante de RT-PCR multiplex é mostrada na Figura 3. O protocolo foi concebido para sondar, simultaneamente, a expressão de 12 diferentes genes. O vGluT1 de transporte vesicular glutamato foi tomada como um controle positivo para glutamatérgico neurônios42. O GABA sintetizando enzimas (GAD65 e 67 GAD), neuropeptídeo Y (NPY) e somatostatina (SOM) foram utilizados como marcadores de gabaérgica interneurônios3,5,11. A enzima ciclo-oxigenase-2 (COX-2) foi usada como um marcador do célula piramidal subpopulação3,16.

As subunidades de ATP1α1-3 do at+/k+ ATPase e as subunidades KIR 6.2 e SUR1 dos canais de K sensíveis ao ATP+ foram escolhidas para avaliar a relação entre a atividade neuronal e Estados metabólicos43. Desde que KIR 6.2 é um gene intrão-menos, o intrão SOM foi incluída como um controle de genômico. O protocolo foi testado em 1 ng de reverso transcrito o RNA total extraído todo cérebro de rato, que corresponde aproximadamente às transcrições de 20 células de44. O PCR multiplex produzidos 12 amplicons do tamanho esperado (Figura 3 e tabela 1) demonstrando a sensibilidade e a eficiência do protocolo. O controlo negativo realizado sem RNA produzido sem amplicon (dados não mostrados).

Um neurônio piramidal camada V visualmente foi identificado por sua grande soma e um dendrito apical proeminente (Figura 5A, inserir). Gravação de celular revelou Propriedades eletrofisiológicas típicas de camada V regular spiking neurônios5,,45,46 com, nomeadamente, uma baixa resistência de entrada, potenciais de ação de longa duração e pico pronunciado adaptação de frequência (Figura 5A). A análise molecular deste neurônio revelou a expressão de vGluT1 (Figura 5B), confirmando sua glutamatérgico fenótipo42,46. Este neurônio também expresso SOM, ATP1α1 e 3 subunidades do at+/k+ ATPase. Biocytin rotulagem dos neurônios gravados confirmou uma morfologia piramidal (Figura 5).

Como esperado de neurônios glutamatérgico, a análise molecular de 26 células piramidais de camada V revelou expressão de VGluT1, mas nenhum dos dois GADs (Figura 5). Marcadores de interneurônios raramente foram observados5,42,46. COX-2, expressado principalmente pela camada II-III células piramidais3,16, não foi detectado em células piramidais de camada V. O ATP1α1 e 3 subunidades foram mais frequentemente observadas do que a subunidade de ATP1α23. As subunidades KIR 6.2 e SUR1 raramente foram detectadas nos neurônios piramidais camada V, que é consistente com sua expressão preferencial nas camadas superiores3,43. Cuidado foi tomado para não colher os núcleos, resultando em uma rara detecção de intrões SOM (3 dos 26 células, ou seja, 12%).

Figure 1
Figura 1: caixa dedicada para única célula RT-PCR. Lista de materiais reservados para RT-PCR após remendo-braçadeira. (1) capilares de vidro de borosilicato, (2) 20 µ l longo, fina, flexíveis dicas, (3) 20 micropipeta µ l, expulsor (4) feito em casa, tubos PCR (5) 500 µ l, (6) 10 µ l aerossol resistente filtro dicas e marcadores (7) permanentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: estratégia de design da primeira demão do PCR. (A) representação esquemática da sequência de codificação do cDNA de COX 2 alinhado para a sequência do cromossoma 2 rato contendo o gene COX-2. Exões são representadas por caixas-pretas e os intrões na gDNA por caixas brancas. Observe as lacunas do cDNA correspondente as sequências intrônicas em gDNA. Exemplos representativos dos oligonucleotides ruins e boas representados como setas vermelhas e verdes, respectivamente. Setas direita e esquerda denotam cartilhas para diante e reversos. (B) sequências e estruturas secundárias dos oligonucleotides mostradas em (A). Painéis esquerdos e direito indicam a formação de autocomplementaridade e autodímero do grampo de cabelo, respectivamente. O oligonucleotide B1 exibe ambos um forte gancho de cabelo autocomplementaridade e dímero formação enquanto o oligonucleotide B2 mostra apenas a formação do dímero. Oligonucleotídeos tanto B3 e B4 tem nenhum gancho autocomplementaridade e sem formação de dímero; Eles são intrão overspanning (A) e foram selecionados como iniciadores de PCR potenciais (ver tabela 1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: validação de PCR multiplex. 1 ng do RNA total do cérebro do rato foi submetida a uma transcrição reversa seguida de duas rodadas de amplificação por PCR. Os 12 produtos PCR foram resolvidos em corredores separados por eletroforese em gel de agarose em paralelo com Φx174 digerida pelo HaeIII. Os produtos PCR segundo tinham tamanhos (em PA) previstos por sequências: 153 (vGluT1), 248 (GAD65), 255 (GAD67), 181 (COX 2), 220 (NPY), 146 (SOM), 183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2), 128 (ATP1a3), 342 (KIR 6.2), 211 (SUR1) e 182 (SOMint). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Patch-clamp colheita em fatias de cérebro. Uma vez que uma célula é identificada visualmente, a pipeta de gravação é abordada com uma pressão positiva para evitar a contaminação de restos celulares na ponta da pipeta. Observe a covinha na membrana deste neurônio. Pressão positiva é então interrompido a fim de formar uma configuração de conexão celular com um selo apertado Gigaohm. Sucções breves são aplicadas para alternar para a configuração de células inteiras. No final da gravação, o citoplasma é colhido, aplicando uma ligeira pressão negativa dentro da pipeta, mantendo o selo apertado. Observe o encolhimento do corpo celular durante o procedimento de colheita. A pipeta de gravação então é retirada delicadamente para formar um patch de fora-fora, o que favorece o fechamento da membrana celular para revelação posterior biocytin e preservação do material colhido em pipeta remendo. Reproduzido de cozida e Lambolez47 com permissão da Real Sociedade de química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: caracterização das células piramidais neocortical de camada V. (A) membrana resposta potencial de uma célula piramidal camada V induzida por pulsos de corrente de -100, -40, -10, 60, 120 e +500 pA (vestígios de fundo). O neurônio exibe um desvio potencial fraco após a resposta inicial de relação (traços superiores). Em resposta a uma despolarização super-iluminado, o neurônio alta potenciais de ação de longa duração com desenvolvendo lentamente após-hiperpolarização (traço superior). Perto de saturação, o neurônio alta com pouca frequência e exibiu uma adaptação pronunciada (traço cinza superior). Inset: fotos infravermelho do neurônio piramidal gravado camada V. A superfície pial é para cima. Barra de escala: 20 µm. (B) análise de RT-PCR Multiplex revelando expressão de vGluT1, SOM, ATP1α1 e ATP1α3. (C) perfil de expressão de Gene em uma amostra de 26 camada V células piramidais. vGluT1 foi expressa em todos os neurônios enquanto GAD65, GAD67 e COX2 nunca foram detectados. NPY, SOM, KIR 6.2, SUR1 e SOMint foram raramente observados. Células piramidais expressaram ATP1α3, 1 subunit do at+/k+ ATPase e ATP1α2 em menor grau. (D) máxima projeção de intensidade de imagens confocal mostrando biocytin rotulagem do neurônio gravado em (A). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gene / número do GenBank Fixadores externos Tamanho (bp) Fixadores internos Tamanho (bp)
vGlut1
NM_182993		 Sentido,-113 259 Sentido, -54 153
GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC ATTCGCAGCCAACAGGGTCT
Antisenso, 126 Antisenso, 79
CCAGCCGACTCCGTTCTAAG TGGCAAGCAGGGTATGTGAC
GAD65
NM_008078		 Sentido, 99 375 Sentido, 219 248
CCAAAAGTTCACGGGCGG CACCTGCGACCAAAAACCCT
Antisenso, 454 Antisenso, 447
TCCTCCAGATTTTGCGGTTG GATTTTGCGGTTGGTCTGCC
GAD67
NM_008077		 Sentido, 529 598 Sentido, 801 255
TACGGGGTTCGCACAGGTC CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC
Antisenso, 1109 Antisenso, 1034
CCCAGGCAGCATCCACAT AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC
COX 2
NM_011198		 Sentido, 199 268 Sentido, 265 181
CTGAAGCCCACCCCAAACAC AACAACATCCCCTTCCTGCG
Antisenso, 445 Antisenso, 426
CCTTATTTCCCTTCACACCCAT TGGGAGTTGGGCAGTCATCT
NPY
NM_023456		 Sentido, 16 294 Sentido, 38 220
CGAATGGGGCTGTGTGGA CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT
Antisenso, 286 Antisenso, 236
AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA
SOM
NM_009215		 Sentido, 43 208 Sentido, 75 146
ATCGTCCTGGCTTTGGGC GCCCTCGGACCCCAGACT
Antisenso, 231 Antisenso, 203
GCCTCATCTCGTCCTGCTCA GCAAATCCTCGGGCTCCA
ATP1Α1
NM_144900 		Sentido, 1287 288 Sentido, 1329 183
CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA TAAGCGGGCAGTAGCGGG
Antisenso, 1556 Antisenso, 1492
CCGTGGAGAAGGATGGAGC AGGTGTTTGGGCTCAGATGC
ATP1Α2
NM_178405		 Sentido, 1392 268 Sentido, 1430 213
AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG AAATCCCCTTCAACTCCACCA
Antisenso, 1640 Antisenso, 1623
ACAGAAGCCCAGCACTCGTT GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC
ATP1Α3
NM_144921		 Sentido, 127 216 Sentido, 158 128
CGGAAATACAATACTGACTGCGTG TGACACACAGTAAAGCCCAGGA
Antisenso, 324 Antisenso, 264
GTCATCCTCCGTCCCTGCC CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA
Kir 6.2
NM_010602		 Sentido, 306 431 Sentido, 339 342
CGGAGAGGGCACCAATGT CATCCACTCCTTTTCATCTGCC
Antisenso, 719 Antisenso, 663
CACCCACGCCATTCTCCA TCGGGGCTGGTGGTCTTG
SUR1
NM_011510		 Sentido, 1867 385 Sentido, 2041 211
CAGTGTGCCCCCCGAGAG ATCATCGGAGGCTTCTTCACC
Antisenso, 2231 Antisenso, 2231
GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG
SOMint
X51468		 Sentido, 8 240 Sentido, 16 182
CTGTCCCCCTTACGAATCCC CTTACGAATCCCCCAGCCTT
Antisenso, 228 Antisenso, 178
CCAGCACCAGGGATAGAGCC TTGAAAGCCAGGGAGGAACT

Tabela 1. Sequências de primers PCR de primeiro e segundo. A posição de cada primer PCR e suas sequências são dadas de 5' para 3'. Exceto o intrão somatostatina, posição 1 corresponde a primeira base do códon de início de cada gene.

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Discussion

Única célula multiplex RT-PCR após remendo-braçadeira pode sondar simultaneamente e de forma confiável a expressão de mais de 30 genes em células electrophysiologically identificadas5. Analisando a expressão do gene no nível da célula única requer iniciadores de PCR altamente eficientes. Um dos passos mais limitantes é a coleção de conteúdo da célula. Sua eficiência depende do diâmetro da ponta da pipeta de patch, que deve ser tão grande quanto possível enquanto o tamanho de pilha de correspondência. Pipetas com um diâmetro de ponta aberta 1-2 µm foram comprovadas para ser apropriado para tipos mais neuronais. Também é essencial para garantir que somente o conteúdo celular é coletado e não o tecido circundante. Isto é conseguido através do controle de electrophysiologically a preservação de um selo apertado durante a colheita. A formação de uma configuração de remendo do exterior-para fora durante a retirada da pipeta mais protege o citoplasma colhido de restos celulares. A taxa de sucesso da célula única QUE RT-PCR multiplex também depende da abundância de mRNAs do tipo célula investigadas. Por exemplo, o rendimento obtido com astrócitos, que expressam os mRNAs em quantidades relativamente baixas3, é geralmente mais baixo do que o obtido com os neurônios e, portanto, requer aumento de15,de tamanho de amostra16. A transcrição reversa, que tem uma baixa eficiência em tubos de48, é a reação limitante do single cell multiplex RT-PCR. Portanto, é fundamental usar reagentes de qualidade superior, para armazená-los como alíquotas a-80 ° C e usá-los apenas por um dia. Finalmente, a atividade da DNA polimerase da RTase é muitas vezes uma fonte negligenciada de formação do dímero da primeira demão. Para resolver esse problema, realizar um começo quente com primers é fundamental para aumentar a eficiência de amplificação. Além disso, isso reduzirá o efeito inibitório sobre a Taq DNA polimerase atividade49de RTase.

A técnica de RT-PCR multiplex única célula é altamente versátil. Tem sido extensivamente utilizado em roedores10,11,13,19,20,34,50,51,52 ,53,54 , mas pode ser adaptado para modelos virtualmente todos os animais e genes, assumindo que o tecido e gene sequências estão disponíveis. Várias soluções de remendo-braçadeira podem ser usadas, desde que não interfiram com o RT-PCR em ensaios de célula livre. Por exemplo, soluções internas baseadas em K+ ou cátions Cs+ , Cl– ou gluconato de tem sido usado com sucesso6,36,41,55.

Clássicos resultados falsos negativos decorrem de contaminação de RNase do filamento de pipeta de remendo e/ou solução de remendo-braçadeira interna. Cuidadosamente, desinfetando o filamento e validar a solução interna geralmente resolvem este problema. Resultados falsos negativos também podem ocorrer quando um gene é expresso em um nível baixo de célula única, uma vez que apenas uma parte do citoplasma é colhida. A qualidade da colheita pode ser aumentada usando pipetas maiores e/ou reduzindo o tempo de gravação a célula inteira. Colheita de qualidade pode ser avaliada, incluindo um gene conhecido a ser expressa em um nível baixo de células únicas20. Resultados falso-positivos podem ocorrer com a qualidade do tecido ruim, em que a quantidade de restos celulares de contaminantes é elevada. Testar a presença de detritos é feito inserindo uma pipeta de remendo a fatia sem executar qualquer selo e liberando a pressão positiva antes da remoção da pipeta. A presença de materiais ampliáveis então é sondada por multiplex RT-PCR42. Silanizar a pipeta de remendo também tem sido utilizado para reduzir a coleção de contaminantes extracelular56. Única célula PCR é uma técnica muito sensível que pode detectar tão pouco quanto uma única cópia do de DNA encalhado dobro57. No caso de genes intrão-menos, o gDNA contido no núcleo também pode produzir resultados falsos positivos. Evitando a coleção de gDNA colocando a pipeta longe do núcleo durante a colheita ajuda a resolver esta questão. A presença de gDNA pode confiantemente ser sondada amplificando uma sequência intrônicas25.

A detecção de moléculas de mRNA por RT-PCR torna-se confiável em 10 cópias44, presumivelmente por causa da baixa eficiência do RTase48e pode levar a uma sob a deteção de transcrições de baixa abundância26,42. Isso pode ser problemático no caso de genes intrão-menos. Com efeito, evitar colheita do núcleo reduz a quantidade de citoplasma que pode ser coletada e, portanto, a sensibilidade de detecção. A combinação de célula única RT-PCR após remendo-braçadeira com biocytin rotulagem exige que a forma da célula é mantida tanto quanto possível (Figura 3). Inevitavelmente, isso reduz a quantidade de material que pode ser recolhido, reduzindo assim a taxa de sucesso. Um compromisso entre o citoplasma coleta e preservação da morfologia celular é obrigatório.

Dados de RT-PCR multiplex unicelulares não são quantitativos, como só dão informação sobre se os cDNAs são presentes ou ausentes em material coletado. No entanto, por causa dos limites de deteção descritos acima, a ocorrência da deteção a nível de população pode refletir a abundância dos genes a nível de célula única. Abordagens alternativas permitem a geração de mais dados quantitativos, mas as limitações técnicas impostas pela maior parte por suas estratégias de amplificação específica (ou seja, quantificação relativa dos genes homólogos ou RT-qPCR) restringem o número de genes que podem ser simultaneamente analisaram41,53,55,58,59,60,61,62,63 ,64,,65,66. A combinação recente de gravações de remendo-braçadeira e única célula RNaseq, conhecido como Patch-seq30,31, permite análise quantitativa transcriptomic de células electrophysiologically-caracteriza-se. É uma abordagem nova e promissora, ainda requer acesso ao elevado-throughput sequenciadores e os dados gerados exigem análise demorada.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos o Dr. Alexandre Mourot por seus comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por concessões da Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 e ANR-17-CE37-0010-03), BLG é suportado pelo fellowship da Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Agradecemos a facilidade animal do IBPS (Paris, França).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series - 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series - 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series - 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation

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Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).

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