Summary
Nous décrivons ici un protocole afin d’étudier la prénylation et la guanosine-5'-triphosphate (GTP)-chargement de la Rho GTPase. Ce protocole comprend deux méthodes détaillées, à savoir fractionnement membrane et une GTPase-immuno assay. Le protocole peut être utilisé pour mesurer la prénylation et la GTP chargement de différentes autres petites GTPases.
Abstract
La famille Rho GTPase appartient à la superfamille des Ras et comprend environ 20 membres chez les humains. GTPases Rho sont importants dans la régulation des différentes fonctions cellulaires, y compris la dynamique du cytosquelette, motilité cellulaire, polarité cellulaire, guidage axonal, trafic vésiculaire et contrôle du cycle cellulaire. Changements dans la signalisation de la Rho GTPase jouent un rôle réglementaire essentiel dans nombreuses pathologies, comme le cancer, les maladies du système nerveux central et dépendant du système immunitaire maladies. La modification post-traductionnelle des GTPases Rho (c.-à-d., prénylation de mévalonate voie intermédiaires) et liant GTP sont des facteurs clés qui influent sur l’activation de cette protéine. Dans le présent document, deux méthodes simples et essentiels sont fournis pour détecter une large gamme de Rho GTPase prénylation et activités de fixation de GTP. Détails des procédures techniques qui ont été utilisées sont expliquées étape par étape dans ce manuscrit.
Introduction
GTPases Rho sont un groupe de petites protéines (21-25 kDa), qui sont bien conservée tout au long de l’évolution et forment une sous-famille unique dans la superfamille de Ras des petites GTPases. Dans chaque sous-famille au sein de cette superfamille, il y a un noyau de domaine G partagé qui est impliqué dans l’activité GTPase et nucléotides échange1. La différence entre la famille Rho et autres sous-familles Ras est la présence d’un « domaine d’insert Rho » dans le brin β 5ème et le 4ème α hélice dans le petit du domaine GTPase2.
D’après la classification récente, Rho GTPases sont considérés comme une famille de protéines qui entrent dans la superfamille de Ras GTPase3de signalisation. Chez les mammifères GTPases Rho ont 22 membres selon leur fonction spécifique et caractérisation générale4 dans lequel RhoA, Rac1 et Cdc42 comptent parmi les membres plus-étudiées dans ce groupe. GTPases Rho sont liés à intracellulaire signalisation voies via un mécanisme étroitement réglementé, qui dépend de commutateurs moléculaires via la protéine des modifications post-traductionnelles5.
Chargement de GTP et l’hydrolyse sont des mécanismes essentiels dans le cycle d’activation/désactivation des petites GTPases Rho et sont réglementées par l’intermédiaire des protéines GTPase-activating (lacunes). Les lacunes sont responsables de l’hydrolyse du GTP et travaillent de concert avec la guanine nucleotide exchange des facteurs (elle) qui sont responsables de la réaction de GTP-chargement. Inhibiteurs de la dissociation du PIB Rho (GDIs) fournissent réglementation des petites GTPases Rho via la liaison pour le PIB lié aux Rho GTPases. Cela inhibe la dissociation du PIB et facilite la séquestration des petites GTPases Rho loin des sites de la membrane intracellulaire active. Il y a aussi plus régulation des protéines Rho GTPase impliquant la prénylation des GDIs qui réglemente l’hydrolyse des nucléotides et exchange et contrôles GDP/GTP cyclisme1,6,7,8.
GTP-chargement tant Rho GTPase prénylation sont impliqués dans le mouvement de la Rho GTPase entre le cytosol et les membranes cellulaires en modifiant les propriétés lipophiles de ces protéines1,9. Les organismes de réglementation susmentionnée interagissent avec les phospholipides de la membrane cellulaire et d’autres protéines de modulation de l’activité/échange GDP/GTP10. En outre, GDIs, inhibiteurs de la dissociation, bloquent l’hydrolyse du GTP tant l’échange GDP/GTP. GDIs inhibent la dissociation des protéines Rho inactifs du PIB et, par conséquent, leur interaction avec les effecteurs en aval. GDIs réglementent aussi le cycle des GTPases entre le cytosol et la membrane de la cellule. L’activité des GTPases Rho dépend dans une large mesure leur mouvement vers la membrane cellulaire ; ainsi, GDIs sont considérés comme des régulateurs critiques qui peuvent séquestrer GTPases dans le cytoplasme grâce à cacher leur région hydrophobe/domaines11,12.
Pour Rho GTPase d’avoir une signalisation optimale et la fonction à tous les stades de son cycle d’activation, le cycle dynamique de l’hydrolyse du GTP-chargement/GTP est crucial. Tout type d’altérations dans ce processus peut entraîner des changements subséquents dans les fonctions cellulaires relevant de la Rho GTPase, comme cellule polarité, prolifération, morphogenèse, cytocinèse, migration, adhérence et la survie de13,14.
Le protocole actuel fournit aux lecteurs une méthode détaillée pour surveiller les petits RhoA GTPase activation via l’enquête leur prénylation et GDP/GTP chargement. Cette méthode peut également être utilisée pour détecter la prénylation et la liaison de GTP d’un large éventail de petites GTPases. La GTPase immuno-peut être utilisé pour mesurer le niveau de l’activation d’autres sortes de GTPases, tels que Rac1 Rac2, Rac3, H-, K- et N-Ras, Arf et Rho15. La simvastatine agent pharmacologique est utilisé à titre d’exemple, comme il a été récemment signalé à être impliqué dans la régulation des petits Rho GTPase prénylation et activité8,9,14,,16.
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Protocol
1. détermination de RhoA localisation à l’aide de fractionnement Membrane/Cytosol
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Traitement de culture et de la simvastatine cellulaire
- Graine de 50 000 de U251 cellules dans un 100 mm plat et leur culture à de Dulbecco aigle modifié (DMEM) (hyperglycémie, sérum de veau fœtal [BF] 10 %).
- Quand 30 % anastomosé, traiter les cellules en enlevant le milieu et en y ajoutant milieu contenant du simvastatine (10 µM de simvastatine dissous dans le diméthylsulfoxyde [DMSO]) et incuber pendant 36 h à 37 ° C8. Utilisation de DMSO seul comme un contrôle de véhicule.
Remarque : 10 millions de cellules sont nécessaires pour le fractionnement cytosol et la membrane des cellules.
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Collection de cellules
- Éliminer les cellules de l’incubateur à 37 ° C. Regardez les cellules au microscope afin de confirmer la confluence.
Remarque : Les cellules doivent être anastomosé 70 % - 80 %. - Aspirez le milieu, laver les cellules 1 x avec froide solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 5 mL de tampon (EDTA) de l’acide éthylènediaminetétraacétique (KCl : 400 mg/L, NaCl : 6800 mg/L, NaHCO3 : 2 200 mg/L, NaH2PO4. H2o : 140 mg/L, D-glucose : 1 000 mg, disodium EDTA : 373 mg/L) par plaque et placer les cellules de nouveau dans l’incubateur de 37 ° C pendant 5 min.
- Après 5 min d’incubation, recueillir l’EDTA avec les cellules dans un tube de 15 mL contenant la même quantité de médium comme l’EDTA.
Remarque : Vu moyen dans le tube neutralise l’EDTA et empêche toute autre digestion des membranes cellulaires. - Placer le tube dans une boîte de glace et passez à la centrifugeuse.
- Mettre en place la centrifugeuse à 1 500 x g à 4 ° C et faire tourner les cellules pendant 5 min.
- Retirez le surnageant sans déranger le culot et ajouter 1 mL de PBS froid. Bien mélanger les cellules.
- Transférer le mélange de cellules (solution) dans un nouveau tube de 1,5 mL, centrifuger à 1 500 x g à 4 ° C et faire tourner les cellules pendant 5 min.
- Vérifiez la taille de granule (pour estimer le volume de la mémoire tampon pour l’étape suivante). Placer les échantillons sur la glace. Éliminer complètement le liquide surnageant sans déranger le culot.
- Ajouter glacee tampon (10 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1 mM dithiothréitol et inhibiteur de la protéase cocktail), mélanger les échantillons bien par pipetage de haut en bas et puis, passez à la sonication.
- Éliminer les cellules de l’incubateur à 37 ° C. Regardez les cellules au microscope afin de confirmer la confluence.
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Sonication
- Définissez le sonicateur pour cinq cycles, 5 s de chaque et répéter 3 x.
- Effectuer la sonication sur glace. Passez à l’ultracentrifugeuse.
NOTE : Glace et état froid préserver les protéines et rendre les résultats plus fiables.
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Ultracentrifugation
- Utiliser une ultracentrifugeuse pour séparer les homogénats cellulaires en cytoplasmique et fractions de membrane. La valeur de la centrifugeuse à 100 000 x g pendant 35 min à 4 ° C. Comme illustré à la Figure 1, vérifiez la taille de granule.
Remarque : La fraction de membrane est tout en bas du tube et le reste est autres composants cytoplasmiques. - Recueillir le liquide surnageant complètement tout en faisant attention de ne pas déranger le culot. Le surnageant est le cytosol. Placer le surnageant dans un tube nouvellement identifié.
- Ajouter 300 µL de tampon (buffer II) de la dissociation (50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0,15 M NaCl, 1 mM dithiothréitol, 1 % SDS, EDTA 1 mM, 1 mM EGTA et inhibiteur de la protéase cocktail) au culot (contient la fraction membranaire). Bien mélanger en pipetage de haut en bas.
- Procéder à la détermination des protéines et préparation des échantillons par transfert western (immunobuvardage).
- Utiliser une ultracentrifugeuse pour séparer les homogénats cellulaires en cytoplasmique et fractions de membrane. La valeur de la centrifugeuse à 100 000 x g pendant 35 min à 4 ° C. Comme illustré à la Figure 1, vérifiez la taille de granule.
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Immunoblotting
- Préparer la protéine cellulaire extraits les fractions séparées dans le tampon de lyse (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], PMSF, 0,5 % de détergent non ionique-40, 100 µM β-glycérol 3-phosphate et 0,5 % inhibiteur de protéase cocktail à 0,5 mM).
- Mesurer la concentration de la protéine à l’aide de la méthode de Lowry8 et calculer le volume de la mémoire tampon de lyse (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], PMSF 0,5 mM, 0,5 % de détergent non dénaturant, octylphenoxypolyethoxyethanol, 100 µM β-glycérol 3-phosphate et 0,5 % cocktail d’inhibiteur de la protéase) pour normaliser la concentration de protéine entre les échantillons.
- Faites chauffer les échantillons à 90 ° C pendant 5 min et charger 15-20 µL des échantillons sur un gel SDS-PAGE de 15 % pour séparer les protéines.
Remarque : Charge 1 µg de protéines pour chaque échantillon. Calculer le volume qui doit être exécuté en conséquence. - Transférer les protéines séparées sur les membranes en nylon dans des conditions (500 nM glycine, Tris-HCl 50 mM et 20 % de méthanol) pendant 2 h, à température ambiante (RT) à 100 V réductrices.
Remarque : Pour confirmer le transfert réussi de protéine, utilisez Ponceau tache ou visualiser le marqueur de protéine sur la membrane. - Bloquer les membranes avec 5 % lait écrémé en poudre et 1 x Tris salin contenant un détergent (TBS/0.01% détergent non-ionique ; TBST) pour bloquer la liaison des anticorps non-spécifiques à 4 ° C durant la nuit ou à la droite pendant 1 h.
- Ajouter des anticorps primaires pour l’analyse de l’immunotransfert et incuber une nuit à 4 ° C.
Remarque : Dans cette expérience, Rac1/2/3, cdc42, RhoA, GAPDH et pan-cadhérine ont été utilisées à une dilution de 1 : 1 000 dans le lait 1 % 1 x TBST. Pan-cadhérine et GAPDH ont servi à confirmer la membrane et la pureté de la fraction cytosolique, respectivement. - Laver les membranes 3 x avec un tampon de lavage avec 1 x TBST pendant 20 min.
- Incuber les membranes avec la peroxydase du raifort anti-lapin (HRP)-conjugués anticorps secondaire pour les anticorps primaires respectifs (pour 1 h à RT).
- Laver les taches 3 x pendant 20 min et développez-les avec détection par chimiluminescence améliorée (ECL).
2. mesure de la charge de GTP RhoA à un dosage de petites protéines G Activation
- Compte 10 000 cellules/mL et la culture, les cellules U251 dans un 100 mm plat.
- Quand ils sont 30 % anastomosé, traiter les cellules avec la simvastatine, comme indiqué au point 1.1.2.
- Mettre les plaques de culture hors de l’incubateur. Regardez les cellules au microscope afin de confirmer la confluence. Veiller à ce que les cellules sont confluents de 70 à 80 %. Placez la boîte de Pétri sur glace, aspirer les médias et laver les cellules 3 x avec glacee PBS (pH 7,2).
- Aspirer le PBS. Incliner la boîte de Pétri sur glace pendant une minute supplémentaire enlever tous les restes de PBS.
NOTE : PBS résiduel porte atteinte à cet essai. - Lyse des cellules dans un volume de 700 µL de tampon de lyse glacé contenant des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase.
NOTE : 700 µL est généralement suffisant pour un 100 mm boîte de Pétri. Voir le tableau 1 pour trouver le bon volume pour chaque récipient de culture. - Récolter le lysat cellulaire avec le grattoir de cellules. Inclinaison de la plaque de culture pour cette technique.
- Transférer le lysat dans un cryotube glacee étiquetée et gardez-le sur la glace.
- Mélanger soigneusement à l’aide d’un vortex. Garder 10 µL du lysat pour le dosage de la protéine, pour mesurer la concentration de protéines dans l’échantillon.
- Clin d’oeil-gel la cellule de lysat dans l’azote liquide.
NOTE : Préparez plusieurs parties aliquotes de lysat avant snap-congélation, eux, pour éviter les cycles répétés de gel et de dégel qui peuvent conduire à la perte d’activité de la RhoA GTPase cellulaire. - Transférer les cryotubes snap-congelés dans un congélateur à-80 ° C et stocker les échantillons pour le dosage immuno-GTPase.
Remarque : Ne pas stocker les échantillons pendant plus de 14 jours. Travailler rapidement et ne jamais laisser les échantillons sur glace pendant plus de 10 min. Ne jamais manipuler toutes les boîtes de Pétri en même temps. - Mesurer la concentration de la protéine à l’aide de la méthode de Lowry8 et calculer le volume de la mémoire tampon de lyse pour normaliser la concentration de protéine entre les échantillons.
Remarque : La meilleure concentration est généralement 1 mg/mL ; Cependant, 0.3 - 2 mg/mL peut être détectable. - Préparer un contrôle à blanc en ajoutant 60 µL de tampon de lyse et 60 µL de tampon de liaison à un microtube.
Remarque : Le contrôle à blanc a tous les réactifs sauf l’antigène et est utilisé pour la soustraction de l’arrière-plan. - Préparer un témoin positif en ajoutant 12 µL de protéine contrôle Rho, 48 µL de tampon de lyse et 60 µL de tampon de liaison.
Remarque : Le contrôle positif a tous les réactifs et un antigène confirmé pour Rho-A-GTP. - Sortez la plaque d’affinité Rho son sac et placez-le sur la glace.
- Dissoudre la poudre dans les puits avec 100 µL d’eau distillée glacée. Maintenir la plaque sur la glace.
- Décongeler les lysats de cellules snap congelé dans un bain d’eau réglé à 25 ° C.
- Ajouter le volume calculé de tampon de lyse glacée (de l’étape 2.11) pour chaque échantillon de normaliser le taux protéique.
Remarque : Retirez les PBS après avoir lavé les cellules (à l’aide d’un aspirateur de tube à vide) pour éviter de causer des changements dans la composition de la mémoire tampon de lyse. Égaliser la protéine de l’échantillon à une concentration comprise entre 0,8 et 2 mg/mL pour une comparaison précise entre les échantillons lors d’essais d’activation de GTPase. Le tableau 2 fournit des détails sur la mémoire tampon à utiliser pour ce test. - Transférer 60 µL des échantillons glacee normalisées pour microtubes et ajouter 60 µL de liaison tampon ; bien mélanger les échantillons et les garder sur la glace.
- Supprimer complètement l’eau/solutions de la microplaque effleurement vigoureux, suivie de cinq à sept robinets durs sur un tapis de laboratoire.
- Ajouter 50 µL des échantillons normalisés, un contrôle à blanc et un contrôle positif aux puits de doublons.
- Placer la plaque dans un agitateur orbital pendant 30 min à 4 ° C à 300 tr/min.
Remarque : L’agitation est très important, et il est recommandé d’utiliser l’agitateur orbital plaque à 300 tr/min. - Effacer les échantillons de la plaque en effleurant et les laver 2 x avec 200 µL de tampon de lavage à RT. vigoureusement retirer le tampon de lavage des puits après chaque lavage effleurement suivie d’écoutes et garder la plaque sur le banc à température ambiante.
- Ajouter 200 µL de tampon de présentatrices de RT dans chaque puits et incuber à RT pendant 2 min.
- Effleurez la solution des puits et laver les puits 3 x avec 200 µL de tampon de lavage à température ambiante.
- Ajouter 50 µL de fraîchement préparée 1/250 anti-RhoA anticorps primaire dans chaque puits.
- Placer la plaque dans un agitateur orbital pendant 45 min à 300 tr/min, réglé à 25 ° C. Feuilleter la solution du puits.
- Répétez les étapes de lavage 2 x (étape 2.24).
- Ajouter 50 µL d’anticorps secondaire fraîchement préparés au 1/250 anti-RhoA dans chaque puits.
- Placer la plaque sur un agitateur orbital pendant 45 min à 300 tr/min, réglé à 25 ° C.
- Préparer le réactif de détection HRP en mélangeant des volumes égaux de réactif A et réactif B.
- Effleurez la solution de chaque puits et laver les puits 3 x avec 200 µL de tampon de lavage à température ambiante.
- Ajouter 50 µL de réactif de détection HRP fraîchement préparée dans chaque puits.
- Lire le signal luminescent dans 3-5 min pour obtenir le signal maximum et analyser les résultats à l’aide d’un logiciel approprié.
NOTE : Lecture doit se faire dans les 3-5 min pour obtenir le signal maximum. Exécuter une « plaque d’essai » pour confirmer la lyse bonne volume tampon est utilisé pour les lysats cellulaires afin que la concentration de protéine est assez élevée pour détecter une activité de RhoA GTPase. (Une plaque d’essai est une plaque de cellules utilisées afin de déterminer si la concentration de protéines entrent dans la plage acceptable et pour déterminer si le volume de la mémoire tampon de lyse utilisé est approprié). Le contrôle positif doit se lire 4 à 10 fois plus élevé que les puits vides si c’est dans la gamme linéaire. Si ce n’est pas le cas, puis ajustez le luminomètre en consultant le fabricant. Les paramètres pour le luminomètre sont donnés dans le tableau 3. - Entrez les données brutes en colonnes où les rubriques lire échantillon, moyenne, écart-type, rep1, rep2, rep3et rep4, qui est de montrer le nombre de répétitions effectué sur chaque échantillon.
- Sous la moyenne, entrez la formule =average(Xn:Yn) où X = l’indicateur de la colonne pour rep1, Y = l’indicateur de la colonne pour rep4et n = l’indicateur de ligne de la ligne en cours d’élaboration.
- Au titre de l' écart-type, entrez la formule = stdev (Xn:Yn) où X = l’indicateur de la colonne pour rep1, Y = l’indicateur de la colonne pour rep4et n = l’indicateur de ligne de la ligne en cours d’élaboration.
- Introduire les données reproduites dans rep1, rep2, etc.
- Après avoir entré les données, utilisez la méthode cliquer-glisser pour sélectionner l’échantillon, signifieret écart-type.
- Puis, dans le logiciel d’analyse de données, sélectionnez la fonction graphique faisant qui ressemble à un carré avec un graphique à barres mini à l’intérieur.
NOTE : Ceci fait apparaître le tableau processus décisionnel où il est possible d’abaques de calcul basés sur les données entrées. - Choisissez histogramme et, pour les valeurs d’entrée, désigner les nombres signifient .
Remarque : Le tableau pour les numéros veux dire fait tout d’abord, et ensuite, la colonne écart-type pour les barres d’erreur axe y est désignée. Pour ce faire, double-cliquez sur les barres du graphique, cliquez sur l’onglet de l’erreur de l’axe des ordonnées , cliquez sur l’option personnalisée et sélectionnez la zone dans la feuille de calcul pour entrer dans l’emplacement de l’écart-type de données. La différence entre les groupes qui doivent être comparées peut être vu après la création des cartes désirés.
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Representative Results
Fractionnement de la membrane :
Ultracentrifugation a été utilisée pour le fractionnement des composants membranaires et cytosoliques. Comme illustré à la Figure 1, le surnageant contient le cytosol et le culot la fraction membranaire. L’abondance de RhoA dans les fractions cytosoliques andmembrane obtenus à partir des cellules U251 a été examiné après le traitement avec la simvastatine utilisant immunoblotting. La pureté et le contrôle de la fraction membranaires et cytosoliques de chargement ont été confirmés par pan-cadhérine et GAPDH respectivement. Tel qu’illustré à la Figure 2, le traitement de la simvastatine réduit le montant de la membrane-bondissent RhoA GTPase, alors qu’il a son contenu cytosolique. Cela est compatible avec les effets connus des statines sur la translocation des GTPases basée sur l’inhibition de RhoA prénylation. Simvastatin inhibe la prénylation de RhoA GTPase, et par conséquent, unprenylated RhoA est incapable de jeter l’ancre dans les membranes de cellules de plasma, qui se traduit par ses plus fortes concentrations cytosoliques.
RhoA-GTP lié :
On a mesuré la protéine RhoA GTP lié à l’aide d’un ELISA GTPase et a montré que simvastatine significativement (P < 0,05) a augmenté de RhoA GTP lié aux cellules U251 (Figure 3). Par conséquent, tandis que la simvastatine a inhibé la prénylation de protéine RhoA GTPase (Figure 2), elle augmente aussi sa GTP chargement contre les cellules du contrôle. Cela souligne le fait que la prénylation et GTP liant les deux jouent un rôle dans l’activité et la réglementation de RhoA GTPase. Pour plus de détails au sujet de ce phénomène, veuillez consulter la publication originale en utilisant ce protocole8.
Figure 1 : Vue schématique des fractions cytosoliques et membrane après ultracentrifugation. Le culot contient la fraction membranaire et le surnageant contient le cytosol.
Figure 2 : Simvastatin modifie la localisation de RhoA. U251 cellules ont été traités par simvastatine (10 µM ; 12, 24 et 36 h) et l’abondance de RhoA dans la membrane et les fractions cytosoliques a été déterminée par immunoblotting. L’abondance GAPDH et pan-cadhérine a aussi évalué à contrôler pour le chargement dans les fractions cytosoliques et membranaires et de confirmer l’absence de contamination cytosolique dans les fractions membranaires. Les données proviennent en général de trois expériences indépendantes à l’aide de différentes cultures primaires. Ce chiffre a été modifié par Alizadeh et al. 8. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Simvastatin module l’activité de RhoA GTPase. La GTPase immuno-a été utilisé pour mesurer des protéines Rho GTP lié aux cellules U251. Des conditions différentes ont été testées pendant 36 h, y compris la famine et la simvastatine (10 µM). Pour chaque expérience, une protéine RhoA constitutivement active fournie dans le kit a été utilisée comme témoin positif. Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± écart type des deux répliques en expériences indépendantes (* P < 0,001). Ce chiffre a été modifié par Alizadeh et al. 8.
| Récipient de Culture cellulaire | Superficie (cm2) | Tampon de lyse (µl) | |
| Plats | 35 mm | 9 | 100 |
| 60 mm | 21 | 300 | |
| 100 mm | 55 | 700 | |
| 150 mm | 145 | 1500 | |
| Plaques | 6 puits | 9.4 / bien | 100 |
| 12-puit | 3.8 / bien | 70 | |
| 24 puits | 1.9 / bien | 40 | |
| Fioles jaugées | T-25 | 25 | 250 |
| T-75 | 75 | 1000 | |
| T-150 | 150 | 1500 | |
Tableau 1 : Suggérés volumes de tampon de lyse des cellules U251. Le volume est réglable pour différents types de cellules.
| Nom de tampon de lyse | Composition de tampon de lyse | Petite protéine G cible | Notes |
| GL35 | Tris (1 X GL36), MgCl2 (8 X GL36), NaCl (2 X GL36), IGEPAL (1 X GL36), SDS (5 X GL36) | Cdc42 | Les composants identiques à GL36, composition varie comme suit : |
| GL36 | une formule exclusive de Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL et SDS | RalA | Tampon standard, compatible avec plus GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | une formule exclusive de Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL et SDS | RAC1 | Tampon standard, compatible avec plus GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | une formule exclusive de Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL et SDS | RAC1, 2, 3 | Tampon standard, compatible avec plus GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | une formule exclusive de Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL et SDS | RAS | Tampon standard, compatible avec plus GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | une formule exclusive de Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL et SDS | RhoA | Tampon standard, compatible avec plus GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | une formule exclusive de Tris pH 7.5, MgCl2 | ARF1 | Tampon standard, compatible avec plus GTPase-linked immunosorbent assays. |
Tableau 2 : Immuno-liste de GTPase mémoires tampons de lysis de dosage et composition de lyse pour petites GTPases recommandée.
| Paramètres | Notes | ||
| GAIN | Option de GAIN ajuste la sensibilité de la machine. Plupart des luminomètres utilisent étalonnage automatique ou une fonction d’étalonnage limité. Veuillez lire le GAIN à faible, moyen et haut afin de voir si la lecture se trouve dans la gamme linéaire qui varie dans les différents instruments. | ||
| TEMPS D’INTÉGRATION | Il est recommandé d’avoir cette option à son plus bas niveau comme le très-haut times pourrait lire en dehors de la plage linéaire. Cela peut nécessiter un travail inutile comme en utilisant une dilution plus faible ou des anticorps primaires et secondaires. TEMPS d’intégration varie également dans différents instruments. | ||
| SECOUANT | Il est recommandé d’utiliser les 5 s SHAKING orbitale. Il n’est pas aussi critique que les autres paramètres pour l’exactitude de l’analyse. | ||
| TEMPÉRATURE | La température ambiante est recommandée | ||
| TYPE DE PLAQUE | Utiliser selon la plaque que vous utilisez. La plaque est habituellement 96 puits, plates et blanches. | ||
| FILTRES | Filtres d’excitation et d’émission ne sont pas requis pour la Luminescence. Excitation peut être définie à une valeur désirée et optimal pour l’émission se situe entre 430-445 nm. Ne renseignez pas les espaces du filtre. Si ce n’est pas une option, | ||
Tableau 3 : Une description détaillée des paramètres luminomètre.
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Discussion
Nous décrivons ici une méthode précise pour mesurer la petite GTPase prénylation et liant GTP affichée sous la petite GTPase localisation subcellulaire (membrane versus cytosol) et Rho GTP chargement. Petites GTPases sont exprimés dans les cellules eucaryotes et jouent un rôle essentiel dans la prolifération cellulaire, la motilité et la structure. Tant prénylation et liant GTP sont impliqués dans la régulation de l’activité GTPase ; par conséquent, des épreuves pour évaluer la prénylation et la liaison de GTP de ces protéines sont des outils importants pour cellule biologistes1,8.
Basé sur les résultats d’une étude récente, Rho protéines GTP chargement est de type cellulaire spécifique8et donc, se distingue parmi les différents types de cellules. En outre, la localisation subcellulaire et geranylgeranylation (GGT) des protéines Rho sont les étapes déterminants dans la régulation de leur fonction. Cette question est aussi encore régie par l’interaction des protéines effectrices FEM, GAP et GDI pour les GTPases majeur.
Simvastatin est connu pour augmenter le chargement Rac GTP dans les monocytes THP-1, diminuer la prénylation des CCR en présence de stimulation β-amyloïde et diminuer les réponses inflammatoires de ces cellules17. Nous savons également que la fonction des cellules T n’est pas affectée par le GTP Rho chargement mais, plutôt, la GGT de Rho détermine fonction18,19. Par conséquent, nous recommandons que, afin de détecter l’activité GTPase Rho, tant prénylation et chargement de GTP doivent être simultanément mesurés dans les cellules.
Noter, pour atteindre la haute pureté cytosolique et fractions membranaires, les étapes les plus importantes du protocole sont la sonication et l’ultracentrifugation. Pour le dosage en liant le GTP de Rho, l’étape la plus critique est snap-gel les lysats cellulaires avant traitement séquentiel. Suite à ces étapes importantes produira des résultats cohérents et reproductibles dans l’étude des GTPases dans les systèmes vivants.
Une étape clé pour examiner une protéine intracellulaire particulière de la structure ou de la membrane est la séparation des compartiments cellulaires entre eux. Fractionnement tire parti des propriétés de chaque compartiment cellulaire, comme la taille et forme, densité de charge superficielle et densité20. Il est principalement basé sur la centrifugation différentielle dans les médias de grande viscosité à 4 ° C. La méthode de fractionnement membrane qui a été utilisée ici est principalement basée sur la taille de chaque compartiment et à haute vitesse gravitationnel où, après ultracentrifugation, protéines membranaires allez jusqu’en bas du tube et les protéines cytosoliques restent dans le surnageant.
Il est important de noter que les échantillons contenant des concentrations de protéines et, éventuellement, des niveaux élevés de lacunes peuvent inactiver potentiellement la cible GTPase. Ce problème peut se produire même dans le tampon de lyse et peut conduire à des résultats faussement négatifs. L’un des paramètres clés qui déterminent le succès et la reproductibilité des résultats de test de l’activité GTPase sont la santé et la réactivité des cellules utilisées dans l' expérience8. Il est fortement recommandé que les chercheurs identifient les conditions de croissance optimales/appropriées et le temps de doublement pour les cellules à l’étude pour déterminer l’activation/inhibition de la GTPase. En outre, l’activité GTPase de toutes petites GTPases est étroitement contrôlée et, par conséquent, susceptibles d’être rapide diminue par hydrolyse de la molécule de GTP lié à l’enzyme par l’action des lacunes (pendant et après la procédure de la lyse cellulaire ). Cette action entraîne l’inactivation rapide de la GTPase d’intérêt. Par conséquent, il est fortement recommandé que la lyse des cellules s’effectue rapidement à 4 ° C, pour obtenir des résultats exacts et reproductibles.
Il y a plusieurs facteurs selon les conditions expérimentales qui déterminent la dernière cellule lysate. Tout d’abord, le montant total de RhoA GTPase dans la lignée cellulaire ou tissulaire spécifique : le montant de la GTPase de RhoA endogène est variable dans les différents types de cellules et de tissus ; par conséquent, cela peut entraîner une réaction plus vigoureuse à un activateur ou un désactiveur. Deuxièmement, le montant de l’activation/désactivation obtenu dans des conditions expérimentales : il est important de considérer qu’environ 2 % à 10 % de la GTPase petit cellulaire totale est peut-être activé en réponse à un stimulus spécifique8. Le montant de désactivation dépend uniquement du type de stimuli et elle est variable dans les différentes cellules et tissus. Par conséquent, pour chaque type d’analyse d’activité petit Rho GTPase, la composition du compartiment tampon et cellulaire lyse est cruciale. Le tableau 3 montre la composition recommandée de la mémoire tampon de lyse pour chaque protéine spécifique de la GTPase petit.
La concentration de protéine lysat cellulaire normalisée est une exigence importante car elle permet aux chercheurs de comparer l’activité GTPase de différents échantillons. Laver les cellules de tous les échantillons dans toutes les conditions avec du PBS froid est donc obligatoire pour retirer les milieux de culture de tissu de protéine. Il est également essentiel que tous les réactifs et les tampons sont utilisés à des températures froides (4 ° C) dans toutes les étapes de l’expérience. Cette température froide minimisera l’hydrolyse des GTPases, y compris les Rho GTPase, au cours de la préparation de l’échantillon. Il est essentiel que ce traitement des lysats cellulaires est effectué rapidement (en 10-15 min au total) afin d’éviter la perte d’activité de RhoA GTPase. Par ailleurs, l’étape la plus importante de la préparation de lysat cellulaire est snap-gel aliquotes du lysat dans l’azote liquide pour maintenir l’activité enzymatique de la petite GTPase de RhoA. Ceci est particulièrement important s’il y a différents points ou plusieurs échantillons dans l’expérience. Après la préparation des lysats congelés clin d’oeil, les échantillons peuvent être maintenus à-80 ° C sans perdre leur activité GTPase Rho.
Le protocole fourni pour l’analyse de l’ancrage membranaire de RhoA GTPase représente seulement un outil indirect pour mesurer la prénylation des petites GTPases et n’est pas en mesure de détecter directement ou de quantifier la liaison des résidus isoprénoïde à la protéine cible. C’est l’un des rares limites de cet essai. Par conséquent, il donne une estimation de la prénylation des protéines. Certaines approches ont été définies et qui sont capables de mesurer directement FT (farnesylation) et/ou GGT par farnésyl transférase et/ou géranyl transférase, respectivement, dans les cellules cultivées, tant chez les animaux et les tumeurs d’origine humaine. Les dosages utilisent Maj mobilité électrophorétique, diphosphate de farnésyle [3H] et [3H] géranyl diphosphate et l’acide mévalonique [3H] étiquetage, suivi par immunoprécipitation et SDS-PAGE21.
Nous avons utilisé la RhoA GTPase immuno-pour détecter tout ancrage membranaire et l’activité de RhoA GTPase. Il se compose d’une protéine liant le GTP-Rho, qui est liée aux puits d’une plaque à 96 puits. Ainsi, le Rho actif GTP lié dans les lysats cellulaires ou tissulaires se lie dans les puits, tandis que le PIB lié aux inactif Rho est éliminé au cours des étapes de lavage. Puis, l’assujettis, active RhoA dans les puits est détecté à l’aide d’un anticorps spécifique RhoA et chimiluminescence. Il est possible de déterminer le degré d’activation de RhoA en comparant les lectures de lysats de cellules activées à non activée. Privation de sérum (l’utilisation d’un milieu sans sérum sur des cellules cultivées) est habituellement utilisée pour inactiver RhoA en culture de tissus. Il convient également de mentionner que gamme de la GTPase immuno-d’activation nécessite 10 à 50 µg de protéines pour la détection de l’activité de RhoA GTPase.
Il est fortement recommandé que les échantillons non traités ont faibles niveaux cellulaires basales d’activité GTPase (état de contrôle). À titre d’exemple, famine cellulaire bonne conditions activité de GTPase régulent can et offrent des conditions idéales pour montrer leur mise en route dans des conditions expérimentales. En outre, l’activation et inhibition analyses dans une manière de temps - et dose-réponse pour obtenir les meilleures réponses activation/inhibition de GTPase. Plus important encore, au cours de la préparation cellulaire, il est très important d’utiliser des cellules qui ne sont pas overconfluent (> 70 %), afin d’éviter toute non-réactivité des cellules à des stimuli activation/inhibition.
Luminomètres diffèrent considérablement en termes de sensibilité et de lectures absolues. Par conséquent, afin de déterminer s’il est dans la gamme linéaire, nous suggérons une GTPase immuno-en cours d’exécution avec un blanc et un témoin positif. Si le dosage est hors de la gamme linéaire (contrôle positif devrait être 4 x - 10 x plus élevé que la lecture de la mémoire tampon uniquement) ou la lecture blanche est supérieure à 9 millions, alors il est recommandé d’utiliser davantage les dilutions anticorps. De plus, nous vous recommandons fortement de calibrer le luminomètre à lire dans la gamme linéaire du test avant de commencer le test.
Il y a aussi des avantages de la GTPase immuno-qui sont à noter. Les dosages immuno-GTPase améliorer l’actuel protocole expérimental et activer la technologie afin de faciliter des expériences qui n’étaient pas possibles avec le vieux pull-down techniques22. Les dosages immuno-GTPase fournissent également précision de détection et de la sensibilité qui permet des analyses d’activité GTPase dans les préparations précédemment interdites aux dosages déroulant23. Quelques études récentes par rapport à des essais d’activation immuno-GTPase avec pull-down et a conclu qu’ELISA GTPase a certains avantages évidents, à savoir que les dosages immuno-GTPase sont supérieures due à leur possibilité d’utiliser de petites quantités de protéine22,24, leur grande sensibilité24et leurs mesures quantitatives23. Le kit de dosage immuno-GTPase est disponible en version luminométrique ou détection colorimétrique, où les tests de luminométrique sont plus sensibles. Cette GTPase immuno-est basé sur un protocole plutôt simple et rapide, nécessite seulement de petites quantités d’échantillon et donne des résultats quantitatifs et précis. Par conséquent, il peut être une bonne idée de développer davantage ce dosage pour détecter d’autres types de protéines GTPase-basé dans différentes lignées cellulaires et les cellules de culture de tissus avec une spécificité beaucoup plus élevée et la précision.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Saeid Ghavami a été financée par une subvention de fonctionnement de Centre de sciences de santé, CHRIM et recherche Manitoba Nouveau chercheur d’exploitation subvention de fonctionnement. Javad Alizadeh était accompagnée d’une bourse de recherche du Manitoba. Shahla Shojaei était soutenu par une subvention de fonctionnement de santé Science Foundation et la bourse postdoctorale MITACS accélération. Adel Rezaei Moghadam a appuyé un CRSNG Subv qui s’est tenue par Joseph W. Gordon. Amir A. Zeki a été appuyée par le NIH/NHLBI K08 award (1K08HL114882-01 a 1). Marek J. Los gentiment reconnaît l’appui de NCN accorder #2016/21/B/NZ1/02812, soutenu par LE STUDIUM Institute for Advanced Studies (région Centre-Val de Loire, France) par le biais de son programme général de Smart Loire Valley et cofinancé par la Marie Actions de Sklodowska-Curie, accorder #665790. Simone da Silva Rosa était accompagnée d’une bourse d’étude UMGF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
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