Summary
Ici, nous détaillons les techniques expérimentales utilisées pour évaluer les forces de protrusion podosomes applicables sur un film compatible, de la préparation du film pour l’analyse automatique des images topographiques.
Abstract
Dans nombreux contextes biologiques, cellules animales ont besoin d’interagir physiquement avec leur environnement en développant des forces mécaniques. Parmi ceux-ci, les forces de traction ont été bien caractérisés, mais il y a un manque de techniques permettant de mesurer les forces de protrusion exercée par les cellules orthogonalement à leur substrat. Nous avons conçu un montage expérimental pour mesurer les forces de protrusion exercées par les cellules adhérentes sur leur substrat. Les cellules plaqués sur une feuille de Formvar conforme déforment ce substrat et la topographie qui en résulte est mappée par microscopie à force atomique (AFM) à l’échelle du nanomètre. Valeurs de force sont alors extraites de l’analyse de la déformation de profil basé sur la géométrie des structures cellulaires protrusive. Par conséquent, les forces exercées par les différentes unités qui dépasse d’une cellule vivante peuvent être mesurées au fil du temps. Cette technique va permettre l’étude de la mise sur pied et sa régulation dans les nombreux processus cellulaires impliquant la saillie. Nous décrivons ici son application pour mesurer les forces protrusive générés par podosomes formé par les macrophages humains.
Introduction
Les cellules animales interagissent physiquement avec la matrice et les autres cellules qui constituent leur environnement1. Cela est nécessaire à leur migration, internaliser les organes, acquérir de l’information externe ou différencier. Dans ces processus, la cellule doit générer des forces mécaniques et, comme de nombreuses études ont montré ces dernières années, la capacité d’une cellule pour générer des forces et sonde son environnement influe sur son comportement biologique, mise en scène par exemple prolifération ou différenciation2,3. À son tour, la mesure des forces cellulaires est une aide importante pour étudier la régulation de la production de force et de comprendre son implication dans la cellule comportement et tissu sort4,5.
Ces dernières années ont vu le développement de nombreuses techniques pour mesurer les forces qu’une cellule peut exercer sur son environnement6. La majorité d'entre eux ont contribué à révéler que la traction des forces que les cellules exercent comme ils tirent sur les sondes mobiles ou un substrat déformable. Cependant, les forces mécaniques impliquées en saillie dans l’environnement extracellulaire souffrent d’un manque de techniques de mesure et sont à ce jour n’est pas bien caractérisé.
Pour contourner cette limitation, nous présentons une méthode pour mesurer les forces exercées perpendiculairement au substrat. Il consiste en la plaquant sur une mince feuille élastique qui peut se déformer dans la direction orthogonale, ce qui permet de mesurer la déformation du substrat par les cellules et en déduire les forces en présence, les cellules vivantes. Topographie de substrat est mesurée à l’échelle nanométrique de résolution à l’aide de la microscopie à force atomique et de l’évaluation des forces de déformation s’appuie sur la connaissance de la géométrie des structures cellulaires protrusive7,8, 9.
Nous décrivons ici le programme d’installation et de son application pour mesurer les forces générées par les podosomes, structures d’adhérence protrusive formés par les macrophages pour leur migration mésenchymateuse dans des environnements en trois dimensions10,11, 12,13,14,15,16,17. Nous pensons que cette technique fera progresser la compréhension de la mise sur pied et sa régulation dans les nombreux processus cellulaires impliquant la saillie.
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Protocol
1. préparation des grilles Formvar-enduit
- Nettoyer les grilles de la microscopie électronique avec de l’acétone pur et séchez-les sur du papier filtre. Puis nettoyez avec de l’éthanol pur, une lame de microscope, essuyer avec un papier de lentille et enlever la poussière avec un ventilateur.
- Placez une lamelle de verre nettoyé à l’éthanol verticalement dans l’entonnoir d’un film de dispositif de moulage contenant une solution de Formvar dans la partie inférieure. Recouvrir le haut de l’entonnoir.
- 100 mL de solution de Formvar (0,5 % en chlorure d’éthylène) la pompe avec la poire atomiseur jusqu'à ce que le niveau atteigne les deux tiers de la diapositive.
- Garder la lame dans la solution pendant 1 min.
- Ouvrez le robinet de l’appareil pour vider la solution Formvar dans un flot continu. Un débit de 10 à 15 mL/s produira un film Formvar de 30 à 80 nm. L’épaisseur du film est déterminée par la concentration de la solution de Formvar et par le débit de drainage.
Remarque : Le débit de drainage peut être contrôlé par la pression par la soupape d’air sortie d’évacuation en ouvrant lentement le robinet. Plus vite le drainage, le plus épais du film. Dans la pratique, parce qu’il est difficile de prévoir l’épaisseur de la couche de la vitesse d’écoulement de Formvar, nous préparons plusieurs lots de Formvar films et contrôler leur épaisseur par AFM (voir étape 2). - Retirez la lame de la chambre et séchez-le délicatement sur un papier filtre pour enlever n’importe quel liquide Formvar.
- Découper un rectangle de 20 x 50 mm du film Formvar avec une lame de rasoir.
- Remplir un bécher d’eau distillée et lentement plonger la lame verticalement dans l’eau à flotter sur le film : le film devrait flotter à la surface de l’eau.
- Relever le lieu nettoyé à l’acétone secs grilles sur le film, brillant.
- Placez une lamelle de verre rond (Ø 12 mm) sur quelques uns des grilles. Cette lamelle servira à mesurer l’épaisseur de film (voir étape 2).
- Couvrir une lame de microscope avec un autocollant blanc redimensionné pour s’adapter à elle. Tremper la lame verticalement à la frontière du film Formvar flottant jusqu'à ce que tout le film adhère à la diapositive. Retirer l’eau en excès de la diapositive avec le papier filtre et laisser sécher à température ambiante pendant la nuit.
2. mesure de l’épaisseur du Film
- Couper le Formvar autour de la lamelle couvre-objet avec la pince à épiler pour détacher de la diapositive.
- Marquer l’emplacement de la grille sous la lamelle avec un stylo.
- Couper le Formvar autour de la grille marquée pour détacher de la lamelle. Il y aura donc un trou dans la feuille de Formvar restante, qui permettra de mesurer l’épaisseur du film. Couvrir la lamelle avec du PBS et le placer sur une lame de verre sur le microscope.
- Monter un cantilever de nitrure de silicium sur la brique de verre AFM, veillant à ce que la bande d’or n’est pas couvert par l’extrémité du ressort.
Remarque : La sensibilité et la constante du ressort du levier doivent ont précédemment été calibrés dans du PBS. - Monter la brique de verre sur le module de l’AFM et ensuite placer le module sur le microscope.
- Placer la lamelle Formvar-enduit à la chambre d’observation et la couvrir avec 500 µL de PBS.
- Scan de la frontière du trou dans la feuille de Formvar utilisant l’AFM dans le mode de contact et un point de consigne de force nN 0,5.
- Utilisez la surface de lamelle de verre comme référence pour les mesures de hauteur et d’évaluer l’épaisseur de Formvar comme la hauteur de la section transversale (mesurer au moins 10 par Formvar lot).
3. ensemencement de cellules sur des grilles
- Sous hotte stérile, mettre une bande (12 x 3 mm) de ruban adhésif double-face sur un lamelle couvre-objet.
- Découper une grille Formvar-enduit avec des pincettes et mettez-le à l’envers sur la bande adhésive (seulement la jante de la grille doit être attachée à la bande). Le film de Formvar doit faire face à la lamelle.
- Mettre cet appareil dans une culture bien.
- Placer une goutte de 10 µL de RPMI sans FCS contenant 104 macrophages différenciés des monocytes humains16.
Remarque : Veillez à ne pas toucher la grille avec l’embout de la pipette pour éviter d’endommager le revêtement Formvar. - Incuber 30 min (37 ° C, 5 % de CO2) pour laisser les cellules adhèrent.
- Remplir le puits avec 2 mL de RPMI contenant 10 % FCS.
- Incuber le dispositif pendant 2 h à 37 ° C et 5 % de CO2 à laisser les cellules à respecter avant l’observation de l’AFM.
4. topographie mesures de déformations induites par le podosomes
- Coller deux bandes de ruban adhésif double-face sur un fond de verre plat de Pétri.
Remarque : La distance entre les deux bandes doit être inférieure au diamètre de la grille. - Soigneusement détacher la grille plaquée avec du ruban adhésif, les macrophages.
- Renversez la grille afin d’avoir des cellules face à la vitre et le bâton de la grille se trouvant entre les deux bandes adhésives.
- Fixer la grille avec deux nouvelles bandes d’adhésif double-face : la grille sera ainsi intercalée entre deux bandes adhésives, laissant la zone centrale de la grille accessible à la pointe de l’AFM.
Remarque : Assurez-vous que la grille soit bien fixée et pas tordue ; sinon le cantilever AFM ne peut-être pas en mesure d’approcher la surface Formvar. - Remplissez la boîte de Pétri avec 2 mL de milieu de culture préchauffé 37 ° C (RPMI avec 10 % FCS) additionné de 10 mM HEPES (pH 7,4).
- Placez la boîte de Petri sur un chauffe plat de 37 ° C.
- Installer l’appareil à plat sur la scène de l’AFM.
- Laisser le système se stabiliser à 37 ° C.
- En mode de contact avec une force nN 0,5, faire une première image globale pour localiser les podosomes et puis analyser la topographie Formvar à 3 Hz avec un pixel environ 20 nm-grand.
NOTE : Éviter d’analyser près des bords de la grille.
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Representative Results
Le protocole ci-dessus décrit comment préparer le montage expérimental de quantifier protrusion forces exercées par les macrophages podosomes sur un substrat de Formvar. Ceci est réalisé en utilisant le manuel de vol et est illustrée à la Figure 1.
Lorsqu’on analyse une image topographique des renflements sous podosomes en utilisant le logiciel de traitement de données JPK, un polynôme du troisième degré ajustement devrait être déduit de chaque ligne de numérisation indépendamment. La hauteur maximum des bosses induite sur les podosomes peut être évaluée en ajoutant une échelle de couleurs de z sur le côté de l’image. Après avoir été exportées au format TIFF, l’image topographique est plus analysé utilisant un dédié artisanale ImageJ macro disponibles en ligne8. Cette macro localise les renflements sur l’image de hauteur corrigée et donne une carte de force (Figure 2) selon les paramètres donnés : Formvar film épaisseur et podosomes bague rayon. En outre, la macro génère également un fichier texte avec les coordonnées, la hauteur et la valeur de la force calculée pour chaque bulbe détectée à la surface de Formvar.
Ce processus s’applique également dans le cas d’acquisitions Time-lapse. La macro puis suit chaque bosse du point milieu de temps à partir et vers l’arrière, demandant la validation de l’utilisateur en cas de doute.
Figure 1 : Montage expérimental
Illustration schématique de l’installation expérimentale. Les cellules sont ensemencées sur une grille de microscopie électronique recouverte d’une pellicule de Formvar mince, conforme et la grille est placée, les cellules vers le bas, à l’intérieur d’une boîte de Pétri. Pour coller à un substrat, macrophages forment des structures d’adhérence très dynamique submicronique appelés podosomes. La topographie du film Formvar sous les cellules est imagée puis à l’aide d’AFM. Podosomes appliquer des forces orthogonales au substrat, entraînant renflements sur sa surface.
Figure 2 : Déformation du substrat et des forces exercées par les podosomes
Topographie du film Formvar sur la face arrière des cellules montrant la déflexion (panneau de gauche) et hauteur (panneau central, des codes de couleur pour la hauteur). Les bourrelets observées sur le film correspondant à la déformation par podosomes individuels. La force appliquée par chaque podosomes est évaluée par le modèle (panneau de droite, chaque point correspond à un podosomes et valeurs de force sont codés par couleurs). Barre d’échelle : 5 µm.
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Discussion
Propriétés des matériaux
Le choix du matériau de la membrane déformable, dans notre cas Formvar, il faut remplir quelques conditions. Le matériel doit être transparent à la lumière visible et fluorescence auto limitée pour permettre des observations dans le champ lumineux et la microscopie de fluorescence. La rugosité de la couche mince doit être bien inférieure à 10 nm pour éviter tout effet topographique sur l’adhérence des cellules et permettre à claire observation des protubérances induite par la cellule par imagerie de l’AFM. Enfin, la rigidité de la membrane, qui dépend de la Young module et épaisseur du matériau, doit être suffisamment élevée pour induire la formation de podosomes tout en gardant certains déformabilité observable pour les contraintes typiques généré sur les sites de podosomes qui sont autour de 10 à 100 kPa. Matériel de formvar, préparé en couches minces de 30 à 80 nm est un bon compromis entre toutes ces contraintes. Il est intéressant de remarquer que, par le réglage de l’épaisseur de la membrane de Formvar, sa rigidité peut être ajustée pour étudier les propriétés mechanosensing de podosomes7.
Reproductibilité et qualité de préparation de Formvar
Certains lots de Formvar présentent des plis sur la grille et sont donc inutilisables : cela peut être considéré au préalable sur des images de champ lumineux. Dans notre expérience, nous avons besoin des grilles multiples pour une condition parce que parfois le montage de la grille n’est pas parfait et la grille se déplace ou reçoit tordu. L’épaisseur du film Formvar doit être adaptée à la force attendue. Le plus épais du film, la plus rigide, il est, mais plus les déformations sera, complique davantage d’observation. À l’inverse, le plus mince du film, le plus fragile c’est et les plus difficiles à manipuler sans déchirure il.
Influence de la force appliquée par le cantilever sur mesures topographie
Pour obtenir une mesure de la déformation du film sans affectant l’activité de nanomécanique des podosomes ni déformer le film avec la sonde de l’AFM, il est crucial de contrôle des forces appliquées au cours de l’imagerie de l’AFM. En effet, appliquer une force excessive pendant la formation image peut conduire à une surestimation de la hauteur de la saillie et donc de la force de la saillie. En d’autres termes, il est nécessaire de limiter cette force loin de la force de décrochage du site qui dépasse. Nous vous recommandons de limiter les forces appliquées au cours de l’imagerie autour de quelques centaines de pico-newtons.
Modèle pour saillie forcer l’évaluation
Pour convertir des mesures topographiques de l’AFM en valeurs de force, il est nécessaire de définir les conditions aux limites et à connaître la configuration spatiale de l’application des forces. Dans le cas de podosomes, nous avons proposé un modèle basé sur les connaissances actuelles de son organisation moléculaire et vérifié que ce modèle fourni des profils de déformation conformes aux observations topographiques8. Plus précisément, nous avons modélisé le noyau dense de polymérisation des filaments d’actine verticale entourés par un anneau de protéines d’adhésion comme un module central poussant le substrat et un module périphérique en tirant dessus. Déformation de substrat de ces deux modules agissant a été déterminée en utilisant des simulations par éléments finis, menant à une relation de force / déformation. Grâce à cette approche numérique, nous avons caractérisé l’influence de chaque paramètre géométrique sur la relation force-déformation, montrant qu’anneau diamètre et substrat l’épaisseur nécessaire pour être mesuré avec précision. La relation entre la hauteur h d’un renflement dans le substrat et la force F appliquée par un podosomes peut être exprimée en F = C0 E / (1-υ2) e3/r2 h, où E = 2.1 GPa est le module de Young de Formvar et υ = 0,3 son ratio de Poisson7, C0 est une constante égale à 2,7 et e et r respectivement désignent film épaisseur et podosomes rayon8. Pour chaque condition, la valeur moyenne de r provient d’images de fluorescence de podosomes.
Applications de la microscopie à Force saillie
Microscopie à force saillie a été utilisée avec profit dans les macrophages à tester l’importance des protéines spécifiques sur pied d’une force podosomes, démontrent le rôle mécanique des podosomes anneau18 et révéler des corrélations spatio-temporelles de la force génération entre proches voisins au sein du réseau de podosomes8.
Les cellules ont été trouvés à empiéter sur leur environnement dans plusieurs processus biologiques. Les cellules de tumeur invasive utilisent protrusive structures appelées invadopodia, qui sont essentiels à la dégradation de la matrice extracellulaire19. Les lymphocytes ont démontré à empiéter sur les cellules endothéliales au cours de leur diapédèse transcellulaire à travers l' endothélium20. Certains cas de l’interaction cellule-cellule s’appuient également sur les cellulaires qui dépassent les structures : c’est le cas pour la reconnaissance de l’antigène des lymphocytes T sur les cellules endothéliales21et pour l’initiation de la fusion cellulaire qui conduit à des ostéoclastes multinucléées soit de myotubes 22 , 23 , 24. Enfin, le processus d’internalisation tels que ce projet autour de la cible des structures cellulaires d’utilisation de phagocytose axée sur l’actine corps25. Étudier les forces générées par la saillie des structures va certainement aider à faire la lumière sur les mécanismes en jeu dans ces processus.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants envers Anna Labernadie, Guillaume Charrière et Patrick Delobelle pour leur contribution initiale à ce travail et à Matthieu Sanchez et Françoise Viala pour leur aide avec vidéo de tournage et de montage. Ce travail a été soutenu par l’Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM Plan Cancer, Fondation Toulouse Cancer et Human Frontier Science Program (RGP0035/2016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
References
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