Summary
Protein-protein og protein-metabolit interaktioner er afgørende for alle cellulære funktioner. Heri, beskriver vi en protokol, der tillader parallel analyse af disse interaktioner med et protein valg. Vores protokol var optimeret til plante cellekulturer og kombinerer affinitet rensning med massespektrometri-baseret protein og metabolitten påvisning.
Abstract
Cellulære processer er reguleret af vekselvirkninger mellem biologiske molekyler som proteiner, metabolitter og nukleinsyrer. Mens undersøgelsen af protein-protein interaktioner (PPI) er ingen nyhed, udgør eksperimentelle metoder med henblik på at karakterisere endogene protein-metabolit interaktioner (PMI) en temmelig seneste udvikling. Heri, præsenterer vi en protokol, der giver mulighed for samtidige karakterisering af PPI og PMI en protein valg, omtales som agn. Vores protokol var optimeret til Arabidopsis celle kulturer og kombinerer affinitet rensning (AP) med massespektrometri (MS)-baseret protein og metabolitten afsløring. Kort sagt, er gensplejsede Arabidopsis linjer, udtrykker agn protein smeltet til en affinitet tag, først mængden for at opnå en native cellulære ekstrakt. Anti-tag antistoffer bruges til at trække ned protein og metabolitten partnere agn protein. De affinitet-renset komplekser er udvundet ved hjælp af en et-trins methyl tert-butyl ether (MTBE) / methanol/vand metode. Mens metabolitter adskille i enten den polar eller den hydrofobe fase, kan proteiner findes i toerstoffet. Både metabolitter og proteiner er derefter analyseret af ultra-performance liquid chromatography-massespektrometri (UPLC-MS eller UPLC-MS/MS). Tom-vektor (EV) kontrol linjer er brugt til at udelukke falske positiver. Den største fordel ved vores protokol er, at det muliggør identifikation af protein og metabolitten partnere en target protein parallelt i nær-fysiologiske tilstande (cellulære lysate). Metoden præsenteres er enkel, hurtig og nemt kan tilpasses til biologiske systemer end plante cellekulturer.
Introduction
Metoden beskrevet her sigter identifikation af metabolitten og protein partnere et protein valg i i nærheden af -in vivo cellulære lysate betingelser. Det er blevet spekuleret, at mange flere metabolitter end karakteriseret i dag har en vigtig regulativfunktionen1. Metabolitter kan fungere som biologiske parametre, ændre aktivitet, funktionalitet og/eller lokalisering af deres receptor proteiner2,3,4. I det sidste årti blevet flere gennembrud metoder, muliggør identifikation af PMI i vivo eller i nærheden af -in vivo forhold, udviklede5. Tilgængelige tilgange kan opdeles i to grupper. Den første gruppe består af teknikker, der starter med en kendt-metabolit agn for at fælde roman protein partnere. Metoder omfatter affinitet kromatografi6, drug affinitet lydhør target-stabilitet assay7, kemo-proteomics8og termisk proteomet profilering9. Den anden gruppe består af en enkelt metode, der starter med et kendt protein for at identificere små-molekyle ligander10,11.
AP kombineret med MS-baserede lipidomics blev brugt til at analysere protein-lipid komplekser i Saccharomyces cerevisiae12. Som udgangspunkt, forfatterne brugt gærstammer udtrykker 21 enzymer involveret i ergosterol biosyntese og 103 kinaser smeltet til en tandem-affinitet rensning (TAP) tag. 70% af enzymerne og 20% af kinaser fandtes for at binde forskellige hydrofobe ligander, kaste lys ind i indviklede protein-lipid interaktion netværk.
Tidligere kunne vi vise, at tilsvarende til lipider, polar og semi-polære forbindelser også være bundet til proteinkomplekser isoleret fra de cellulære lysates13. Baseret på disse resultater, besluttede vi at optimere AP metode offentliggjort tidligere10,11 for planteceller og hydrofile forbindelser14. Til dette formål brugte vi TAP vektorer beskrevet af Van Leene et al. 2010, med held anvendt i anlægget PPI undersøgelser15. For at forkorte den tid, der kræves for at opnå transgene linjer, besluttede vi på Arabidopsis cellekulturer. Vi ansat en et-trins methyl- tert-butylether, (MTBE) / methanol/vand ekstraktion metode, giver karakterisering af proteiner (pellet), lipider (organiske fase) og hydrofile metabolitter (vandfasen)16 i en enkelt affinitet-rensning eksperiment. EV kontrol linjer blev indført for at udelukke falske positiver, fx proteiner bindende at koden alene. Som proof of concept vi markeret tre (af de fem) nucleoside ud kinaser præsentere i Arabidopsis genom (NDPK1-NDPK3). Blandt andre fund, kunne vi vise, at NDPK1 interagerer med glutathion S-transferase og glutathion. Vi kan derfor vise sig, at NDPK1 er udsat for glutathionylation14.
Sammenfattende præsenteres protokollen er et vigtigt redskab til karakterisering af protein-protein og protein-små-molekyle interaktion netværk og udgør et stort fremskridt over eksisterende metoder.
Protocol
Forberedelse af gensplejsede Arabidopsis celle kultur linjer, herunder kloning, omdannelse, markering og vækst betingelser kan findes i17. Bemærk, at EV kontrol linjer er anbefalet at korrigere for falske positiver. Før forsøget, skal du bekræfte overekspression af agn protein af western blot analyse, fx ved hjælp af IgG antistoffer mod G-protein del af tandem affinitet tag. Det er vigtigt at adskille vækst medier fra plante celle kultur materiale.
1. forberedelse plante celle materiale forud for forsøget
- Vokse en PSB-L A. thaliana celle kultur linje overekspression protein interesse18.
- Forberede MSMO medium, som indeholder 4.43 g/L MSMO blandet med 30 g/L saccharose. Justere pH buffer til 5.7 med 1 M KOH og autoklave løsningen. Før forsøget, supplere medium med 0,5 mg/L α-naphthaleneacetic syre, 0,05 mg/L kinetin og 50 μg/mL kanamycin.
- Dyrke transformerede plante cellekulturer i 50 mL af MSMO medium i en 100 mL målekolbe på en orbital platform shaker med blid agitation (130 rpm). Vokse celler i en kultur værelse på 20 ° C og lysintensiteten lig med 80 μmol m-2 s-1.
- Subkultur celler i friske medier hver 7 dage, udvande dem 1:10.
- Indsamle celler på den logaritmiske vækstfase ved hjælp af et glas tragt kombineret med en vakuumpumpe, ved hjælp af en nylon mesh som filter. Pak Infiltrer i aluminiumsfolie og fryse i flydende kvælstof.
Forsigtig: Husk at flydende nitrogen er meget koldt. Forkert håndtering kan forårsage forbrændinger. Bære passende personlige værnemidler, herunder termisk isoleret handsker, beskyttelsesbriller og en lab coat.
2. Tryk på protokol
Bemærk: De følgende trin er tilpasset fra Maeda et al. 201411 og Van Leene et al. 201117.
- Homogeniseres høstede og frosne plante celle kultur materiale ved hjælp af en mixer mill (2 min på 20 Hz) eller morter og støder for at opnå fint pulver. Alikvot 3 g jorden materiale (svarende til omkring 90 mg af total protein) pr. prøve. Undgå optøning i eksemplet under dette trin ved hjælp af flydende nitrogen pre kølet udstyr.
Bemærk: Butikken jorden plantemateriale i 50 mL tube ved –80 ° C til begyndelsen af en AP procedure. - Hakkede prøven i et væske-nitrogen-forkølede mørtel med 3 mL iskold lysisbuffer (0,025 M Tris-HCl pH 7,5; 0,5 M NaCl; 1,5 mM MgCl2; 0,5 mM DTT; 1 mM NaF; 1 mM Na3VO4; 100 x fortyndet kommercielle protease hæmmer cocktail; 1 mM PMSF) indtil materialet smelter. Når prøven smelter, straks gå videre til næste trin.
Bemærk: Forberede lysis buffer frisk. Indføre blindprøver på dette trin. Vaske-og rengøringsmidler er ikke anbefales, da de kan forårsage problemer i MS påvisning. - Hvis du vil fjerne celleaffald, opdele materialet i 2 mL microcentrifuge rør og centrifugeres ved 20,817 x g i 10 min. ved 4 ° C. Indsamle 3 mL af den klare lysate i en 15 mL konisk centrifugeglas.
- Under centrifugering skridt, reagensglasset IgG-Sepharose perler. Alikvot 100 µL af perler pr. sample og vaske dem med 1 mL af lysisbuffer. Vortex til resuspend perler og flash-spin. Kassér lysisbuffer og Gentag trin to gange. Resuspend perler i 400 µL af lysisbuffer.
- Tilføje perler til indsamlet anlægget lysate og inkuberes blandingen på en roterende hjul til 1 h ved 4 ° C.
- Overførsel blandingen til en sprøjte kombineret via Luer-lock loft med et spin kolonne med filter pore størrelse 35 µm. Anvend pres at passere lysate igennem. Perler med vedlagte komplekser vil forblive på filteret, mens den lysate vil gå igennem.
Bemærk: Brug eventuelt et vakuum mangfoldige system. Skabe bestemt hen til anvende blid pres for ikke at skade perlerne. - Vaske perlerne i første omgang med 10 mL af vask buffer (0,025 M Tris-HCl pH 7,5; 0,5 M NaCl), og derefter med 1 mL af eluering buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,5 mM EDTA, 1000 x fortyndet E64 og 1 mM PMSF). Udføre vask ved hjælp af en sprøjte, tilknyttet kolonne eller vakuum mangfoldige system.
Bemærk: Når ved hjælp af et vakuum mangfoldige system gøre visse at anvende blid pres for ikke at skade perlerne. - Inkuber perler med 400 µL af eluering buffer indeholdende 50 U af en forbedret version af tobakken etch virus (AcTEV) protease. Brug tabellen shaker ved 1000 rpm i 30 min. ved 16 ° C.
Bemærk: Husk at bruge en plug til at lukke kolonnen nederst tilføje eluering buffer. - Tilføje en ekstra del (50 U) af enzymet i kolonnen og inkuberes blandingen i de næste 30 min under samme, beskrevet ovenfor, betingelser.
- Eluatet opsamles i et 2 mL microcentrifuge rør ved centrifugering (1 min, 20,817 x g) eller ved vakuum manifold. Hvis du vil fjerne resterende komplekser, indføre en yderligere eluering trin ved hjælp af 200 µL af eluering buffer.
Bemærk: Opbevar prøve ved – 20 ° C eller –80 ° C, eller straks gå videre med ekstraktionstrinet protein og metabolit. Optø frosne prøver på is.
3. Western Blot analyse
- For at bekræfte tilstedeværelsen af agn bruge protein i de indsamlede eluatet 10 µL af protein – metabolit-holdige eluatet for at udføre SDS-PAGE og western blot analyse. For at identificere proteinet af interesse, skal du bruge musen primære antistoffer mod streptavidin-bindende protein (1:200), en del af TAP tag tilbage efter TEV protease kavalergang, som beskrevet i Van Leene et al. 201117. Brug derefter sekundære ged anti-museantistoffer kombineret med HRP.
4. metabolit og Protein udvinding
Bemærk: Denne protokol er tilpasset fra Giavalisco et al. 201116.
Bemærk: Fra dette trin og fremefter bruge UPLC-MS-grade løsninger.
- Der tilsættes 1 mL af methyl tert-butyl ether (MTBE) / methanol/vand opløsningsmiddel (3:1:1) til de indsamlede eluatet og proeven blandes ved inversion. Sørg for, at opløsningsmidlet er afkølet til – 20 ° C før ekstraktionstrinet.
Forsigtig: MTBE og methanol er skadelige stoffer. Udføre ekstraktionstrinet under stinkskab og bære passende personlige værnemidler, fx handsker. - Tilføje 0,4 mL methanol: vand 1:3 løsning til hver prøve og blande indholdet af prøven ved inversion.
Bemærk: Tilskud af blandingen med methanol: vand løsning resultater i faseadskillelse. Den øverste fase indeholder lipider, lavere fase indeholder polar og semi-polar metabolitter og proteiner kan findes i toerstoffet. - At adskille faser, centrifugeres prøve ved 20,817 x g i 2 min. ved stuetemperatur, så samle den øverste fase for lipid målinger (ikke gjort i denne protocol) ved hjælp af en manuel flydende håndtering pipette med 1 mL volumen kapacitet.
- Tilføje 0,2 mL methanol og blandes ved inversion.
- Centrifugeres prøve ved 20,817 x g i 2 min på RT og derefter indsamle den polar fase for metabolitten målinger (polar og semi-polære forbindelser). For at undgå at forstyrre protein pellet, forlade omkring 50 µL af den flydende fase i bunden af røret.
- Tør indsamlede prøver for metabolitten målinger natten over i en centrifugal fordamper. Undgå over tørring protein piller ved at fjerne prøver fra fordamperen efter 30-60 min.
Bemærk: Opbevare prøver ved – 20 ° C eller –80 ° C, eller straks gå videre med udarbejdelsen af proteiner for LC-MS/MS analyse.
5. at forberede prøverne proteom analyse
Bemærk: Dette trin er tilpasset fra Olsen et al. 200419 og den tekniske manual af Trypsin/Lys-C Mix (Se Tabel af materialer).
- Udføre Enzymatisk nedbrydning af prøven.
Forsigtig: Opløsningsmidler anvendes under enzymatisk fordøjelse og afsaltning af prøven er skadelige. Arbejde under stinkskab og bære passende personlige værnemidler, fx handsker.- Opløse protein pellet i 30 µL af frisklavede denaturering buffer (40 mM ammoniumbicarbonat indeholdende 2 M thiourinstof/6 M urinstof, pH 8). For at opnå bedre protein opløselighed, udføre et 15-min sonikering skridt. Gentag trin, indtil pelleten opløses.
- Centrifugeres prøve ved 20,817 x g i 10 min. ved 4 ° C, derefter overføre supernatanten til et nyt microcentrifuge-rør.
- Bestemme proteinkoncentration ved hjælp af Bradford protein assay.
- For yderligere analyse, alikvot et volumen svarende til 100 µg af protein og fylde prøven op til 46 µL med denaturering buffer.
- Tilføje til prøve 2 µL af frisklavede reduktion buffer (50 mM DTT opløst i H2O) og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur.
- Behandling af prøven med 2 µL af frisklavede alkylering buffer (150 mM iodoacetamide opløst i 40 mM ammoniumbicarbonat buffer) og inkuberes blandingen i mørke i 20 min. ved stuetemperatur.
- Fortyndes prøven med 30 µL af 40 mM ammoniumbicarbonat buffer og tilføje 20 µL af LysC/Trypsin Mix.
- Efter 4 h inkubation ved 37 ° C, fortyndes prøven med 300 µL af 40 mM ammoniumbicarbonat buffer.
- Fortsætte med natten inkubation ved 37 ° C.
- Surt prøve med ca. 20 µL af 10% trifluoreddikesyre (TFA) at opnå pH < 2. Check prøven pH ved hjælp af en pH strimmel.
Bemærk: Opbevar prøve ved – 20 ° C eller gå videre til næste trin.
- Desalt de fordøjede proteiner.
Bemærk: Brug fortrinsvis, en vakuum mangfoldige system. Undgå over tørring af kolonnen.- Skylles kolonnen C18 SPE (Se Tabel af materialer) med 1 mL 100% MeOH og derefter med 1 mL 80% acetonitril (ACN) der indeholder 0,1% TFA fortyndet i vand. Brug, her og i yderligere protein-afsaltning trin, et vakuum mangfoldige system til at fremskynde processen. Undgå over tørring af kolonnen.
- Blandingen henstår kolonnen ved at vaske det to gange med 1 mL 0,1% TFA fortyndet i vand.
- Læg prøven på kolonnen. Skyl tube med yderligere 200 µL af 0,1% TFA og overførsel løsningen på kolonnen. Køre løsningerne gennem kolonnen.
- Kolonnen udvaskes to gange med 1 mL 0,1% TFA.
- Elueres afsaltede peptider fra kolonnen med 800 µL af 60% ACN, 0,1% TFA løsning. Tør de indsamlede brøk i en centrifugal fordamper, undgå over tørring af proteinfraktion ved at fjerne prøver fra fordamperen efter 30-60 min.
Bemærk: Opbevar prøver ved – 20 ° C eller –80 ° C eller straks gå videre til næste trin. I efterfølgende trin, skal du holde prøver på is.
6. måling tilberedt Protein prøver ved hjælp af UPLC-MS/MS.
Bemærk: Før proteom og metabolomic målinger, filtrere (0,2 µm porestørrelse) og degas alle buffere bruger en vakuumpumpe til 1 h.
- Resuspend tørret peptid pellet gemt i 2 mL microcentrifuge rør i 50 µL af buffer C (3% v/v ACN, 0,1% v/v myresyre) ved hjælp af manuel flydende håndtering pipette med 200 µL volumen kapacitet. Der sonikeres prøver for en 15 min i et ultralydsbad med 35 kHz ultralyd frekvens.
Forsigtig: ACN og myresyre er skadelige stoffer. Arbejde under stinkskab og bære passende personlige værnemidler, fx handsker. - Centrifugeres prøve ved 20,817 x g i 10 min. ved 4 ° C, derefter overføre 20 µL af supernatanten til et hætteglas.
- Separat fordøjet peptider ved hjælp af en C18 kolonne med omvendt fase tilsluttet en væskekromatografi og erhverve massespektre ved hjælp af et massespektrometer.
- Separat på kolonnen 3 µL af prøven ved hjælp af en 300-nl/min strømningshastighed. For en mobil fase, bruge buffer C og D (63% v/v ACN, 0,1% v/v myresyre), danner en gradient ramping fra 3% ACN til 15% ACN over 20 min og derefter til 30% ACN over de næste 10 min.
Bemærk: Gemme resten af prøven ved – 20 ° C eller –80 ° C op til måneder. Før proteom måling, genfryses prøve på is. - Vaske forurenende stoffer ud i 10 min bruger 60% ACN og Blandingen henstår kolonnen med 5 µL af buffer C før målingen af den næste prøve.
- Få massespektre data-afhængige MS/MS metode med opløsning sæt på 70.000, AGC target 3e6 ioner, maksimal indsprøjtning tid af 100 ms, og en m/z spænder fra 300 til 1600. Erhverve maksimalt 15 MS/MS scanninger på en opløsning af 17,500, AGC mål for 1e5, maksimal indsprøjtning tid på 100 ms, underløb ratio på 20%, med en isolation vindue med 1,6 m/z og m/z spænder fra 200 til 2000. Aktiver apex udløseren (6-20 s), sæt dynamisk udelukkelse til 15 s, og udelukke afgifter af 1 og > 5.
- Separat på kolonnen 3 µL af prøven ved hjælp af en 300-nl/min strømningshastighed. For en mobil fase, bruge buffer C og D (63% v/v ACN, 0,1% v/v myresyre), danner en gradient ramping fra 3% ACN til 15% ACN over 20 min og derefter til 30% ACN over de næste 10 min.
7. behandling af proteom Data
- Download den nyeste Arabidopsis thaliana proteom database fra http://www.uniprot.org/ og omfatter forurenende database. Analysere rå data fra LC-MS kører ved hjælp af MaxQuant med den integrerede Andromeda peptid ransage maskine ved hjælp af standardindstillingen med aktiveret LFQ normalisering20,21,22. Finde detaljerede oplysninger om parametre, der bruges i Tabel S1.
- Åbn filen "protein groups.txt". For yderligere analyse, filtrere for protein grupper identificeres med mindst to unikke peptider. Fjerne protein grupper af MaxQuant defineret som potentielle forurenende stoffer og filter til A. thaliana proteiner (ARATH i Fasta overskrifter kolonne) findes i databasen.
- For at teste betydningen af protein berigelse mellem prøver, brug LFQ normaliseret intensiteter og udføre uparret, tosidede Student's t-test efterfulgt af flere sammenligning korrektion (f.eks. Benjamini & Hochberg falsk opdagelse sats (FDR) korrektion eller Bonferroni korrektion).
- Beregn p-værdi ved at sammenligne LFQ støtteintensiteter opnået for EV kontrol og NDPK1. Filtrere alle ubestemte værdier. Sortere p-værdier i stigende rækkefølge og bruger R script eller online regnemaskine (f.eks. https://www.sdmproject.com/utilities/?show=FDR) til at beregne FDR korrektion. Filter til FDR værdier under 0,1.
Bemærk: Overvej form af dataanalyse egnet til forskning. For kvantitative undersøgelser (analyse af protein berigelse mellem prøver) bruge intensitetsværdien "LFQ", der henviser til kvalitativ forskning (tilstedeværelsen eller fraværet af bestemt protein) vælge værdien "Intensitet". - Filter til protein grupper, der er mere rigelige i NDPK1 sammenligne med EV kontrol. Bestemme lokalisering af potentielle protein partnere ved hjælp af SUBA database23 og korrekt for protein lokaliseret sammen med NDPK1.
- Beregn p-værdi ved at sammenligne LFQ støtteintensiteter opnået for EV kontrol og NDPK1. Filtrere alle ubestemte værdier. Sortere p-værdier i stigende rækkefølge og bruger R script eller online regnemaskine (f.eks. https://www.sdmproject.com/utilities/?show=FDR) til at beregne FDR korrektion. Filter til FDR værdier under 0,1.
8. måling af prøver indeholdende Polar fase ved hjælp af UPLC-MS.
- Resuspend tørret polar fase fra trin 4.5 i 200 µL vand og sonikeres prøven i 5 min.
- Centrifugeres prøve ved 20,817 x g i 10 min. ved 4 ° C, derefter overføre supernatanten til et hætteglas.
Bemærk: Gemme resten af prøven ved – 20 ° C eller –80 ° C i op til flere måneder. Før metabolomic måling, genfryses prøve på is. - Udføre en adskillelse trin ved hjælp af UPLC koblet til C18 kolonne med omvendt fase og erhverve massespektre med MS.
- Indlæse på kolonne 2 µL af prøven pr. injektion for hver ionisering tilstand (positive og negative) og adskille brøkdel bruger 400 µL/min strømningshastighed. Hvis du vil oprette den krævede graduering for metabolitten måling, forberede Mobil fase løsning som følger: buffer en (0,1% myresyre i H2O) og buffer B (0,1% myresyre i ACN).
- Separate metabolitter på 400 µL/min. og den følgende forløb: 1 min 99% af buffer A, 11-min lineær gradient fra 99% af buffer A til 60% af buffer A, 13-min lineær gradient fra 60% af buffer A til 30% af buffer A, 15-min lineær gradient fra 30% af buffer A til 1% hold 1% koncentration af buffer A, indtil 16 min. starter fra 17 min, brug lineær gradient fra 1% af buffer A 99% af buffer A. re Blandingen henstår kolonnen for 3 min med 99% koncentration af buffer A før målingen af den næste prøve.
- Erhverve massespektre dækker masseinterval mellem 100 og 1500 m/z med opløsning indstillet til 25.000 og loading tid begrænset til 100 ms. indstille AGC mål til 1e6, kapillær spændingen til 3kV med en skede gas flow og hjælpeansatte gas værdi af 60 og 20 , henholdsvis. Indstil kapillær temperaturen til 250 ° C og skimmer spænding til 25R.
9. behandling af Metabolomics Data
- Processen indsamlet kromatogrammer erhvervet fra begge ionisering tilstande. Brug software til at udtrække masse til ladning forhold (m/z), retentionstiden (RT) og intensitet af tilknyttede toppe, fx kommerciel software (Se Tabel af materialer) eller alternative24.
- Starte behandling software ved at dobbeltklikke på .exe-filen
- Oprette nye arbejdsproces, søge efter aktivitet "Belastning fra fil" og flytte denne aktivitet af "træk og slip" til tom arbejdsproces plads. Tryk på aktivitet med højre museknap og åbne indstillingerne for aktiviteten.
- I fanen, der indeholder "Almindelige" indstillinger, sæt et navn af eksperimentet i feltet "Navn" og klik derefter på "Vælg filer og mapper" og markere rå kromatogrammer.
- I fanen, der indeholder indstillingerne for "Avanceret", skal du angive "Profil Data Cutoff" til 0 intensitet. Klik på "Anvend" og "OK".
- Søg efter og Tilføj aktivitet "Data feje". Tryk på aktivitet med højre museknap og åbne indstillingerne for aktiviteten.
- I fanen, der indeholder "Almindelige" indstillinger, markere "Barycentrum data" og "MS/MS Data". Fjern alle MS/MS data ved at vælge "Alt" i juryen.
- Søg efter og Tilføj aktivitet "Kromatogrammet kemiske støj subtraktion". Tryk på aktivitet med højre museknap og åbne indstillingerne for aktiviteten.
- I fanen, der indeholder "Almindelige" indstillinger, markere "Kromatogrammet udglatning" og angive antal scanninger til "3" og "Estimator" til "Moving gennemsnit". Indstil "RT vindue" til 51 scanninger, "Fraktil" til 50%, subtraktion "Metode" og 750 intensitet "Threshold".
- I fanen, der indeholder indstillingerne for "Avanceret", markere "RT struktur fjernelse" og sæt "Minimum RT længde" 5 scanninger.
- I fanen, der indeholder "Avancerede" indstillinger, markere "m/z struktur fjernelse" og sæt "Minimum m/z længde" til 3 point.
- Søg efter og Tilføj aktivitet "Kromatogrammet RT justering". Tryk på aktivitet med højre museknap og åbne indstillingerne for aktiviteten.
- I fanen, der indeholder "Almindelige" indstillinger, angive "Justering Scheme" til "Parvis Alignment Base træ" og "RT Søg Interval" til 0,5 min.
- I fanen, der indeholder indstillingerne for "Avanceret", bruge standardparametre.
- Søg efter og Tilføj aktivitet "Peak opdagelse" i "Kromatogrammet" gruppe af aktiviteter. Tryk på aktivitet med højre museknap og åbne indstillingerne for aktiviteten.
- I fanen, der indeholder "Almindelige" indstillinger, skal du angive "Summation vindue" til 0,09 min, "Minimum Peak størrelse" til 0,03 min, "Maksimale flette afstand" til 5 point og "Flet strategi" til "Centre". I "Peak RT opdeling" sat box "Hul/Peak Ratio" til 50%.
- I fanen, der indeholder indstillingerne for "Avanceret", skal du angive "Udjævning vindue" til 5 point, "Forfining tærsklen" til 80% og "Konsistens tærskel" til 1. Sæt "Center beregning" som "Intensitet-vægtede" med "Intensitet tærskelværdi" på 70%.
- Søg efter og Tilføj aktivitet "Isotop klyngeopbygning" i "Kromatogrammet" gruppe af aktiviteter. Tryk på aktivitet med højre museknap og åbne indstillingerne for aktiviteten.
- I fanen angive indeholdende "Generelle" indstillinger, "RT tolerance" 0,015 min og "m/z Tolerance" til 5 ppm.
- I fanen angive indeholdende "Kuvert montering" indstillinger, "Metode" som "No figuren begrænsning" og "Ionisering" som "Protonation (til positiv tilstand) og"Deprotonation"(for negative tilstand). Indstil "Minimum og maksimum opkræve" til 1 og 4, henholdsvis.
- I fanen, der indeholder indstillingerne for "Avanceret", bruge standardparametre.
- Søg efter og Tilføj aktivitet "Singleton Filter".
- For at eksportere resultaterne af databehandling, søge efter og tilføje aktivitet "Analytiker" i "Eksportere" gruppe af aktiviteter.
- I fanen, der indeholder "Almindelige" indstillinger, skal du indstille "Type" som "Klynger" og "Observerbar" som "Opsummerede intensitet". Vælg "Brugerdefineret Destination" og Angiv mappe i eksportfilen.
- I fanen, der indeholder indstillingerne for "Avanceret", bruge standardparametre.
- Anmærke masse funktioner ved hjælp af in-house reference-sammensatte database.
- Analysere en eller flere MS grade reference-stof ved hjælp af UPLC-MS. brug samme LC-MS metoden til analyse af reference-forbindelser og metabolitter Co renset med protein af interesse.
Bemærk: For denne undersøgelse, en række næsten 300 dipeptider analyseres og bruges som reference-sammensatte bibliotek. - Brug analyse (Se Tabel af materialer) software til at åbne rå kromatogrammet fil og søge bestemte m/z og RT forbundet med målt reference-sammensatte (Se Brugervejledning).
Bemærk: Sekundære metabolitter forskellige typer af ioniserende stråling. Tjek for tilstedeværelsen af fælles adukter ved at søge efter ion masse svarende til M-1.007276, M + 1.007276, M + 18.033823 og M + 22.989218 for [M-H], [M + H], [M + NH4] og [M + Na], henholdsvis. - Brug regnearket til at åbne eksporteret "Analytiker" fil opnået efter forarbejdning af kromatogrammer og søgning efter specifikke ion masse. Sammenlign RT af funktionen masse målt i eksperimentet og RT af henvises stoffet. Tillade en afvigelse af 0,005 Da for m/z og 0,1 min. til RT.
- Analysere en eller flere MS grade reference-stof ved hjælp af UPLC-MS. brug samme LC-MS metoden til analyse af reference-forbindelser og metabolitter Co renset med protein af interesse.
- For at teste betydningen af metabolitten berigelse Co renset med bestemt protein mellem prøver (linje med overexpressed protein af interesse vs EV kontrol), sammenligne peak værdier ved hjælp af to-sidede ikke-parret t-test med efterfulgt af flere sammenligning korrektion (f.eks. Benjamini & Hochberg falsk opdagelse sats korrektion eller Bonferroni korrektion).
Representative Results
I den oprindelige undersøgelse, blev tre A. thaliana NDPK gener overexpressed i PSB-L cellekulturer suspension under kontrol af konstitutiv 35S promotor14 (figur 1). Tandem affinitet tag var smeltet til enten carboxy - eller amino-terminal ende af en agn protein. De affinitet-renset komplekser blev udsat for MTBE/methanol/vand udvinding16. Affinitet-trukket proteiner og små molekyler blev identificeret ved hjælp af MS (tabel S2 og S3).
For at korrigere for falske positiver, blev blindprøver brugt til at udelukke små-molekyle forureninger fra kemikalier og laboratorium forbrugsvarer. Desuden, metabolitter og proteiner der binder sig til enten en affinitet tag eller harpiks alene blev bogført ved hjælp af EV kontrol linjer. For at hente sand positiver, ikke-parret Tosidedes t-test og Benjamini & Hochberg falsk opdagelse sats blev korrektion anvendt til at identificere metabolitter (Tabel S4) og proteiner (Tabel S5) betydeligt beriget med NDPKs AP eksperimenter (N - og C-terminalt markeret NDPKs) i forhold til EV kontrol linjer (FDR < 0,1). Bemærk, at i det tidligere arbejde, vi brugt fravær/tilstedeværelse kriterier for at afgrænse protein og små-molekyle interactors.
Repræsentative resultater er givet til NDPK1, mens metabolit data fokus på dipeptider, en roman klasse af små-molekyle tilsynsmyndighederne undersøgt i vores gruppe. Proteom analyse afslørede 26 formodede protein partnere i NDPK1. Af yderligere filtrering for proteiner Co lokaliseret i den samme subcellulært rum som NDPK1 (cytosol), listen indsnævret ned til 13 formodede protein interactors. Blandt de identificerede proteiner var glutathion S-transferase, to brudforlængelse indledning faktorer, tubulin og aconitate hydratase. Metabolomic analyse afslørede fire dipeptider Val-Leu, Ile-Glu, Leu-Ile og Ile-Phe der specifikt Co elueret med NDPK1 (figur 2). Bemærk, at alle fire dipeptider deler en hydrofobe rester i deres N-terminus, tyder på fælles bindende specificitet.
For at lede efter kendte protein-protein og protein-metabolit komplekser vi identificerede forespurgte 13 proteiner og fire dipeptider mod Stitch database25 (figur 3). Flere observationer kunne være gjort: (i) ingen af interactors var tidligere rapporteret til NDPK1. (ii) APX1 ortholog blev rapporteret til at interagere med aldehyd dehydrogenase familiemedlem ALDH7B4, mens oversættelse indledningen faktor FBR12 med en anden oversættelse indledningen faktor kodet af genet AT2G40290. (iii) de identificerede dipeptider har ikke rapporteret protein partnere. Co elueret dipeptider blev ikke rapporteret tidligere som tilknyttet nogen hentet vegetabilske proteiner. Men de spiller vigtige roller i andre organismer: Leu-Ile, fxhar en aktivering af neurotrophin effekt i en menneskelig celle linje26. Bemærk, at eksperimentet ikke tillader, at identificere den nøjagtige topologi af systemet. For eksempel, et dipeptid kan interagere direkte med NDPK1 men kan godt være relateret til nogen af de Co renset proteiner.
Tilsammen vores resultater viser, at den fastlagte procedure, beskæftiger AP samt massespektrometri, letter identifikation af protein-protein og protein-små-molekyle interactors og hjælper generere omfattende oplysninger om de interactome af target proteinet.
Figur 1. Ordningen af AP-MS arbejdsproces. (A) forberedelse af en indfødt vandopløselige fraktion fra plante cellekultur. (B) næste trin i proceduren AP. Efter indlæsning af stikprøven på kolonnen, binder protein af interesse (POI) smeltet til en TAP tag til IgG antistof immobiliseret på Agarosen perler. Vask af kolonnen letter fjernelse af ubundne proteiner og metabolitter. Efter udførelse af AcTEV kavalergang, er POI protein-metabolit komplekser elueret. (C) adskillelse af komplekser i protein og metabolitten brøkdel efterfulgt af semi-kvantitative MS analyse. En del af denne figur er gengivet fra Luzarowski et al. 201714. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Dipeptider specielt Co eluerer med NDPK1. Gennemsnitlige intensiteter af fire dipeptider Val-Leu (A), Ile-Glu (B), Leu-Ile (C)og Ile-Phe (D) målt i AP eksperiment var afbildet. Alle fire dipeptider viser betydelig berigelse i NDPK1 prøver i forhold til EV kontrol (stjerner repræsenterer FDR < 0,1). Fejllinjer udgør standardafvigelse for 6 målinger (3 replikater af N- og 3 C-terminalt markeret proteiner). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Interaktion netværk af alle molekyler Co eluerer med NDPK1, spørges mod STITCH database overvejer kun tidligere eksperimentelle og database beviser (tillid > 0,2). Højere tillid angiver større chancer for interaktion og er beregnet på grundlag af de deponerede data. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel S1. MaxQuant output tabel "parameters.txt". Tabel omfatter tærskelværdier for identifikation og kvantificering, samt oplysninger om de databaser, som anvendes. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Tabel S2. Oplysninger fra MaxQuant output tabel "proteinGroups.txt". Tabellen indeholder en oversigt over alle identificerede protein grupper, intensiteter og yderligere oplysninger såsom antal unikke peptider og score. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Tabel S3. Outputfilen indeholder analyse af polar metabolitter. Tabel indeholder en liste over alle identificerede masse funktioner karakteriseret ved bestemte m/z, RT og intensitet. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Tabel S4. Dipeptider fundet i AP prøver, hvor NDPK1, NDPK2 eller NDPK3 blev brugt som madding. Dipeptider stede i blindprøver blev udelukket fra listen. To uafhængige rederier (markeret i enten N - eller C-terminus) for hver NDPK blev kørt i tre eksemplarer. Student's t-test og yderligere korrektion af p-værdi ved hjælp af Benjamini & Hochberg metode blev brugt til at bestemme betydeligt beriget interactor partnere af NDPKs (FDR < 0,1). Givet er ΔRT beregnet i forhold til reference forbindelser og Δppm i forhold til den monoisotopic masse givet i Metlin27. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Tabel S5. Proteiner Co renset med NDPK1. To uafhængige rederier (markeret i enten N - eller C-terminus) for hver NDPK blev kørt i tre eksemplarer. Student's t-test og yderligere korrektion af p-værdi ved hjælp af Benjamini & Hochberg metode blev brugt til at bestemme betydeligt beriget interactor partnere af NDPKs (FDR < 0,1). Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Præsenteres protokollen tillader parallelle identifikation af PP og PM komplekser af en target protein. Fra kloning til endelige resultater, kan forsøget gennemføres på så lidt som 8-12 uger. Komplet AP tager omkring 4-6 h for et sæt af prøver, 12-24, rendering vores protokol egnet til midten overførselshastighed analyse.
Protokollen, trods samlede ligetil, har en række vigtige skridt. (i) tilstrækkelig mængde af input protein og affinitet perler er afgørende for at nå frem til en dynamisk række metabolit påvisning. Effektiv celle lysis er derfor et afgørende skridt i proceduren. Dårlig protein udbyttet kan være en følge af utilstrækkelig pulverisering af materialet eller suboptimal lysis-buffer/materielle forhold. (ii) omhu bør tages, brugte reagenser er MS-venlige. Stærke rengøringsmidler, glycerol eller store mængder salt bør undgås, da de forstyrrer MS påvisning. (iii) Agarosen perler bør ikke være over tørrede under vask trin, og når du bruger et vakuum manifold er det vigtigt at anvende en langsom strømningshastighed uden at ødelægge perlerne eller påvirke komplekse stabilitet.
Der er nogle vigtige mulige ændringer i præsenteres protokollen: (i) vi bruger konstitutiv CaMV35S initiativtageren til at maksimere mængden af agn protein. Overekspression, kan mens meget nyttig, have alvorlige virkninger på celle homøostase28 og føre til dannelsen af fysiologisk irrelevant interaktioner. Udtryk for mærket proteiner ved hjælp af indfødte initiativtagere og hvor muligt i et tab af funktion baggrund skønnes superior til hentning af sande biologiske interactors. For proteiner normalt ikke til udtryk i anlægget cellekulturer, en plante baggrund kan vise sig nødvendigt at identificere relevante interactors. (ii) når du arbejder med Membranproteiner, skal lysisbuffer suppleres med en MS-kompatible vaskemiddel. (iii) indførelse af en anden affinitet-rensning fase kunne forbedre falske-positiver til sand-positiver forholdet og fjerne behovet for EV kontrol29. En roman tandem tag med to uafhængige protease-kavalergang websteder præsenterer et attraktivt alternativ til trinnet størrelse-udelukkelse kromatografi tilføjet af Maeda et al. 201411, som er både besværligt og tidskrævende.
Den mest alvorlige ulempe af AP er den høje sats af falske positiver. Årsagerne er talrige. Konstituerende overekspression blev allerede nævnt. En anden kilde til fysiologisk irrelevant interaktioner, er medmindre arbejder med isolerede organeller, forberedelsen af hele-cellelysater der indeholder blandinger af proteiner og metabolitter fra forskellige subcellulært rum. Subcellulært lokalisering bør bruges til at filtrere for sande interactors. Ikke desto mindre, skyldes størstedelen af falske positiver uspecifik bindingen mellem proteiner og Agarosen harpiks. Indførelsen af en anden rensning trin, som beskrevet ovenfor, tilbyder den bedste løsning på problemet, men kommer på bekostning af tid og overførselshastighed. Derudover kan svagere interaktion gå tabt, som protokollen forlænger. En anden advarsel af AP er, at trods de omfattende oplysninger det giver om interactome af en target protein, skelne mellem direkte og indirekte mål for den madding protein er umuligt. Målrettet bimolecular tilgange er nødvendige for at bekræfte interaktioner.
AP kombineret med MS-baseret metabolomics blev brugt til at studere proteinkomplekser i S. cerevisiae12. Dette arbejde, sammen med vores tidligere observation13 , ligeledes til lipider, polar og semi-polære forbindelser forbliver bundet til proteinkomplekser isoleret fra cellulære lysates, fastsatte præsenteres protokollen begrebsmæssige grundlag. Vores protokol er karakteriseret ved tre unikke punkter: (i) i modsætning til gæren arbejde12, det viser, at AP er egnet til hentning af ikke kun hydrofobe men også hydrofile protein ligander. (ii) ved at indføre en tre-i-én udvinding protokol, kan en enkelt AP bruges til at studere proteiner og metabolitten interactors agn protein. (iii) vi tilpasset protokol for at plante celler.
Fremtidige indsats vil fokusere på at skabe en roman tandem tag med to uafhængige protease-kavalergang websteder. Vi vil også gerne udforske egnetheden af protokollen til lav-overflod små molekyler såsom plantehormoner.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne venligst anerkende Prof. Dr. Lothar Willmitzer for hans engagement i projektet, produktive diskussioner og store tilsyn. Vi er taknemmelige for Dr. Daniel Veyel for at hjælpe med proteom MS målinger. Vi sætter pris på fru Änne Michaelis der har givet os uvurderlig teknisk hjælp med LC-MS målinger. Desuden vil vi gerne takke Dr. Monika Kosmacz og Dr. Ewelina Sokołowska for deres hjælp og engagement i arbejdet på det originale manuskript og Weronika Jasińska for teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics | Sigma-Aldrich | M6899 | |
| 1-Naphthylacetic acid | Sigma-Aldrich | N1641 | |
| Kinetin solution | Sigma-Aldrich | K3253 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| MgCl2 | Carl Roth | 2189.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
| NaF | Sigma-Aldrich | S6776 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| E-64 protease inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| AcTEV Protease | Thermo Fischer Scientific | 12575015 | |
| Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.2 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fischer Scientific | 26616 | |
| SBP Tag Antibody (SB19-C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-101595 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| MTBE | Biosolve | 138906 | |
| Methanol | Biosolve | 136806 | |
| Water | Biosolve | 232106 | |
| Acetonitrile | Biosolve | 12006 | |
| Trifluoroacetic acid | Biosolve | 202341 | |
| Formic acid | Biosolve | 69141 | |
| Unimax 2010 Platform Shaker | Heidolph | 5421002000 | |
| Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%) | Prosepa | Custom order | |
| Glass Funnel, 47 mm, 300 ml | Restek | KT953751-0000 | |
| Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St | VWR International GmbH | 514-0340 | |
| Mixer Mill MM 400 | Retsch GmbH | 207450001 | |
| IgG Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0969-02 | |
| Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters | MoBiTec GmbH | M1002 | |
| Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053 | MoBiTec GmbH | M513515 | |
| Variable Speed Tube Rotator SB 3 | Carl Roth | Y550.1 | |
| Rotary dishes for rotators SB 3 | Carl Roth | Y555.1 | |
| Resprep 24-Port SPE Manifolds | Restek | 26080 | |
| Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml | Teknokroma | TR-F034000 | |
| Autosampler Vials | Klaus Trott Chromatographie-Zubehör | 40 11 01 740 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 LC Column | Thermo Fischer Scientific | 164534 | |
| EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | Thermo Fischer Scientific | LC120 | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fischer Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Acquity UPLC system | Waters | Custom order | |
| ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg | Waters | 186003533 | |
| High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions | Bandelin | RK 31 | |
| Genedata Expressionist | Genedata | NaN | |
| Xcalibur Software | Thermo Fischer Scientific | NaN | |
| MaxQuant | NaN | NaN |
References
- Li, X., Snyder, M. Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation. Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).
- Schlattner, U., et al. Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).
- Ramírez, M. B., et al. GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2. Human Molecular Genetics. , ddx161 (2017).
- Jung, H. J., Kwon, H. J. Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery. Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).
- Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. L. A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase. Nature. 341 (6244), 758-760 (1989).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae. Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).
- Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).
- Li, X., Snyder, M. Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses. Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).
- Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -C. A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids. Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).
- Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses. Cell. 143 (4), 639-650 (2010).
- Veyel, D., et al. System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants. Scientific Reports. 7, (2017).
- Luzarowski, M., et al. Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases. Journal of Experimental Botany. , (2017).
- Van Leene, J., et al. Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana. Molecular systems biology. 6 (1), 397 (2010).
- Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using 13C, 15N and 34S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).
- Van Leene, J., et al. Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).
- Van Leene, J., et al. A tandem affinity purification-based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (7), 1226-1238 (2007).
- Olsen, J. V., Ong, S. -E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular & Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301 (2016).
- Hooper, C. M., et al. SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome. Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).
- Katajamaa, M., Orešič, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Szklarczyk, D., et al. STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data. Nucleic Acids Research. 1277, (2015).
- Tanaka, K. -i, et al. Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells. Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).
- Smith, C. A., et al. METLIN: A metabolite mass spectral database. Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).
- Bhattacharyya, S., et al. Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity. Elife. 5, (2016).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
