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Bioengineering

Une nouvelle technique de suture Tenorrhaphy avec greffe de collagène issue d’une ingénierie tissulaire pour réparer les gros défauts tendineux

Published: December 10, 2021 doi: 10.3791/57696
Automatic Translation
1,3, 2, 1
1Division of Surgery and Interventional Science, University College London, 2Blond McIndoe Laboratories, Division of Cell Matrix and Regenerative Medicine, MAHSC, University of Manchester, 3Department of Surgical Research, Northwick Park Institute for Medical Research, Northwick Park Hospital

Summary

Dans cet article, nous présentons un protocole in vitro et in situ pour réparer un espace tendineux allant jusqu’à 1,5 cm en le remplissant d’une greffe de collagène modifiée. Ceci a été réalisé en développant une technique de suture modifiée pour prendre la charge mécanique jusqu’à ce que le greffon mûrisse dans le tissu hôte.

Abstract

La prise en charge chirurgicale des gros défauts tendineux avec des greffes de tendon est difficile, car il existe un nombre limité de sites où les donneurs peuvent être facilement identifiés et utilisés. Actuellement, cette lacune est comblée par des greffes tendineuses auto, allo, xéno ou artificielles, mais les méthodes cliniques pour les sécuriser ne sont pas nécessairement traduisibles pour les animaux en raison de l’échelle. Afin d’évaluer de nouveaux biomatériaux ou d’étudier une greffe de tendon composée de collagène de type 1, nous avons développé une technique de suture modifiée pour aider à maintenir le tendon d’ingénierie en alignement avec les extrémités du tendon. Les propriétés mécaniques de ces greffons sont inférieures au tendon natif. Pour intégrer le tendon d’ingénierie dans des modèles cliniquement pertinents de réparation chargée, une stratégie a été adoptée pour décharger la greffe de tendon d’ingénierie tissulaire et permettre la maturation et l’intégration du tendon d’ingénierie in vivo jusqu’à ce qu’un néo-tendon mécaniquement sain soit formé. Nous décrivons cette technique en utilisant l’incorporation de la construction de tendon de collagène de type 1.

Introduction

Une rupture du tendon peut survenir en raison de facteurs extrinsèques tels que des lacérations traumatiques ou une charge excessive du tendon. En raison des forces de traction externes placées sur une réparation de tendon, un écart se forme inévitablement avec la plupart des techniques de réparation de tendon. Actuellement, les défauts tendineux sont comblés par des greffes auto, allo, xéno ou artificielles, mais leur disponibilité est limitée et le site donneur est une source de morbidité.

L’approche d’ingénierie tissulaire pour fabriquer une greffe de tendon à partir d’un polymère naturel tel que le collagène a l’avantage distinctif d’être biocompatible et peut fournir des composants vitaux de la matrice extracellulaire (ECM) qui facilitent l’intégration cellulaire. Cependant, en raison d’un manque d’alignement fibrillaire, les propriétés mécaniques du tendon artificiel (ET) sont inférieures au tendon natif. Pour augmenter les propriétés mécaniques du collagène plus faible, de nombreuses méthodes ont été utilisées, telles que la réticulation physique sous vide, le rayonnement UV et les traitements déshydrothermaux1. En outre, grâce à la réticulation chimique avec la riboflavine, les méthodes enzymatiques et non enzymatiques ont augmenté la densité de collagène et le module de Young du collagène in vitro2,3. Cependant, en ajoutant des agents de réticulation, la biocompatibilité du collagène est compromise, car des études ont montré une altération de 33% des propriétés mécaniques et une perte de 40% de viabilité cellulaire3,4,5. L’accumulation progressive de l’alignement et de la résistance mécanique peut être obtenue par charge cyclique6; cependant, cela peut être acquis efficacement in vivo7.

Pour que l’ET s’intègre in vivo et acquière une résistance sans avoir besoin d’altération chimique, une approche consisterait à utiliser une technique de suture stabilisatrice pour maintenir la construction la plus faible en place. La plupart des réparations tendineuses reposent sur la conception de la suture pour maintenir les extrémités du tendon ensemble; par conséquent, la modification de ces techniques existantes pourrait fournir une solution logique8,9.

Jusque dans les années 1980, les réparations à 2 brins étaient largement utilisées, mais la littérature chirurgicale récente décrit l’utilisation de 4 brins, 6 brins ou même 8 brins en réparation10,11. En 1985, Savage a décrit des techniques de suture à 6 brins avec 6 points d’ancrage, et elle était significativement plus forte que la technique de suture Bunnell qui utilise 4 brins 12. En outre, les réparations à 8 brins sont 43% plus fortes que les autres brins dans les modèles de cadavres et in situ, mais ces réparations ne sont pas largement pratiquées car il devient techniquement difficile de reproduire les réparations avec précision13,14,15,16. Par conséquent, un plus grand nombre de brins de suture du noyau est lié à une augmentation proportionnelle des propriétés biomécaniques du tendon réparé. Cependant, il y a une perte de viabilité cellulaire autour des points de suture, et le traumatisme d’une suture excessive peut être au détriment du tendon, ce qui peut compromettre la cicatrisation du tendon17. Les techniques de suture doivent fournir une réparation géométrique forte, équilibrée et relativement inélastique pour minimiser les écarts tendineux après réparation. En outre, l’emplacement de la suture et ses nœuds doivent être placés stratégiquement afin qu’ils n’interfèrent pas avec le glissement, l’approvisionnement en sang et la guérison jusqu’à ce que l’accumulation d’une force adéquate ait été obtenue10,18.

Pour établir la faisabilité de sécuriser une greffe ET plus faible ou un autre matériau de greffe entre le tendon rompu, nous avons développé une nouvelle technique de suture qui peut décharger le greffon afin qu’il puisse mûrir et s’intégrer progressivement dans le tissu hôte in vivo.

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Protocol

NOTE: La conception de l’expérience et l’approbation éthique ont été obtenues auprès du Conseil d’examen institutionnel (CISR) de l’UCL. Toutes les expériences ont été réalisées conformément à la réglementation du ministère de l’Intérieur et aux directives de la loi de 1986 sur les animaux (procédure scientifique) avec la législation révisée de la directive européenne 2010/63/UE (2013). Les lapins ont été inspectés par un vétérinaire nommé (NVS) périodiquement et deux fois par jour par un agent de soins et de bien-être des animaux nommé (NACWO) (conformément aux directives et règlements du ministère de l’Intérieur). Ils n’ont montré aucun signe de douleur jusqu’à ce qu’ils soient euthanasiés.

1. Préparation du greffon de tendon d’ingénierie tissulaire (ET)

  1. Pour fabriquer l’hydrogel de collagène, ajoutez 4 mL de solution de collagène monomère de type 1 de la queue de rat (2,15 mg/mL dans de l’acide acétique à 0,6 % avec 0,2 % p/v de protéines totales) et 500 μL de milieu essentiel minimal 10x. Neutralisez cela en titrant contre de l’hydroxyde de sodium 5 M et 1 M et ajoutez 500 μL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco.
  2. Verser 5 mL de cette solution dans un moule métallique rectangulaire construit sur mesure (33 mm × 22 mm × 10 mm, poids de 120 g)(Figure 1). Conserver le moule dans un incubateur à CO2 à 37 °C et 5 % deCO2 pendant 15 minutes pour permettre l’assemblage de la matrice19.

2. Fabrication du greffon

  1. Après polymérisation, retirer l’hydrogel de collagène du moule et le placer dans un ensemble de compression plastique standard (Figure 2A)19.
  2. Placer l’hydrogel de collagène entre deux feuilles de mailles de nylon de 50 μm et appliquer une charge statique de 120 g (surface totale 7,4 cm2, soit une pression équivalente à 1,6 kPa) pendant 5 minutes pour éliminer le liquide interstitiel de l’hydrogel (Figure 2A). Utilisez quatre couches de papier filtre pour absorber le fluide évacué des hydrogels.
  3. Utiliser quatre couches de gels comprimés roulés les uns sur les autres (Figure 2B) et découpés en segments de 15 mm (Figure 2C) pour fabriquer l’ET.
    NOTE: Des lapins mâles blancs de Nouvelle-Zélande âgés de 16 à 25 semaines ont été utilisés dans les expériences.
  4. Calmer les animaux avec une dose intramusculaire (i.m.) d’Hypnorm (0,3 mg /mL) et les euthanasier en administrant un surdosage de pentobarbitone.
  5. Immédiatement après l’euthanasie, coupez les poils sur les deux pattes postérieures. Ensuite, avec une lame chirurgicale de taille 20, faites une incision de 9 cm autour de la zone tibiofibulaire inférieure pour exposer le tendon tibialis postérieur (TP).
  6. Avec la même lame chirurgicale, excisez les tendons TP de lapine d’une longueur moyenne de 70 mm et maintenez-les humides dans le PBS pendant le processus expérimental pour éviter le séchage.

3. Développement d’une nouvelle technique tenorrhaphy

REMARQUE: Les sutures (voir tableau des matériaux)sont non résorbables et fabriquées à partir d’un stéréoisomère cristallin isotactique de polypropylène, qui est une polyoléfine linéaire synthétique. Les sutures imbriquées du noyau étaient principalement constituées de 3-0 et les sutures périphériques étaient de 6-0. Ce sont les deux principales sutures utilisées dans toutes les expériences.

  1. Avec une lame chirurgicale, coupez le tendon TP au milieu. Exciser un segment de 15 mm du tendon du milieu du tendon et le remplacer par le greffon de collagène ET (Figure 2D). Imbriquez la suture 3-0 par voie proximale loin des extrémités tendineuses natives(Figure 3A).
  2. Passez les sutures de noyau 3-0 au-dessus de toute la longueur de la greffe et imbriquez distalement loin de l’extrémité coupée.
  3. Fixer les deux extrémités de l’ET au tendon natif avec des sutures 6-0 et continues autour de la périphérie en couplant deux extrémités de tendon(Figure 3B). Ceci est fait pour que le greffon puisse être déplacé facilement sur la suture en plaçant une tension sur le tendon natif20.
  4. Après avoir fixé la suture comme décrit ci-dessus, assurez-vous manuellement que la tension sur les sutures est appropriée et qu’il n’y a pas de flaccidité dans l’ensemble de la suture.

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Representative Results

Nous avons utilisé des greffes de collagène fabriquées à partir de collagène de type I, car c’est la protéine prédominante présente dans le tendon. Il constitue près de 95% du collagène total dans le tendon; par conséquent, le collagène a présenté toutes les propriétés idéales pour imiter le tendon in vivo21,22.

Dans cette étude, le collagène de type I utilisé a été extrait du tendon de la queue du rat et dissous dans l’acide acétique (2,15 mg / mL). Pour polymériser ce collagène, il a été neutralisé avec de l’hydroxyde de sodium in vitro, qui a formé des fibrilles de collagène anisotropes non réticulées. Cet hydrogel contient 98% de liquide et pourrait imiter des tissus vivants in vivo dans les 20 minutes pendant la fabrication23. Cependant, cet hydrogel est mécaniquement faible; par conséquent, pour augmenter les propriétés mécaniques, nous avons développé une méthode de compression rapide de l’hydrogel de collagène par une technique connue sous le nom de « compression plastique », où le degré de compression est directement proportionnel au poids appliqué sur le dessus et au fluide libéré de la surface de sortie du fluide (FLS)19.

Le laminage en spirale de ce greffon augmente ses propriétés mécaniques19, mais le greffon reste nettement plus faible que le tendon natif. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une nouvelle technique de suture modifiée en plaçant des points de suture, non pas au bord des tendons rompus, mais proximaux et distalement éloignés. Ainsi, la force de la réparation est sur les sutures et les points de suture et non sur la greffe de tendon mécaniquement plus faible.

Pour démontrer la fonctionnalité de la nouvelle technique de suture développée, un tendon TP de lapine a été excisé. L’espace a été comblé par une greffe tendineuse de 15 mm de long sécurisée par des sutures 6-0, et 3-0 sutures imbriquées ont été placées à 70 mm pour servir de barrières de charge(Figure 3A). La résistance moyenne à la rupture de la réparation était de 50,62 ± 8,17 N, ce qui était significativement plus élevé(p < 0,05) que celle de la réparation De Kessler de contrôle de 12,49 ± 1,62 N(Figure 4A). Par conséquent, la longueur de la suture du noyau et leur imbrication loin des extrémités du tendon influencent de manière significative la résistance du tendon et les réparations de la défaillance à des forces de magnitude plusélevées 24,25.

Cette résistance était insuffisante dans les réparations de contrôle, ce qui a entraîné une défaillance précoce de la réparation et une défaillance de la contrainte de plus de 20% sur le tendon. Cependant, il s’agit d’une anomalie physiologique, car les tendons in vivo ne sont jamais soumis à une contrainte de 20%, car il n’y a pas assez d’espace pour qu’un tendon s’étende autant; par conséquent, pour tester la faisabilité des modèles in vivo de la technique de suture, nous avons effectué une réparation in situ et calculé une résistance moyenne à la rupture de 24,60 ± 3,92 N, ce qui est significativement plus élevé que la résistance à la rupture moyenne de contrôle de 13,98 ± 2,26 N(Figure 4B).

Figure 1
Figure 1: Hydrogel de collagène neutralisé (pH 7,4) (couleur rose) coulé dans le moule en acier inoxydable. Le gel a été autorisé à rester dans un incubateur à CO2 à 37 °C pendant 20 minutes pour que la fibrillogenèse se produise. La barre d’échelle est affichée en bas. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Procédé de compression plastique. (A) L’hydrogel de collagène placé entre les mailles de nylon avec une charge statique constante de 120 grammes appliqués. Le fluide drainé a été absorbé par quatre couches de papier filtre. La flèche montre la surface de sortie du fluide (FLS) pour le gel. (B) Quatre couches de feuilles de collagène comprimé ont été roulées le long de l’axe pour former un « tendon artificiel » (ET). (C) La section d’ET a été découpée en segments de 15 mm pour imiter le tendon. (D) Le défaut tendineux a été créé dans le tendon natif (NT) en excisant un segment de 15 mm du tendon tibial postérieur, et le défaut a été rempli d’ET. Ce panneau a été modifié par rapport aux travaux précédents26. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: (A) Le défaut tendineux a été comblé avec de l’ET et fixé avec des sutures 6-0, et la technique de suture à quatre brins imbriqués 3-0 a été réalisée en passant au-dessus du greffon dans la région de 30 mm. La flèche de bloc indique le point de départ de la suture et la flèche vide indique le point d’extrémité de la suture. Ce panneau a été modifié par rapport aux travaux précédents26. (B) Faisabilité d’effectuer une technique de suture développée dans un espace à l’intérieur d’un modèle de lapine(in situ). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Résistance mécanique. (A) Une sortie d’essai mécanique de la réparation et (B) une sortie d’essai mécanique in situ (barres d’erreur = SD; *p < 0,05, ANOVA unidirectionnelle avec correction de Bonferroni). Ce panneau a été modifié par rapport aux travaux précédents26. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans cette étude, les greffes de collagène de type I issues de l’ingénierie tissulaire ont été choisies comme greffe de tendon parce que le collagène est un polymère naturel et utilisé comme biomatériau pour diverses applications d’ingénierie tissulaire27,28. En outre, le collagène constitue 60% de la masse sèche du tendon, dont 95% est du collagène de type 1 21,29,30,31,32. Pour que la greffe réussisse, les propriétés mécaniques du greffon doivent idéalement correspondre au tendon natif33; cependant, avec les techniques d’ingénierie actuelles, les propriétés mécaniques de l’ET (4,41 N) sont significativement inférieures à celles du tendon natif (NT) (261,08 N)33. Il est proposé que cela soit dû à l’arrangement hiérarchique très organisé de la fibrile de collagène dans le tendon natif, qui reste un défi à concevoir et à faire correspondre à ses propriétés mécaniques34. Nous avons essayé d’augmenter la densité de la matrice ET en appliquant un poids statique de compression à l’hydrogel de collagène33; cependant, la complexité architecturale à partir de laquelle le tendon acquiert sa force est plus complexe. Les méthodes pour accumuler la résistance mécanique sont sans doute mieux atteintes in vivo, où les processus biologiques de l’hôte peuvent agir sur le remodelage de la matrice extracellulaire. Par conséquent, dans cette étude, une autre stratégie a été adoptée pour modifier la technique de suture actuelle en tant que réparation post-tendon; la résistance mécanique de la greffe tendineuse réparée dépend entièrement de la technique de suture8,9. Par conséquent, en modifiant les techniques de suture existantes, nous pouvons décharger la greffe de tendon modifiée jusqu’à ce que le remodelage cellulaire et induit par l’ECM se produise comme une nouvelle approche.

À ce jour, il existe diverses techniques de suture disponibles pour réparer le tendon, dont aucune n’est un étalon-or; cependant, la technique de suture de Kessler modifiée est largement utilisée pour réparer les tendons car elle est moins obstructive et dommageable pour les tendons35,36. Le tendon musculaire fléchisseur digitorum profundus des agneaux, lorsqu’il est suturé avec la technique Savage à 6 brins, aurait une résistance à la rupture de 51,3 N, mais lorsqu’une technique de suture Kessler modifiée a été utilisée, la force de rupture était de 69,0 N7. Cependant, dans cette étude, lorsque l’espace tendineux de 15 mm a été rempli d’ET et réparé avec la technique de suture Kessler modifiée, la réparation a échoué à un stade précoce avec une résistance à la rupture de 12,49 N(Figure 4). Cette faible valeur rend la technique cliniquement non pertinente. Des résultats similaires ont été rapportés par De Wit et al. dans un modèle de tendon de réparation du fléchisseur porcin, suggérant que la réparation de Kessler a échoué à la rupture de la suture en réduisant le gapping de 15% par rapport à la réparation du croisé, où le gapping est réduit de 87% et la réparation a échoué au retrait de la suture38. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser une autre technique de suture forte, qui pourrait maintenir en place un ET mécaniquement plus faible.

Une nouvelle technique de suture modifiée a été développée en utilisant quatre sutures à noyau sur toute la longueur de l’ET et au-dessus du tendon opposé. Ces sutures étaient imbriquées sur le matériau de suture lui-même à une certaine distance de chaque extrémité du tendon. Ceci est principalement dû au fait qu’il a été rapporté que le fait de mettre des nœuds de suture à distance égale et à tension de partage de charge égale sur tous les brins de suture augmente leurs propriétés mécaniques39. Une réparation équilibrée peut également être obtenue en gardant une suture continue et en échelonnant la réparation pour permettre la compression sur le site de réparation40.

Dans cette étude, 3-0 sutures ont été utilisées pour les sutures externes imbriquées étant donné que le tendon TP du lapin a une longueur, une largeur et une épaisseur de 62,4 mm, 5 mm et 1,5 mm, respectivement. Des sutures 6-0 ont été utilisées pour maintenir l’ET en place. Bien que nous ayons essayé d’autres matériaux de suture résorbables, ce ne serait pas approprié car ils s’affaiblissent au fil d’une période in vivo41. L’une des principales raisons pour lesquelles les sutures en polypropylène ont été choisies est qu’elles sont un monofilament et qu’elles ne sont pas résorbables et qu’elles ne provoquent pas de modifications structurelles ou tendancielles sous charge42. Nous avons testé toutes les sutures de 2-0 à 7-0, mais 3-0 et 6-0 se sont avérés être des candidats idéaux pour nos expériences 26.

La principale raison de l’utilisation de la réparation à 4 brins était d’éviter des dommages excessifs aux extrémités du tendon rompu avec un plus grand nombre de brins de suture, car il a été rapporté qu’une suture chirurgicale normale dans un tendon entraîne la formation d’une région acellulaire43. On a émis l’hypothèse que cela est dû à la migration des cellules à partir de la charge de compression qui est mise sur le tendon, et normalement ces cellules sont soumises à une charge de traction17. Cette migration des cellules loin de la suture pourrait alors provoquer un affaiblissement de la matrice car il y a une pénurie de cellules pour maintenir et renouveler la matrice, ce qui pourrait provoquer une défaillance précoce du tendon17. On peut utiliser plus de brins de sutures biomécaniquement deux fois plus forts(ex vivo) que les sutures à 4 brins11,12,44,45; cependant, ces réparations ne sont pas largement pratiquées et leurs limites cliniques sont actuellement en cours d’évaluation13,14,15,16.

Le placement du nœud de suture est important, mais il existe des arguments pour et contre l’extériorisation de la suture. Avoir la suture sur la surface extérieure peut potentiellement accrocher contre des structures comme les poulies tendineuses et réduire la glisse. Dans une étude, les zones où les nœuds de suture sont placés à l’intérieur ont illustré une diminution de la résistance au glissement par rapport à la réparation kessler, qui a des nœuds de suture à l’extérieur46. Les études menées dans le modèle canin ont conclu qu’à une magnitude plus élevée de la force, moins de nœuds de suture situés à l’extérieur de la réparation et loin des extrémités du tendon avaient survécu par rapport à ceux situés à l’intérieur de la réparation47,48. Cependant, l’internalisation du nœud réduit potentiellement la surface de contact du tendon cicatrisant. Il y a aussi la considération que les lésions tissulaires proviennent de l’aiguille de suture perçant le tendon et le plus grand nombre de passes est lié à l’augmentation du traumatismetendineux 49.

Pour fixer l’ET entre l’espace tendineux, une norme de sutures de course50 le long du bord du tendon et de l’ET a été réalisée. Cela a été fait parce qu’il y avait un besoin de sutures périphériques suffisamment solides pour maintenir l’ET en place dans la phase initiale de guérison jusqu’à ce que le remodelage cellulaire et induit par l’ECM puisse se produire50. Le problème majeur était la variation des propriétés mécaniques du NT et de l’ET, ce qui pouvait entraîner la formation précoce d’écarts bien que l’ET soit protégé contre les contraintes. D’autre part, l’application d’une technique plus sûre telle que les sutures horizontales de matelas intrafibre51, les sutures de matelas horizontales continues Halsted52,53, les techniques de réparation épitendineuses au point de croix54,55,56,57 ou les sutures de verrouillage de course58,59 aurait rompu ET car il est fragile. Ainsi, nous avons choisi les sutures de course comme technique de suture périphérique qui est simple et maintient l’ET intact dans toutes les directions.

Du point de vue de l’ingénierie tissulaire, nous devons étudier si cette méthode peut être utilisée pour combler un espace tendineux supérieur à 1,5 cm. Pour utiliser ce greffon dans des essais cliniques humains, nous devons étudier plus avant la réponse immunologique à la source xénogénique de collagène, bien que cela puisse être réalisé en développant du collagène de qualité clinique. Le protocole décrit ici établit la faisabilité de la technique de suture développée dans les espaces anatomiques disponibles dans un modèle de lapine porcine. Cette technique de suture développée a des points de suture proximaux et distalement équidistance loin des extrémités tendineuses rompues afin que la greffe de tendon artificielle puisse être déchargée. Par conséquent, il pourrait mûrir et s’intégrer in vivo.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier l’UCL pour le financement de ce projet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat tail type 1 Collagen  First Link, Birmingham, UK 60-30-810
prolene sutures 6-0 Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K. EP8726H
prolene sutures 3-0 Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K. D8911
Whatman filter paper SIGMA-ALDRICH  WHA10010155
Gibco DMEM, high glucose Thermo Fisher Scientific  11574486
Nylon mesh  Plastok (Meshes and Filtration) Ltd. NA

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Bioingénierie Numéro 178 Réparation des tendons ingénierie tissulaire collagène greffe de tendon technique de suture tendon
Une nouvelle technique de suture Tenorrhaphy avec greffe de collagène issue d’une ingénierie tissulaire pour réparer les gros défauts tendineux
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Sawadkar, P., Wong, J., Mudera, V. A … More

Sawadkar, P., Wong, J., Mudera, V. A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects. J. Vis. Exp. (178), e57696, doi:10.3791/57696 (2021).

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