Summary
このプロトコルでは、前庭系を研究するための有用な方法であるラットの手術なるほどについて説明します。
Abstract
前庭系や前庭代償プロセスを研究するため、メソッド数は外科か化学なるほどと前庭神経切断などを含む前庭神経の損傷を引き起こすことしました。手術なるほどは、比較的単純な信頼性、および迅速な方法です。ここでは、ラットなるほどのために手術手技について述べる。耳介後部切開が外耳道と鼓膜、鼓膜と小骨があぶみ骨なし削除される公開全身麻酔下で行われます。あぶみ骨と楕円形の窓との間に位置しているアブミ骨動脈は脆弱な構造を明確な外科的フィールドを取得する保持必要があります。かぎり行うホール前庭で行われます 2.1 mm のドリル バールあぶみ骨に優れた。100% エタノールはこの穴から注入し、数回を吸気します。綿密な解剖顕微鏡および注意深い出血制御の下で、信頼性の高い結果を得るために不可欠です。手術直後後は、前庭系障害、眼振、頭の角度、回転運動などの症状が見られます。Rotarod または回転椅子テストは、客観的・定量的評価前庭機能を使用できます。
Introduction
前庭器官は、バランスと目のコントロールは欠かせません。通常の前庭機能は、2 つの内側の耳の前庭器官から対称の求心性信号によって異なります。前庭機能低下または損失は、めまい、眼振、姿勢の不均衡を誘導します。急性損傷後前庭機能が自発的に回復数日前庭代償1,2として知られているプロセス。静的な赤字の前庭代償は、安静時自発同側および対側の前庭神経核間の不均衡に関連する回復のプロセスです。動的赤字の前庭代償を達成した主を介して感覚と行動置換 (視覚や体性感覚の入力を使用して)3。これらのプロセスが神経可塑性研究4、5の魅力的です。
前庭系と前庭代償、外科および化学なるほどなど前庭神経切断5,6 中神経可塑性を支えるメカニズムを検討するいくつかの方法が開発されています。 ,7,8。前庭神経切断完了の前庭系障害を誘発する特定の方法が難しく、侵襲的なプロシージャで、脳損傷8,9を引き起こす可能性があります。このメソッドは、高度な外科的スキルが必要です、なるほどより時間かかります。ゲンタマイシン、arsanilate、テトラカインなど化学なるほどが簡単で信頼性の高い結果10、11,12をもたらすことができます。しかし、蝸牛が壊れているも可能性が、前庭系障害時間11に発展するかもしれない。さらに、化学物質の正確な評価のために維持されるべき、脳に及ぼす影響は明確ではありません。手術なるほど 184215の動物研究で初めて導入されました、1936年16でラットに初めて報告されました。この手法が多く使われており動物研究5,17,18,19。手術なるほど、特定の信頼性の高い、比較的単純な方法であります。13,14また、前庭障害の症状は、手術後すぐに見られています。ここでは、ラットなるほどに対する私たちの手技について述べる。
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Protocol
本研究は, 機関動物ケアおよび使用委員会のソウル国立大学病院 (14-0148-C1A1) 評価・実験動物ケアの認定会の認定を受けているに従って国際。
注: 7-8 週古い (200/250 g) の Sprague-dawley (SD) ラットに実験を行った。各動物は、実験開始前 1 週間の実験室の条件に順応だった。定数 12 に温度と湿度管理された部屋で収容された動物-h:12-h: 明暗サイクル無料アクセスと食料と水。
1。 なるほど
- オートクレーブの手術器具滅菌パッドをカバーします。70% のエタノールと営業領域を消毒します。滅菌ドレープを使用し、手術中に滅菌状態を維持します。
- ガウンを着用、マスク (カバー鼻と口)、キャップ (頭をカバー) と滅菌手袋のペア。手術器具は、滅菌の表面と接触して来る必要がありますのみ。
- チレタミン チレタミン麻酔薬 (40 mg/kg 体重) を注入または腹腔、大腿内側に筋肉とキシラジン (10 mg/kg 体重) 筋肉内あるいは腹腔。
注: 含むイソフルレン吸入麻酔の他のモードを使用もできます。 - (当初は 42 ° C で設定) 地球温暖化パッドにラットを配置します。麻酔下で目の乾燥を防ぐためにラットの両目に潤滑剤の眼軟膏を適用されます。
- ラットを右側を下に配置します。外科領域で毛皮をバリカンで剃る。70% のエタノールを使用してサイトを消毒します。
- 左着けたエリアに 1% リドカイン塩酸塩を皮下注入します。
- #15 のメス刃を使えば、~5.0 cm 着けた切開。独立した筋肉と筋膜虹彩ハサミ (図 1 a) 外耳道を公開します。#15 ブレードまたはアイリスはさみ (図 1 b) を使用して、外耳道を少し開きます。鼓膜 (図 2 a) を広く公開します。
- 顕微鏡 (7.5 X 12.5 X)、鼓膜と耳小骨鉗子を用いたアブミ骨を除いてを削除します。#15 ブレードやアイリス ハサミ (図 2 b) で lambdoidal の尾根筋をデタッチします。
- 低速でドリルを使用して (< 3000 rpm) ダイヤモンドバー (2.1 または 1.4 mm)、(図 3 a) 顔面神経の出口のポイントのまわりの鼓室胞骨をドリルします。アブミ骨動脈を特定します。掘削のプロセス中にアブミ骨動脈を損傷しないように注意してください。
- アブミ骨動脈に優れた玄関を掘削を続行し、丸い窓と骨の外側半規管を公開します。外側半規管の膨大部付近を開きます。外側半規管の面にドリルを続行し、優れた半規管の膨大部をドリルします。
- 18 G、22 G の針を使用して玄関の内容を吸引します。注入し、100% エタノール 3 の 1 cm3を吸い出しなさい x。
- 筋肉と単純な縫合の二層で皮膚を閉じます。
- 放置しないでください動物までそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。それは、加熱パッドまたは熱ランプを使用してキッスまでラットを暖かく保ちます。後に目覚め、ラットを客室に通常の環境条件で個々 のケージに移動します。
- 抗生物質の投与 (例えば、セファドロキシル 20 mg/kg、トリメトプリム-スルホンアミド 100 μ L 皮下、またはペニシリン 300,000 IU); 1 日必要に応じて鎮痛薬 (オピオイドではない;例えば、Metacam カルプロフェン 2 mg/kg 5 mg/kg 皮下) 指定もできます。
2. 偽手術
- コントロールとして偽手術、(セクション 1) に従って同じ手術と手術後の手順を実行、外耳道と鼓膜 (ステップ 1.7)、鼓膜と耳小骨、除去の露出など、lambdoidal で筋肉の剥離リッジ (ステップ 1.8) が半規管を開くかエタノールを注入します。
前庭機能の損失を確認します。
注: 前庭機能の喪失は、どちらかの行動または前庭機能検査を使用して評価できます。13,17,18 には行動テストには、眼振と姿勢の非対称性の評価が含まれます。
- 自発性または誘発バレル圧延、左側面に落ちたり18破壊側に傾いている間移動を含む姿勢の非対称性を識別します。ビデオ 1を参照してください。
- 随意眼球運動の検査、眼振を識別します。自発眼振はいないとき休息状態の動物18頭優しく空気のパフします。ビデオ 2を参照してください。
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Representative Results
手術の成功は、行動テストによって検証されました。すべての動物は、片側性前庭機能低下の典型的な動作を示した。自発的なバレル ローリングは、早期復旧フェーズ (ビデオ 1) で頭や体を軽いタッチで空気のパフで誘発されて、手術後すぐに明白でした。手術後 3 d は、時折破壊側に傾いて移動動物は左側に落ちる。自発眼振は、2 d (動画 2) 内で観察されました。誘発眼振は、3 d で得られました。
通常必要な手術 < 30 分。50 手術の過程で、2 匹のラットは操作し手術の 1 d 内 3 の中に死亡しました。全体的にみて、損失率 10% (5 中/50 手術後死亡) であった。すべての死は、アブミ骨動脈への損傷によって引き起こされました。1 週間以内感染遅延死を指摘しませんでした。手術後数日間は、ラットは、貧しい経口摂取と体重減少を表わすことができます。
図 1: 左耳の後耳介切開します。(A) A 耳介後部切開が行われたと顔面神経 (↑) は側頭筋 (*) と胸骨甲状筋 (†) の識別されました。(B) その後、外耳道 (↑) が少し開かれ、外耳の軟骨が錐体骨から分離されました。2 mm のスケール バーは、すべてのパネルに適用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 前庭の骨壁の露出します。(A) 外耳道全体を開いたら、槌骨 (*) 鼓膜の下に見られました。(B) 蝸牛岬 (*) の識別、鼓膜と耳小骨 (あぶみ骨) を除いてを除去した後、lambdoidal の尾根筋 (†) を高架します。2 mm のスケール バーは、すべてのパネルに適用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 前庭開窓します。(A) tympanic キャビティ、顔面神経の出口のポイントの周囲の骨の後部の外側壁の除去が掘削された後。アブミ骨動脈 (↑) と蝸牛岬 (*) 上の丸い窓 (Δ) が公開されました。(B) 蝸牛岬 (*) の下の場所だった、前庭の残骸 (↑) で明らかになった外側前庭、半規管の膨大部を掘削した後。2 mm のスケール バーは、すべてのパネルに適用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ビデオ 1。ローリング自発バレル。なるほど 2 d を受けた SD ラットは以前、自発的なバレルのローリングを見せました。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 2。自発眼振。なるほど 2 d を受けた SD ラットは以前、自発眼振を見せました。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
この手法は、突然、恒久的なかつ完全な前庭機能の損失を作成する便利な方法です。これは、前庭神経炎、聴神経腫瘍やメニエール病などの前庭疾患を勉強される可能性があります。多くの研究は、前庭神経核の神経細胞の可塑性や関連する中央プロセス5,17,18,19を研究するのにこの手法を使用しています。
The most 手術の成功のための重要なステップが 1) で正確な位置、および 3) きめ細かな出血コントロール 2) 注意して掘削、アブミ骨動脈の保全。大きな耳介後部切開は、大規模な外部の傷、治療側の脚の動きを邪魔する可能性があります。ただし、小切開手術野を制限し、時間がかかる操作が発生します。適切な撤回は十分な外科的表示13を維持するために不可欠です。耳介後部切開後は、ブラの上と、顎二腹筋と胸鎖乳突筋、前方下方に顔を実行している間、顔面神経を識別できます。着けた動脈と大耳介神経を反対方向に実行します。顔面神経への損傷は、術後後顔面神経麻痺を引き起こします。広い視野を実現し、アブミ骨動脈損傷を避けるため、我々 は優れた外耳道の壁を削除してアブミ骨動脈17,19に優れたアプローチを好みます。このアプローチは、外耳道の壁の開口部または (外部に中耳を公開する鼓膜の除去を備えていない腹のアプローチと比較して感染のリスクが高いに関連付けられて環境)。我々 の経験で長期的な後遺症 (一般的な動物のパフォーマンス、その給餌や飲酒の習慣、体重増加の再開と感染状態) は、ここで説明する transtympanic アプローチを受ける動物の間に特に違いはありませんし、腹アプローチ17,20。ブラを開くと、接続されている筋肉と時々 いくつかの出血の結果が損傷することが。ラット、アブミ骨動脈交差前庭窓のサイトの近くにあります。ヒトでは、ただし、アブミ骨動脈は胚発生時に消えます。手術野が狭い場合, 出血をコントロールするは簡単じゃないとフィールドは急速に血で埋めることができます。これを避けるためには、何人かの著者は、穴を作る前にアブミ骨動脈を凝固します。何人かの著者それは内耳、中枢神経系 (膝状神経節、内側帯と台形体)、およびラット14 で顔面神経を供給可能性がありますので、アブミ骨動脈14を凝固させることを好むその役割は明確ではなく、、21。出血が発生した場合、我々 は小さな綿棒で動脈を圧縮し、十分な吸引力で電気凝固を使用します。
小型バリ前庭に穴を作るため役に立ちます。小さなフックや針は、バリの代わりにされる可能性があります。機械掘削システムはより少ない開窓術トラウマの結果し、一貫性のある結果を得ることができます。エタノール灌漑せずなるほど13,17後変数の行動反応を観察しました。エタノールの洗浄、吸引、迷宮が末期に破損していることを確認します。13は、前庭神経の電気凝固を鈍らせるこの穴22を介して実行することができます。適切な倍率は不可欠と顕微鏡は、ほとんどの場合必須です。
なるほど、難聴の中には、中耳と内耳も破損しています。内耳を安全に維持する方法はありません。化学なるほど動物のヒアリングを保持することができますが、変数の結果8が得られます。前庭神経切断8蝸牛神経への損傷もあります。コントロール グループで模擬操作を実行するには、は、鼓膜と耳小骨、前庭障害13なし軽度の導電性難聴につながったあぶみ骨なしを削除しました。
いくつかの行動と前庭機能検査は、なるほどがされていることを確認する使用ことができます13,14を正常に実行します。手順の後すぐに目のスキュー偏差を観察できます。麻酔から回復後自発眼振、ローリング運動と頭の角度を見ることができます。ぶら下がっている尻尾回転は、最も信頼性の高いテスト17,20です。これらの赤字は、複数日17,20内でゆっくりと回復します。側に急速な動きと自発眼振は、手順の後 3-4 d 内で表示されなくなります。頭の角度と、数ヶ月残ります。回転椅子テストなどの前庭機能検査または rotarod テストより客観的、定量的データ23,24を提供できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は韓国健康技術 R & D プロジェクトを通じて、韓国保健産業開発研究所 (KHIDI)、韓国の福祉・厚生省によって資金を供給からの助成金によって支えられた (許可番号: HI15C2651)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ASPIRATOR KB-012 | KOH BONG & CO., LTD. | KB-012 | Medical aspirator |
| Blade: #15 | Fine Science Tools | #10015-00 | Blades for #7 Scalpel Handles, #15 |
| Carbon Steel Burrs | Fine Science Tools | #19007-05 | shaft diameter: 2.3 mm, length: 44 mm, package of 10 burrs |
| Carl Zeiss Surgical GmbH | Carl Zeiss | #6627100863 | Surgical microscope |
| Dumont #3c | Fine Science Tools | #11231-20 | Standard tip 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | #11252-00 | |
| Dumont #7B | Fine Science Tools | #11270-20 | Serrated 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Extra Fine Bonn: straight | Fine Science Tools | #14084-08 | Iris scissors, best suited for microdissection under high magnification |
| Fine Iris Scissors: straight | Fine Science Tools | #14094-11 | Made from martensitic stainless steel, combined with molybdenum and vanadium |
| Finger Loop Ear Punch | Fine Science Tools | #24212-01 | 1 mm. Provides stability and control for researchers using the numbering system |
| Hartman | Fine Science Tools | #13002-10 | Tip width: 1 cm, serrated, 10 cm |
| Short Scalpel Handle #7 Solid | Fine Science Tools | #10003-12 | #7 short, 12 cm |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | #18000-03 | Replacement tip, straight knife, keeps bleeding to a minimum and therefore provides a surgical field clear of clamps and hemostats |
| Strong 207S | SAESHIN | 207S | Powerful torque at low speed, available with speed or on/off foot controller |
| Suction Tubes | JEUNGDO B&P CO., LTD. | H-1927-8 | Frazier, 18 cm |
| VICRYL | ETHICON | W9570T | Synthetic absorbable sterile surgical suture |
| Weitlaner-Locktite | Fine Science Tools | #17012-13 | Maximum spread: 4.5 cm, 2 x 3 blunt teeth, 11 cm |
| Zoletil | Virbac, France | Tiletamine-zolazepam | |
| Rompun | Bayer | Xylazine | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Septra | Pfizer | Trimethoprim-sulfonamide |
References
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