Summary
In questo articolo, presentiamo un protocollo in vitro e in situ per riparare uno spazio tendineo fino a 1,5 cm riempiendolo con innesto di collagene ingegnerizzato. Questo è stato eseguito sviluppando una tecnica di sutura modificata per prendere il carico meccanico fino a quando l'innesto matura nel tessuto ospite.
Abstract
La gestione chirurgica di grandi difetti tendinei con innesti tendinei è impegnativa, in quanto vi è un numero finito di siti in cui i donatori possono essere prontamente identificati e utilizzati. Attualmente, questa lacuna è colmata con innesti tendinei auto-, allo-, xeno-, o artificiali, ma i metodi clinici per proteggerli non sono necessariamente traducibili agli animali a causa della scala. Al fine di valutare nuovi biomateriali o studiare un innesto tendineo costituito da collagene di tipo 1, abbiamo sviluppato una tecnica di sutura modificata per aiutare a mantenere il tendine ingegnerizzato in allineamento con le estremità del tendine. Le proprietà meccaniche di questi innesti sono inferiori al tendine nativo. Per incorporare il tendine ingegnerizzato in modelli clinicamente rilevanti di riparazione caricata, è stata adottata una strategia per scaricare l'innesto tendineo ingegnerizzato e consentire la maturazione e l'integrazione del tendine ingegnerizzato in vivo fino a quando non si è formato un neo-tendine meccanicamente sano. Descriviamo questa tecnica utilizzando l'incorporazione del costrutto tendineo ingegnerizzato del tessuto di collagene di tipo 1.
Introduction
La rottura del tendine può verificarsi a causa di fattori estrinseci come lacerazioni traumatiche o carico eccessivo del tendine. A causa delle forze di trazione esterne poste su una riparazione del tendine, si forma inevitabilmente un divario con la maggior parte delle tecniche di riparazione dei tendini. Attualmente, i difetti /lacune tendinee sono riempiti con innesti auto-, allo-, xeno- o artificiali, ma la loro disponibilità è limitata e il sito donatore è una fonte di morbilità.
L'approccio di ingegneria tissutale per fabbricare l'innesto di tendine da un polimero naturale come il collagene ha il vantaggio distintivo di essere biocompatibile e può fornire componenti vitali della matrice extracellulare (ECM) che facilitano l'integrazione cellulare. Tuttavia, a causa della mancanza di allineamento fibrillare, le proprietà meccaniche del tendine ingegnerizzato (ET) sono inferiori al tendine nativo. Per aumentare le proprietà meccaniche del collagene più debole, sono stati utilizzati molti metodi, come la reticolazione fisica sotto vuoto, le radiazioni UV e i trattamenti deidrotermici1. Inoltre, attraverso il cross-linking chimico con riboflavina, metodi enzimatici e non enzimatici hanno aumentato la densità del collagene e il modulo di Young del collagene in vitro2,3. Tuttavia, aggiungendo agenti reticolanti, la biocompatibilità del collagene è compromessa, poiché gli studi hanno dimostrato un'alterazione del 33% delle proprietà meccaniche e una perdita del 40% della vitalità cellulare3,4,5. L'accumulo graduale di allineamento e resistenza meccanica può essere ottenuto attraverso il carico ciclico6; tuttavia, questo può essere acquisito in modo efficiente in vivo7.
Affinché ET si integri in vivo e acquisisca forza senza la necessità di alterazioni chimiche, un approccio sarebbe quello di utilizzare una tecnica di sutura stabilizzante per mantenere il costrutto più debole in posizione. La maggior parte delle riparazioni dei tendini si basa sul design della sutura per tenere insieme le estremità dei tendini; quindi la modifica di queste tecniche esistenti potrebbe fornire una soluzione logica8,9.
Fino al 1980, le riparazioni a 2 fili erano ampiamente utilizzate, ma la letteratura chirurgica recente descrive l'uso di 4 fili, 6 fili o anche 8 fili in riparazione10,11. Nel 1985, Savage descrisse tecniche di sutura a 6 filamenti con 6 punti di ancoraggio, ed era significativamente più forte della tecnica di sutura Bunnell che utilizza 4 fili 12. Inoltre, le riparazioni a 8 fili sono il 43% più forti di altri fili nei modelli a cadavere e in situ, ma queste riparazioni non sono ampiamente praticate in quanto diventa tecnicamente difficile riprodurre accuratamente le riparazioni13,14,15,16. Pertanto, un numero maggiore di fili di sutura del nucleo si riferisce a un aumento proporzionale delle proprietà biomeccaniche del tendine riparato. Tuttavia, c'è una perdita di vitalità cellulare intorno ai punti di sutura e il trauma da sutura eccessiva può essere a scapito del tendine, che può compromettere la guarigione del tendine17. Le tecniche di sutura dovrebbero fornire una forte riparazione geometrica equilibrata e relativamente anelastica per ridurre al minimo il gap del tendine dopo la riparazione. Inoltre, la posizione della sutura e dei suoi nodi devono essere posizionati strategicamente in modo che non interferiscano con lo scivolamento, l'afflusso di sangue e la guarigione fino a quando non è stata ottenuta una forza adeguata10,18.
Per stabilire la fattibilità di fissare l'innesto ET più debole o altro materiale di innesto tra il tendine rotto, abbiamo sviluppato una nuova tecnica di sutura in grado di scaricare l'innesto in modo che possa maturare e integrarsi gradualmente nel tessuto ospite in vivo.
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Protocol
NOTA: La progettazione dell'esperimento e l'approvazione etica sono state ottenute dall'UCL Institutional Review Board (IRB). Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo il regolamento del Ministero degli Interni e le linee guida degli animali (procedura scientifica) Act 1986 con la legislazione rivista della direttiva europea 2010/63 / UE (2013). I conigli sono stati ispezionati da un veterinario nominato (NVS) periodicamente e due volte in un giorno da un funzionario per la cura e il benessere degli animali (NACWO) (secondo le linee guida e i regolamenti del Ministero degli Interni). Non hanno mostrato alcun segno di dolore fino a quando non sono stati eutanasizzati.
1. Preparazione dell'innesto di tendine ingegnerizzato tissutale (ET)
- Per fabbricare l'idrogel di collagene, aggiungere 4 mL di soluzione di collagene monomerico di tipo 1 della coda di ratto (2,15 mg / mL in acido acetico allo 0,6% con 0,2% p / v di proteine totali) e 500 μL di 10x Minimal Essential Medium. Neutralizzare questo titolando contro idrossido di sodio 5 M e 1 M e aggiungere 500 μL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
- Versare 5 mL di questa soluzione in uno stampo metallico rettangolare costruito su misura (33 mm × 22 mm × 10 mm, peso 120 g) (Figura 1). Tenere lo stampo in un incubatore a CO2 a 37 °C e 5% CO2 per 15 minuti per consentire l'assemblaggio della matrice19.
2. Fabbricazione dell'innesto
- Dopo la polimerizzazione, rimuovere l'idrogel di collagene dallo stampo e posizionarlo in un gruppo di compressione plastica standard (Figura 2A)19.
- Posizionare l'idrogel di collagene tra due fogli di rete di nylon da 50 μm e applicare un carico statico di 120 g (superficie totale 7,4 cm2, che è una pressione equivalente a 1,6 kPa) per 5 minuti per rimuovere il liquido interstiziale dall'idrogel (Figura 2A). Utilizzare quattro strati di carta da filtro per assorbire il fluido scaricato dagli idrogel.
- Utilizzare quattro strati di gel compressi arrotolati uno sopra l'altro (Figura 2B) e tagliati in segmenti di 15 mm (Figura 2C) per fabbricare l'ET.
NOTA: negli esperimenti sono stati utilizzati conigli maschi bianchi della Nuova Zelanda di età compresa tra 16 e 25 settimane. - Sedare gli animali con una dose intramuscolare (i.m.) di Hypnorm (0,3 mg/mL) ed eutanasiare somministrando un sovradosaggio di pentobarbitone.
- Subito dopo l'eutanasia, tagliare i capelli su entrambe le zampe posteriori. Quindi, con una lama chirurgica di dimensioni 20, eseguire un'incisione di 9 cm attorno all'area tibiofibulare inferiore per esporre il tendine tibiale posteriore (TP).
- Con la stessa lama chirurgica di dimensioni, asportare i tendini TP lapini con una lunghezza media di 70 mm e mantenere umidi in PBS durante il processo sperimentale per evitare l'essiccazione.
3. Sviluppato una nuova tecnica Tenorrhaphy
NOTA: Le suture (vedi Tabella dei Materiali)sono inassorbibili e costituite da uno stereoisomero cristallino isotattico di polipropilene, che è una poliolefina lineare sintetica. Le suture ad incastro del nucleo erano costituite principalmente da 3-0 e le suture periferiche erano 6-0. Queste erano le due principali suture utilizzate in tutti gli esperimenti.
- Con una lama chirurgica, tagliare il tendine TP nel punto medio. Asportare un segmento di 15 mm del tendine dal centro del tendine e sostituirlo con l'innesto di collagene ET (Figura 2D). Interbloccare la sutura 3-0 prossimalmente lontano dalle estremità del tendine nativo (Figura 3A).
- Passare le suture del nucleo 3-0 sopra l'intera lunghezza dell'innesto e interbloccare distalmente lontano dall'estremità tagliata.
- Fissare entrambe le estremità dell'ET al tendine nativo con 6-0 e suture continue in esecuzione intorno alla periferia accoppiando due estremità tendinee (Figura 3B). Questo viene fatto in modo che l'innesto possa essere spostato facilmente sulla sutura ponendo tensione sul tendine nativo20.
- Dopo aver fissato la sutura come descritto sopra, assicurarsi manualmente che la tensione sulle suture sia appropriata e che non vi sia flaccidità nella totalità della sutura.
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Representative Results
Abbiamo usato innesti di collagene fabbricati con collagene di tipo I, poiché questa è la proteina predominante che si trova nel tendine. Costituisce quasi il 95% del collagene totale nel tendine; quindi, il collagene ha mostrato tutte le proprietà ideali per imitare il tendine in vivo21,22.
In questo studio, il collagene di tipo I utilizzato è stato estratto dal tendine della coda di ratto e disciolto nell'acido acetico (2,15 mg / ml). Per polimerizzare questo collagene, è stato neutralizzato con idrossido di sodio in vitro, che ha formato fibrille di collagene anisotropico non reticolate. Questo idrogel contiene il 98% di fluido e potrebbe imitare il tessuto vivente in vivo entro 20 minuti durante la fabbricazione23. Tuttavia, questo idrogel è meccanicamente debole; pertanto, per aumentare le proprietà meccaniche, abbiamo sviluppato un metodo per la compressione rapida dell'idrogel di collagene con una tecnica nota come "compressione plastica", in cui il grado di compressione è direttamente proporzionale al peso applicato sulla parte superiore e al fluido rilasciato dalla superficie di uscita del fluido (FLS)19.
Il rotolamento a spirale di questo innesto aumenta le sue proprietà meccaniche19, ma l'innesto rimane significativamente più debole del tendine nativo. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato una nuova tecnica di sutura modificata posizionando punti di sutura, non sul bordo dei tendini rotti ma prossimalmente e distalmente. Pertanto, la forza della riparazione è sulle suture e sui punti di sutura e non sull'innesto tendineo meccanicamente più debole.
Per dimostrare la funzionalità della nuova tecnica di sutura sviluppata, è stato asportato un tendine TP lapino. Lo spazio è stato riempito con un innesto tendineo lungo 15 mm fissato con suture 6-0 e 3-0 suture interbloccate sono state posizionate a 70 mm per fungere da barriere di carico (Figura 3A). La resistenza media alla rottura della riparazione è stata di 50,62 ± 8,17 N, che era significativamente più alta (p < 0,05) rispetto a quella della riparazione Kessler di controllo di 12,49 ± 1,62 N (Figura 4A). Quindi, la lunghezza della sutura del nucleo e il loro incastro lontano dalle estremità del tendine influenzano significativamente la resistenza del tendine e le riparazioni dal fallimento a forze di magnitudo superiore24,25.
Questa resistenza era inadeguata nelle riparazioni di controllo che causavano un guasto precoce della riparazione e un guasto di deformazione di oltre il 20% sul tendine. Tuttavia, questa è un'anomalia fisiologica, poiché i tendini in vivo non sono mai soggetti a uno sforzo del 20% a causa del fatto che non c'è abbastanza spazio per un tendine per estendersi così tanto; pertanto, per testare la fattibilità della tecnica di sutura in vivo, abbiamo eseguito la riparazione in situ e calcolato una resistenza alla rottura media di 24,60 ± 3,92 N, che è significativamente superiore alla resistenza alla rottura media di controllo di 13,98 ± 2,26 N (Figura 4B).
Figura 1: Idrogel di collagene neutralizzato (pH 7,4) (colore rosa) fuso nello stampo in acciaio inossidabile. Al gel è stato permesso di rimanere in un incubatore a CO2 a 37 °C per 20 minuti per la fibrillogenesi. La barra della scala è mostrata in basso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Processo di compressione della plastica. (A) L'idrogel di collagene posto tra le maglie di nylon con un carico statico costante di 120 grammi applicato. Il fluido drenato è stato assorbito da quattro strati di carta da filtro. La freccia mostra la superficie di uscita del fluido (FLS) per il gel. (B) Quattro strati di fogli di collagene compresso sono stati arrotolati lungo l'asse per formare un "tendine ingegnerizzato" (ET). (C) La sezione di ET è stata tagliata in segmenti di 15 mm per imitare il tendine. (D) Il difetto del tendine è stato creato nel tendine nativo (NT) asportando un segmento di 15 mm del tendine tibiale posteriore e il difetto è stato riempito con ET. Questo pannello è stato modificato dal lavoro precedente26. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: (A) Il difetto del tendine è stato riempito con ET e fissato con suture 6-0, e la tecnica di sutura a quattro filamenti ad incastro 3-0 è stata eseguita passando sopra l'innesto nella regione di 30 mm. La freccia di blocco mostra il punto iniziale per la sutura e la freccia vuota mostra il punto finale della sutura. Questo pannello è stato modificato dal lavoro precedente26. (B) Fattibilità dell'esecuzione di una tecnica di sutura sviluppata in uno spazio all'interno del modello lapino(in situ). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Resistenza meccanica. (A) Un'uscita di prova meccanica della riparazione e (B) un'uscita di prova meccanica in situ (barre di errore = SD; *p < 0,05, ANOVA unidirezionale con correzione Bonferroni). Questo pannello è stato modificato dal lavoro precedente26. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, gli innesti di collagene di tipo I ingegnerizzati tissutale sono stati scelti come innesto tendineo perché il collagene è un polimero naturale e utilizzato come biomateriale per varie applicazioni di ingegneria tissutale27,28. Inoltre, il collagene costituisce il 60% della massa secca del tendine, di cui il 95% è di collagene di tipo 1 21,29,30,31,32. Affinché si verifichi un attecchimento di successo, le proprietà meccaniche dell'innesto dovrebbero idealmente corrispondere al tendine nativo33; tuttavia, con le attuali tecniche ingegneristiche, le proprietà meccaniche di ET (4,41 N) sono significativamente inferiori al tendine nativo (NT) (261,08 N)33. Si propone che ciò sia dovuto alla disposizione gerarchica altamente organizzata della fibrilla di collagene nel tendine nativo, che rimane una sfida per ingegnerizzare e abbinare le sue proprietà meccaniche34. Abbiamo cercato di aumentare la densità della matrice ET applicando un peso statico di compressione all'idrogel di collagene33; tuttavia, la complessità architettonica da cui il tendine acquisisce la sua forza è più intricata. I metodi per accumulare forza meccanica sono probabilmente meglio raggiunti in vivo, dove i processi biologici dell'ospite possono agire sul rimodellamento della matrice extracellulare. Pertanto, in questo studio, è stata adottata un'altra strategia per modificare l'attuale tecnica di sutura come riparazione post tendine; la resistenza meccanica dell'innesto tendineo riparato dipende interamente dalla tecnica di sutura8,9. Quindi, modificando le tecniche di sutura esistenti, possiamo scaricare l'innesto tendineo ingegnerizzato fino a quando il rimodellamento indotto da cellule ed ECM si verifica come un nuovo approccio.
Ad oggi, ci sono varie tecniche di sutura disponibili per riparare il tendine, nessuna delle quali è un gold standard; tuttavia, la tecnica di sutura kessler modificata è ampiamente utilizzata per riparare i tendini perché è meno ostruttiva e dannosa per i tendini35,36. Il tendine muscolare flessore digitorum profundus degli agnelli, quando suturato con la tecnica Savage a 6 filamenti, è stato segnalato per avere una forza di rottura di 51,3 N, ma quando è stata utilizzata una tecnica di sutura Kessler modificata, la forza di rottura era 69,0 N7. Tuttavia, in questo studio, quando lo spazio tendineo di 15 mm è stato riempito con ET e riparato con la tecnica di sutura Kessler modificata, la riparazione è fallita in una fase iniziale con una resistenza alla rottura di 12,49 N (Figura 4). Questo basso valore rende la tecnica clinicamente irrilevante. Risultati simili sono stati riportati da De Wit et al. in un modello di tendine di riparazione del flessore suino, suggerendo che la riparazione di Kessler non è riuscita alla rottura della sutura riducendo il gapping del 15% rispetto alla riparazione crociata, dove il gapping è ridotto dell'87% e la riparazione non è riuscita al pull-out della sutura38. Pertanto, è necessaria un'altra tecnica di sutura forte, che potrebbe mantenere in posizione ET meccanicamente più debole.
Una nuova tecnica di sutura modificata è stata sviluppata utilizzando quattro suture core su tutta la lunghezza dell'ET e sopra il tendine opposto. Queste suture erano interconnesse sul materiale di sutura stesso a una certa distanza da ciascuna estremità del tendine. Ciò è dovuto principalmente al fatto che è stato riportato che mettere nodi di sutura a uguale distanza e uguale tensione di condivisione del carico su tutti i fili di sutura aumenta le loro proprietà meccaniche39. Una riparazione bilanciata può anche essere ottenuta mantenendo una sutura continua e scaglionando la riparazione per consentire la compressione nel sito di riparazione40.
In questo studio, sono state utilizzate suture 3-0 per le suture esterne interbloccate considerando che il tendine TP del coniglio ha una lunghezza, larghezza e spessore di 62,4 mm, 5 mm e 1,5 mm, rispettivamente. Sono state utilizzate suture 6-0 per mantenere l'ET in posizione. Sebbene abbiamo provato altri materiali di sutura assorbibili, non sarebbe appropriato in quanto diventano più deboli in un periodo in vivo41. Un motivo principale per cui sono state selezionate le suture in polipropilene è perché sono un monofilamento oltre che non assorbibili e non causano modifiche strutturali o tensionali sotto carico42. Abbiamo testato tutte le suture da 2-0 a 7-0, ma 3-0 e 6-0 sono risultati essere i candidati ideali per i nostri esperimenti 26.
Il motivo principale per l'utilizzo della riparazione di 4 fili era quello di evitare danni eccessivi alle estremità tendinee rotte con un numero maggiore di fili di sutura in quanto è stato riportato che una normale sutura chirurgica in un tendine provoca la formazione di una regione acellulare43. È stato ipotizzato che ciò sia dovuto al fatto che le cellule migrano fuori dal carico di compressione che viene messo sul tendine, e normalmente queste celle sono soggette a carico ditrazione 17. Questa migrazione delle cellule lontano dalla sutura potrebbe quindi causare l'indebolimento della matrice in quanto vi è una scarsità di cellule per mantenere e turnover la matrice, che potrebbe causare un fallimento tendineo precoce17. Possiamo usare più fili di suture che sono biomeccanicamente due volte più forti(ex vivo) rispetto alle suture a 4 filamenti11,12,44,45; tuttavia, queste riparazioni non sono ampiamente praticate e le loro limitazioni cliniche sono attualmente in fase di valutazione13,14,15,16.
Il posizionamento del nodo di sutura è importante, ma ci sono argomenti a favore e contro l'esternalizzazione della sutura. Avere la sutura sulla superficie esterna può potenzialmente impigliarsi contro strutture come le pulegge tendinee e ridurre la planata. In uno studio, le aree in cui i nodi di sutura sono collocati all'interno hanno illustrato una diminuzione della resistenza al volo a vela rispetto alla riparazione Kessler, che ha nodi di sutura all'esternodi 46. Gli studi condotti nel modello canino hanno concluso che ad una maggiore grandezza della forza, erano sopravvissuti meno nodi di sutura situati al di fuori della riparazione e lontano dalle estremità del tendine rispetto a quelli situati all'interno della riparazione47,48. Tuttavia, l'interiorizzazione del nodo riduce potenzialmente la superficie di contatto del tendine di guarigione. C'è anche la considerazione che il danno tissutale deriva dall'ago di sutura che perfora il tendine e il maggior numero di passaggi si riferisce all'aumento del trauma tendineo49.
Per fissare ET tra lo spazio tendineo, è stato eseguito uno standard di suture di corsa50 lungo il bordo del tendine ed ET. Questo è stato fatto perché c'era bisogno di suture periferiche che fossero abbastanza forti da mantenere l'ET in posizione nella fase iniziale di guarigione fino a quando il rimodellamento indotto da cellule ed ECM poteva verificarsi50. Il problema principale era la variazione delle proprietà meccaniche dell'NT e dell'ET, che poteva portare alla formazione precoce di gap sebbene l'ET fosse schermato dalle sollecitazioni. D'altra parte, applicando una tecnica più sicura come materasso orizzontale suture intrafiber51, Halsted continuo materasso sutureorizzontali 52,53, tecniche di riparazione epitendinea punto croce54,55,56,57 o suture di blocco in esecuzione58,59 avrebbe rotto ET in quanto è fragile. Pertanto, abbiamo scelto le suture da corsa come tecnica di sutura periferica che è semplice e mantiene intatto l'ET in tutte le direzioni.
Dal punto di vista dell'ingegneria tissutale, dobbiamo studiare se questo metodo può essere utilizzato per riempire uno spazio tendineo superiore a 1,5 cm. Per utilizzare questo innesto in studi clinici sull'uomo, dobbiamo studiare ulteriormente la risposta immunologica alla fonte xenogenica di collagene, sebbene ciò possa essere ottenuto sviluppando collagene di grado clinico. Il protocollo qui descritto stabilisce la fattibilità della tecnica di sutura sviluppata all'interno degli spazi anatomici disponibili in un modello lapino suino. Questa tecnica di sutura sviluppata ha punti di sutura prossimalmente e equidistanza distale dalle estremità tendinee rotte in modo che l'innesto di tendine ingegnerizzato possa essere scaricato. Quindi, potrebbe maturare e integrarsi in vivo.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero ringraziare UCL per aver finanziato questo progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat tail type 1 Collagen | First Link, Birmingham, UK | 60-30-810 | |
| prolene sutures 6-0 | Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K. | EP8726H | |
| prolene sutures 3-0 | Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K. | D8911 | |
| Whatman filter paper | SIGMA-ALDRICH | WHA10010155 | |
| Gibco DMEM, high glucose | Thermo Fisher Scientific | 11574486 | |
| Nylon mesh | Plastok (Meshes and Filtration) Ltd. | NA |
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