Summary
Este protocolo descreve o vestibulotóxicos cirúrgico de um rato, que é um método útil para o estudo do sistema vestibular.
Abstract
Para estudar o sistema vestibular ou o processo de compensação vestibular, vários métodos foram desenvolvidos para causar dano vestibular, incluindo vestibulotóxicos cirúrgicos ou químicos e neurectomia vestibular. Vestibulotóxicos cirúrgico é um método relativamente simples, confiável e rápido. Aqui, descrevemos a técnica cirúrgica para rato vestibulotóxicos. Uma incisão postauricular é feita sob anestesia geral para expor o canal auditivo externo e a membrana timpânica, após o qual a membrana timpânica e ossículos são removidos sem estribo. A artéria do estribo, que está localizada entre o estribo e a janela oval, é uma estrutura vulnerável e deve ser preservada para obter um campo cirúrgico limpo. Um buraco para fenestrado o vestíbulo feito com uma broca de 2,1 mm de broca superior com o estribo. Então, 100% de etanol é injetado através deste buraco e aspirada várias vezes. Minuciosa dissecação sob um microscópio e cuidadoso controle de sangramento são essenciais para obter resultados fiáveis. Sintomas de perda vestibular, como nistagmo, inclinação de cabeça e um movimento de rolamento, são vistos imediatamente após a cirurgia. O teste de cadeira rotarod ou rotação pode ser usado para objetivamente e quantitativamente avaliar a função vestibular.
Introduction
O órgão vestibular é essencial para o controle de equilíbrio e olho. Uma função vestibular normal depende de sinais aferentes simétricos de órgãos vestibulares nos dois ouvidos interno. Hipofunção vestibular ou perda induz tonturas, nistagmo e desequilíbrio postural. Depois de danos agudos, a função vestibular recupera espontaneamente dentro de alguns dias, um processo conhecido como compensação vestibular1,2. A compensação vestibular dos défices estáticos é um processo de recuperação relacionado com o desequilíbrio da atividade espontânea de descanso entre os núcleos vestibulares ipsilaterais e contralaterais. A compensação vestibular dos défices dinâmicos é conseguida principalmente através de substituições sensoriais e comportamentais (usando entradas visuais ou somatossensorial)3. Estes processos são atraentes para a plasticidade neuronal estudos4,5.
Vários métodos foram desenvolvidos para estudar o sistema vestibular e os mecanismos subjacentes a plasticidade neuronal durante a compensação vestibular, tais como químicos e cirúrgicos vestibulotóxicos e neurectomia vestibular5,6 ,7,8. Neurectomia vestibular é uma certa maneira de induzir a perda completa do vestibular, mas é um procedimento mais difícil e invasivo e pode induzir dano cerebral8,9. Este método requer maior habilidade cirúrgica e leva mais tempo do que vestibulotóxicos. Vestibulotóxicos químico incluindo gentamicina, arsenilato e Tetracaína, é mais fácil e podem produzir resultados fiáveis10,11,12. No entanto, a cóclea, também pode ser danificada e perda vestibular pode desenvolver ao longo do tempo11. Além disso, os efeitos das substâncias químicas no cérebro, que deve ser preservado para avaliação exata, não são claras. Vestibulotóxicos cirúrgico foi introduzido pela primeira vez em estudos com animais em 184215 e foi primeiramente relatado em ratos em 193616. Esta técnica tem sido usada, desde que, em muitos animais estuda5,17,18,19. Vestibulotóxicos cirúrgico é um método confiável e relativamente simples de específicos. 13 , 14 além disso, os sintomas de dano vestibular são vistos imediatamente após a cirurgia. Aqui, descrevemos nossa técnica cirúrgica para rato vestibulotóxicos.
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Protocol
Este estudo foi realizado em conformidade com o cuidado de Animal institucional e uso Comitê de Seul nacional Hospital Universitário (14-0148-C1A1), que é credenciado pela Associação para a avaliação e acreditação do cuidado de Animal de laboratório Internacional.
Nota: Os experimentos foram realizados em ratos machos Sprague-Dawley (SD) de 7-8 semanas de idade (200/250 g). Cada animal foi aclimatado para as condições de laboratório por 1 semana antes do início do experimento. Os animais foram alojados em uma sala de controle de temperatura e umidade com uma constante 12-h:12-h luz: escuro ciclo com livre acesso à comida e água.
1. vestibulotóxicos
- Cobrir os instrumentais cirúrgicos esterilizados em autoclave com uma almofada de estéril. Desinfete a área de atuação com 70% de etanol. Use um pano estéril e manter condições estéreis durante a cirurgia.
- Vestir a toga, máscara (para cobrir nariz e boca), PAC (para cobrir a cabeça) e um par de luvas estéreis. Os instrumentos cirúrgicos só devem entrar em contato com superfícies estéreis.
- Injetar o anestésico tiletamina-eficiente (40 mg/kg de peso corporal) por via intramuscular na coxa medial ou intraperitonealmente e xilazina (10mg/kg de peso corporal) por via intramuscular ou intraperitonealmente.
Nota: Outros modos de anestesia geral, incluindo a inalação de isoflurano, também podem ser usados. - Coloque o rato sobre uma almofada de aquecimento (inicialmente definida a 42 ° C). Aplica a pomada lubrificante para ambos os olhos do rato para evitar ressecamento do olho enquanto sob anestesia.
- Coloque o rato do seu lado direito. Raspe a pele na área cirúrgica com máquina de cortar cabelo. Desinfecte o local com etanol a 70%.
- Injete cloridrato de lidocaína a 1% por via subcutânea em região retroauricular esquerda.
- Usando uma lâmina de bisturi 15 #, faça uma incisão de retroauricular ~5.0 cm. Separe o músculo e a fáscia para expor o canal auditivo externo com tesoura Iris (figura 1A). Abra ligeiramente o canal auditivo externo usando a lâmina #15 ou a tesoura de Iris (figura 1B). Expor amplamente a membrana timpânica (Figura 2A).
- Sob um microscópio (7,5 X ou 12,5 X), remova a membrana timpânica e ossículos com excepção do estribo, usando a pinça. Desanexe os músculos no cume lambdoidal com a lâmina #15 ou a tesoura de Iris (Figura 2B).
- Usando uma broca em baixa velocidade (< 3000rpm) com uma broca de diamante (2.1 ou 1,4 mm), perfurar o osso timpânica em torno do ponto de saída do nervo facial (Figura 3A). Identifica a artéria estapédica. Tome cuidado para não danificar a artéria estapédica durante o processo de perfuração.
- Continuar a perfuração do vestíbulo superior à artéria estapédica e expor a janela redonda e o ósseo canal semicircular lateral. Abra o canal semicircular lateral sua ampola. Continuar a perfuração no plano do canal semicircular lateral e broca da ampola do canal semicircular superior.
- Aspire o conteúdo do vestíbulo usando uma agulha de 18 G ou 22-G. Injetar e Aspire 1 cm3 de etanol 100% 3 x.
- Feche os músculos e a pele em duas camadas com suturas interrompidas simples.
- Não abandone um animal até que ele recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Aquece o rato até que ele desperta usando uma almofada de aquecimento ou uma lâmpada de calor. Após o despertar, mova o rato para uma gaiola individual em uma sala com as condições ambientais normais.
- Administração de antibióticos (por exemplo, cefazolina 20 mg/kg, trimetoprim-sulfonamida 100 µ l por via subcutânea, ou penicilina 300.000 UI) conforme necessário no dia 1; um analgésico (não um opioide; por exemplo, Metacam, carprofeno a 2 mg/kg 5 mg/kg por via subcutânea) também pode ser dada.
2. sham cirurgia
- Para a cirurgia de Souza como um controle, executar os mesmos procedimentos cirúrgicos e pós-cirúrgicos (acordo com o ponto 1), incluindo a exposição do canal auditivo externo e a membrana timpânica (etapa 1.7), a remoção da membrana timpânica e ossículos e o desprendimento dos músculos sobre o lambdoidal ridge (passo 1.8), mas não abra o canal semicircular ou injetar o etanol.
3. Verifique a perda da função Vestibular
Nota: A perda da função vestibular pode ser avaliada usando testes de qualquer função comportamental ou vestibular. 13 , 17 , 18 testes comportamentais incluem a avaliação da assimetria postural e nistagmo.
- Identifica a assimetria postural que inclui espontânea ou evocado barril-rolamento, caindo para o lado esquerdo, ou se movendo enquanto inclinando-se para o lado lesado18. Veja o vídeo 1.
- Identifica o nistagmo por uma inspeção visual do movimento ocular voluntária. Quando o nistagmo espontâneo está ausente no estado de repouso, soprar ar suavemente sobre a cabeça do animal18. Veja o vídeo 2.
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Representative Results
O sucesso da cirurgia foi validado por testes comportamentais. Todos os animais exibiram o comportamento típico de uma perda unilateral da função vestibular. Barril-rolamento espontâneo era evidente imediatamente após a cirurgia, sendo evocada por um sopro de ar sobre a cabeça ou um leve toque no corpo, na fase inicial de recuperação (vídeo 1). 3-d após a cirurgia, os animais movimentados mais inclinado para o lado lesado com ocasionais cai para o lado esquerdo. Nistagmo espontâneo foi observado dentro de 2 d (vídeo 2). Observou-se nistagmo evocado dentro de 3-d.
A cirurgia geralmente necessária < 30 min. Ao longo de 50 cirurgias, 2 ratos morreram durante a operação e 3 dentro d 1 da cirurgia. No geral, a taxa de perda foi 10% (5 mortes durante/após 50 cirurgias). Todas as mortes foram causadas por uma lesão da artéria estapédica. Observamos nenhuma morte atrasada e não há infecção dentro de 1 semana. Por vários dias após a cirurgia, os ratos podem exibir uma pobre oral ingestão e perda de peso.
Figura 1: incisão pós-auricular da orelha esquerda. (A) A postauricular incisão foi feita, e o nervo facial (↑) foi identificado entre o músculo temporalis (*) e o músculo esternomastoideo (†). (B) em seguida, canal auditivo externo (↑) foi aberto um pouco e a cartilagem do ouvido externo foi separada do osso piramidal. A barra de escala de 2 mm, aplica-se a todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: exposição da parede óssea do vestíbulo. (A) depois de abrir o canal auditivo externo amplo, o martelo (*) foi visto sob a membrana timpânica. (B) após a remoção da membrana timpânica e os ossículos (com excepção do estribo), identificou-se o promontório coclear (*) e os músculos no cume lambdoidal elevado (†). A barra de escala de 2 mm, aplica-se a todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: fenestração Vestibular. (A) após a remoção da parede lateral posterior da cavidade timpânica, o osso ao redor do ponto de saída do nervo facial foi perfurada. A artéria estapédica (↑) e a janela redonda (Δ) acima do promontório coclear (*) foram expostos. (B) depois de perfurar o vestíbulo lateral, na ampola dos canais semicirculares era aparente no vestibular remanescente (↑), assim como a localização inferior do promontório coclear (*). A barra de escala de 2 mm, aplica-se a todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo de 1. Espontânea barril rolando. O rato de SD que sofreu vestibulotóxicos d 2 mostrou anteriormente barril espontânea rolando. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo 2. Nistagmo espontâneo. O rato de SD que sofreu vestibulotóxicos d 2 anteriormente mostrou nistagmo espontâneo. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Esta técnica é um método útil para a criação de perda súbita, permanente e completa função vestibular. Isso poderia ser usado para estudar patologias vestibulares, como neurite vestibular, um tumor acústico e a doença de Meniere. Muitos estudos têm usado essa técnica para estudar a plasticidade neuronal dos núcleos vestibulares ou o processo central relacionado5,17,18,19.
The Most passos críticos para cirurgia bem sucedida são 1) a preservação da artéria estapédica, 2) uma perfuração cuidado na posição exata e 3) meticuloso controle de sangramento. Uma grande incisão postauricular pode causar um grande externo ferido, que perturba o movimento da perna no lado Tratado. No entanto, uma pequena incisão limita o campo cirúrgico e faz com que a operação demorará mais. Uma retração adequada é essencial para manter um suficiente cirúrgico vista13. Após a incisão de postauricular, o nervo facial pode ser identificado acima o bulla e entre o músculo digástrico e músculo esternocleidomastoideo, executando anterior inferiormente na face. A artéria retroauricular e nervo auricular maior, corra na direção oposta. Qualquer dano ao nervo facial provoca paralisia facial após o procedimento. Para obter uma visão mais ampla cirúrgica e evitar uma lesão da artéria estribo, preferimos remover a parede do canal de auditivo externo superior e em seguida abordagem superior ao estribo artéria17,19. Esta abordagem está associada um maior risco de infecção em comparação com a abordagem ventrolateral, que não é uma característica a abertura da parede do canal auditivo de externo ou a remoção da membrana timpânica (que expõe o ouvido médio para o exterior ambiente). Em nossa experiência, as sequelas a longo prazo (o desempenho geral do animal, seus hábitos de alimentação e bebidos, a retomada de ganho de peso e o status de infecção) não diferem notavelmente entre animais sujeitados à abordagem transtympanic descrita aqui e a abordagem ventrolateral17,20. Abrir o bulla pode danificar o músculo anexado e, por vezes, resultar em hemorragia. No rato, a artéria estribo cruza próximo ao local de fenestração vestibular. Em humanos, no entanto, a artéria estribo desaparece durante a embriogênese. Quando o campo cirúrgico é estreito, não é fácil controlar a hemorragia, e o campo rapidamente pode encher com sangue. Para evitar isso, alguns autores coagulam a artéria estribo antes de fazer o buraco. Embora seu papel não é claro, alguns autores preferem não coagular o estribo artéria14 porque pode fornecer o ouvido interno, sistema nervoso central (o gânglio geniculado, lemnisco medial e corpo trapezoide) e nervo facial no rato14 ,21. Se o sangramento ocorre, podemos comprimir a artéria com um pequeno cotonete e use coagulação elétrica com sucção suficiente.
Uma rebarba de pequeno porte é útil para fazer um buraco no vestíbulo. Um pequeno gancho ou agulha pode ser usada em vez de uma rebarba. Um sistema de perfuração mecânico resulta em menos trauma de fenestração e ajuda a obter resultados consistentes. Sem irrigação de etanol, observamos respostas comportamentais variáveis após o vestibulotóxicos13,17. Aspiração e irrigação de etanol certifique-se de que o labirinto terminal está danificado. 13 blunt coagulação elétrica do nervo vestibular pode ser realizada através deste buraco22. Ampliação adequada é essencial, e um microscópio é obrigatório na maioria dos casos.
O médio e o ouvido interno também são danificados durante o vestibulotóxicos, resultando em surdez. Não há nenhuma maneira de preservar o ouvido interno com segurança. Vestibulotóxicos químico podem preservar a audição do animal, mas produz resultados variáveis8. Neurectomia vestibular também pode causar danos ao nervo coclear8. Para executar a operação de Souza no grupo controle, nós removemos a membrana timpânica e ossículos sem estribo, que resultou em auditiva condutiva leve sem qualquer dano vestibular13.
Vários testes de função vestibular e comportamentais podem ser usados para confirmar que o vestibulotóxicos tem sido executada com sucesso13,14. Imediatamente após o procedimento, pode ser observado um desvio de inclinação do olho. Após a recuperação da anestesia, nistagmo espontâneo, um movimento de rolamento e inclinação de cabeça podem ser vistos. Rotação por cauda de suspensão é o mais confiável teste17,20. Estes défices recuperam lentamente dentro de vários dias17,20. Nistagmo espontâneo com movimento rápido para o lado contralateral desaparecerá dentro de 3-4 d após o procedimento. A cabeça inclinando permanecerá durante vários meses. Testes de função vestibular, como um teste de cadeira de rotação ou um teste de rotarod, pode fornecer mais objectivo e dados quantitativos23,24.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por uma concessão da Coreia saúde tecnologia R & D projeto através da Coreia saúde indústria desenvolvimento Institute (KHIDI), financiado pelo Ministério da saúde & bem-estar, República da Coreia (número de concessão: HI15C2651).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ASPIRATOR KB-012 | KOH BONG & CO., LTD. | KB-012 | Medical aspirator |
| Blade: #15 | Fine Science Tools | #10015-00 | Blades for #7 Scalpel Handles, #15 |
| Carbon Steel Burrs | Fine Science Tools | #19007-05 | shaft diameter: 2.3 mm, length: 44 mm, package of 10 burrs |
| Carl Zeiss Surgical GmbH | Carl Zeiss | #6627100863 | Surgical microscope |
| Dumont #3c | Fine Science Tools | #11231-20 | Standard tip 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | #11252-00 | |
| Dumont #7B | Fine Science Tools | #11270-20 | Serrated 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Extra Fine Bonn: straight | Fine Science Tools | #14084-08 | Iris scissors, best suited for microdissection under high magnification |
| Fine Iris Scissors: straight | Fine Science Tools | #14094-11 | Made from martensitic stainless steel, combined with molybdenum and vanadium |
| Finger Loop Ear Punch | Fine Science Tools | #24212-01 | 1 mm. Provides stability and control for researchers using the numbering system |
| Hartman | Fine Science Tools | #13002-10 | Tip width: 1 cm, serrated, 10 cm |
| Short Scalpel Handle #7 Solid | Fine Science Tools | #10003-12 | #7 short, 12 cm |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | #18000-03 | Replacement tip, straight knife, keeps bleeding to a minimum and therefore provides a surgical field clear of clamps and hemostats |
| Strong 207S | SAESHIN | 207S | Powerful torque at low speed, available with speed or on/off foot controller |
| Suction Tubes | JEUNGDO B&P CO., LTD. | H-1927-8 | Frazier, 18 cm |
| VICRYL | ETHICON | W9570T | Synthetic absorbable sterile surgical suture |
| Weitlaner-Locktite | Fine Science Tools | #17012-13 | Maximum spread: 4.5 cm, 2 x 3 blunt teeth, 11 cm |
| Zoletil | Virbac, France | Tiletamine-zolazepam | |
| Rompun | Bayer | Xylazine | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Septra | Pfizer | Trimethoprim-sulfonamide |
References
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