Summary
GlmSを生成する手法について述べる-熱帯熱マラリア原虫CRISPR/Cas9 ゲノム編集を使用して条件付きノックダウン変異体を用いた。
Abstract
マラリア罹患率と死亡率の世界の重要な原因であります。主に熱帯および亜熱帯地域に住んでいる人に影響を与える、この病気は、原虫の感染が原因です。マラリアと闘うためにより効果的な薬の開発は、この複雑な寄生虫の生物学の私達の理解を改善することによって加速することができます。これらの寄生虫の遺伝子操作の生物学を理解する鍵は、します。しかし、歴史的にマラリアのゲノムが難しかった操作します。最近では、容易に蛋白質のタグ付け、条件付きタンパク質ノックダウンの発生と遺伝子の削除を可能にするマラリア原虫に CRISPR/Cas9 ゲノム編集を利用されています。CRISPR/Cas9 ゲノム編集はマラリア研究の分野を進めるための強力なツールであると証明しました。ここで、 glmSを生成するための CRISPR/Cas9 手法について述べる-基づくマラリアでノックダウン変異体条件付き。このメソッドは、適応性の高いタンパク質タグを含む、遺伝子操作、遺伝子のノックアウトの他のタイプです。
Introduction
マラリアは、マラリア原虫属原虫によって引き起こされる壊滅的な病気です。マラリア、ほとんど致命的な人間のマラリア原虫の 51歳未満の子供を中心に、年間約 445,000 死亡を原因します。原虫媒介蚊と脊椎動物のホストを含む複雑なライフ サイクルがあります。人間最初に感染感染した蚊は吸血します。その後、寄生虫はどこに成長、成長して約 1 週間分割肝を侵入します。このプロセスの後、寄生虫は赤い血球 (赤血球) の無性複製を受ける血流に解放されます。赤血球内寄生虫の成長はマラリア2に関連付けられている臨床症状の直接責任があります。
最近まで、トランスジェニックマラリアの生産は、何ヶ月かかったし、高い故障率があった医薬品の選択のいくつかのラウンドを含む、骨の折れるプロセスをだった。この時間のかかる手順 relieson 関心領域とそのゲノムをも修復する寄生虫の内因性の能力ランダム DNA の世代改相同修理3,4,5,6.最近では、クラスター化された定期的に空間回文繰り返し/Cas9 (CRISPR/Cas9) ゲノム編集活用されている正常にマラリア7,8。マラリア研究のこの新しい技術の導入は、これらの致命的な原虫の生物学の理解を進めるために重要されています。CRISPR/Cas9 ガイド Rna (gRNAs) 興味の遺伝子に相同性のある遺伝子の特定の目標が可能です。GRNA/Cas9 複雑な認識、gRNA、遺伝子、Cas9 は、生物9,10の修復メカニズムの開始を強制二重鎖切断を紹介します。マラリア非相同末端結合を介して DNA 切断修復する機械に欠けている、のでそれは相同組換え機構を利用し、Cas9/gRNA 誘導を修復する transfected 相同 DNA テンプレートを統合二重鎖切断11,12。
ここでは、プロトコルを提案マラリアでノックダウン変異体条件の世代の CRISPR/Cas9 ゲノム編集を使用しています。PfHsp70x の条件付きでノックダウン蛋白質のレベルにglmSリボザイムの使用するプロトコルを示します (PF3D7_0831700)、シャペロンによってエクスポートされたマラリアのホストに赤血球13,14。GlmSリボザイムはグルコサミン (これは細胞のグルコサミン-6-リン酸に変換する) 処理によるタンパク質14の削減につながる、その関連付けられている mRNA を切断するアクティブになります。このプロトコルは、不安定化ドメインまたは RNA アプタマー4,5,15などの他の条件のノックダウン ツールを活用する簡単に適合できます。我々 のプロトコルの詳細コーディング シーケンス シーケンスが並ぶヘマグルチニン (HA) タグとglmSリボザイムから成る修理プラスミドの世代のある PfHsp70x オープンリーディング フレーム (ORF) と 3' UTR に相同性です。ドライブ式、gRNA の 2 番目のプラスミッドの世代についても述べる。これら 2 種のプラスミド、Cas9 の式を駆動する第三と一緒に、赤血球にトランスフェクションし、マラリア寄生虫のゲノムを変更するために使用します。最後に、我々 はポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を記述する-ベース タグとglmSリボザイムの統合を確認する手法です。このプロトコルは、変更または強化してマラリア原虫の生物学に新しい洞察力を生成する任意のマラリア遺伝子の完全なノックアウトの小回りです。
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Protocol
マラリアの連続培養ひと赤血球の使用を必要とし、我々 は血のすべての識別子を剥奪され、匿名の市販購入したユニットを利用します。制度検討委員会とジョージア大学でバイオ セーフティ オフィス私達のプロトコルを見直し、私たちの研究室で使用されているすべてのプロトコルを承認しました。
1. gRNA シーケンスを選択します。
- CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) に移動し、 'Fasta ターゲット'を選択します。[ 'ターゲット'のオープンリーディング フレーム (ORF) 遺伝子の 3' 末端から 200 塩基対、遺伝子の 3' UTR の開始から 200 塩基対を貼り付けます。'' で、 'マラリア'を選択 (3 7 v3.0)、 '使用'下'CRISPR/Cas9'を選択します。次に、 「検索対象サイト」をクリックします。
- 最も効率的な gRNA に変更されたサイトに最も近い、最小限のオフのターゲット サイトを優先表示されたオプションから gRNA シーケンスを選択します。
注: 彼らがすぐ上流の Protospacer 隣接するモチーフ (PAM)、dna Cas9 の募集に必要なために、潜在的な gRNA のシーケンスが識別されます。PMK U6、ドライブの gRNA 式、ベクトルにクローンが作成される順序が 20 拠点、PAM のすぐ上流。S. 化膿Cas9 の特定の PAM 塩基 NGG は、pMK U6 にクローンが作成される順番は含めない.
注: CHOPCHOP 視覚的にランク付けする gRNA シーケンス、グリーン、アンバーの少ない理想的なオプションおよび赤で最悪のオプションで最高のオプションを表示します。CHOPCHOP は、各 gRNA シーケンスの文献で見つけた最新のパラメーターを使用して計算される効率スコアを与えるし、彼らは、gRNA によって認識される可能性がありますオフのターゲット サイトを予測します。2 つまたは 3 つの gRNA シーケンスは、特定の遺伝子に適した最高の gRNA を見つけるしようとする必要があります。 - GRNA シーケンスとその逆の補数をポリアクリルアミドゲル電気泳動精製 oligos として購入します。図 1 bに PfHSP70x のターゲットに使用される gRNA シーケンスを見つけることができます。
注: このオリゴの 15 塩基相同性の高い gRNA を表現するプラスミッド シーケンスと結紮独立 pMK U6 ベクトル16へ (SLIC) のクローニングに必要なを含める必要があります。
2. gRNA pMK U6 にシーケンスをクローン作成
-
BtgZI と pMK U6 を消化します。
- BtgZI 酵素 (5,000 単位/ml) 60 ° C で 3 時間の 5 μ L を持つ pMK U6 のダイジェスト 10 μ g反応条件の酵素メーカーのプロトコルに従ってください。
- 3 h の潜伏期間後プラスミッドの完全な消化力を確保するため反応に BtgZI の追加の 3 μ L を追加します。まだ正しい反応条件を確保するための製造元の指示に従う、さらに 3 時間のダイジェストします。
- 反応から消化 pMK U6 を浄化、製造元の指示に従って列に基づく PCR クリーンアップのキットを使用します。
- 0.7% アガロースゲルを用いた消化の DNA を分離・ 4,200 塩基対バンドを抽出します。
-
GRNA シーケンスを含む oligos をアニールします。
- ヌクレアーゼ フリー水を使用して 100 μ M の濃度にページ精製 oligos を再構成します。
- 各オリゴの 10 μ L を組み合わせてを 2.2 μ 10 x バッファー 2 (材料の表を参照してください)。全反応ボリュームが 22.2 μ L であることを確認します。
- 焼鈍、たちのプログラム gRNA を実行: ステップ 1:95 ° C、10 分。ステップ 2:95 ° C、1 秒、0.6 の温度の低下と ° C/サイクル;ステップ 3: 16 回ステップ 2 に行くステップ 4:85 ° C、1 分。ステップ 5:85 ° C、1 秒、0.6 ° C/サイクルの温度の低下とステップ 6: ステップ 5 へ 16 回ステップ 7:75 ° C、1 分。ステップ 8:75 ° C、1 秒、0.6 の温度の低下と ° C/サイクル;ステップ 9: 16 回ステップ 8 に行きます。手順 10 に 21: 手順 4-9 で使用温度が 25 ° C に達するまで手順を繰り返しますステップ 22:25 ° C、1 分。
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軟 gRNA oligos を BtgZI 消化され、ゲル精製 pMK U6 プラスミドに挿入します。
- 軟 gRNA oligos のバッファー 2.1 と 3 μ L x 10 の 1 μ L と消化 pMK U6 の組み合わせ 100 ng。ヌクレアーゼ フリー水の 9.5 μ L にボリュームを上げます。
- T4 ポリメラーゼの 0.5 μ L を追加し、2.5 分間室温で反応を孵化させなさい。
- 氷し、10 分間インキュベートする反応を移動します。
- すぐに有能なエシェリヒア属大腸菌細菌供給業者の指示に従ってに反応の 5 μ L を変換します。100 μ g/mL アンピシリンを含むホストゲノム スープ (LB) 寒天版の細菌をプレートします。
- 変換された細菌が一晩、37 ° C で成長のコロニーを選択し市販のプラスミド miniprep キットで DNA を抽出できます。
3. 修理テンプレートの相同領域の設計
-
ゲノムに統合されている DNA の切断を防ぐために相同性修復テンプレート内で設計シールド変異。
注: シールドの突然変異は通常 Cas9 はない修理テンプレートで休憩を誘発するように PAM を変更するサイレント突然変異を導入することので構成されます。このプロトコルで使用される Cas9 は「NGG」、場所"N"は、ヌクレオチド塩基 PAM に必要な。可能であれば、A、C、または t. G ヌクレオチドのいずれかを変更します。- PAM が静かに変異することはできない場合は、PAM7、8に隣接 6 塩基対にサイレント突然変異を少なくとも 2 をご紹介します。
注: これらの突然変異は、gRNA によって修理のテンプレートの認識を防止し、再 Cas9/gRNA で修復した軌跡の複雑な切断を防ぐため。シールドの突然変異は、突然変異を含むプライマーと DNA を増幅することによって相同領域に導入できます。
- PAM が静かに変異することはできない場合は、PAM7、8に隣接 6 塩基対にサイレント突然変異を少なくとも 2 をご紹介します。
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修理テンプレートの ORF の相同領域を増幅します。
- PCR を使用して、ターゲット遺伝子の ORF の 3' 末端から 800 塩基対を増幅します。この私アンプリコンから停止コドンを除外に使用するプライマーを設計します。
- PHA-glmS DNA の ligation の反作用または SLIC16を介して SacII と AfeI が消化されたことにこの私アンプリコンの挿入のためのプライマーを設計します。
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修理テンプレートの 3' UTR の相同領域を増幅します。
- PCR を使用して、目的の遺伝子の終止コドンの直後 800 塩基対を増幅します。PHA-glmS DNA の ligation の反作用または SLIC16を通じて HindIII と NheI が消化されたことにこの私アンプリコンの挿入のためのプライマーを設計します。
注: P. 熱帯熱マラリア原虫ゲノムの内容で高、UTRs などの領域の増幅困難。PCR を使用してへの代替アプローチは、相同領域を合成です。
- PCR を使用して、目的の遺伝子の終止コドンの直後 800 塩基対を増幅します。PHA-glmS DNA の ligation の反作用または SLIC16を通じて HindIII と NheI が消化されたことにこの私アンプリコンの挿入のためのプライマーを設計します。
4. 修理プラスミッドへ相同領域のクローニング
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PHA のglmSORF 相同領域に挿入します。
- 酵素の製造元の指示に従って、pHA-glmS SacII と AfeI を消化します。SLIC16を使用して消化のプラスミッドに ORF 相同領域の PCR の製品を挿入します。
- 2.3.4 および 2.3.5 のステップで実行、有能なエシェリヒア属大腸菌に変換します。
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3' UTR の相同領域を挿入 ORF 相同領域を既に含む pHA glmS プラスミド (手順 4.1 を参照してください)。
- 酵素の製造元の指示に従って、HindIII と NheI が付いているプラスミッドを消化します。3' UTR の相同領域の増幅を SLIC16を使用して消化のプラスミドに挿入します。
- 有能なエシェリヒア属大腸菌に変換し、プラスミド DNA (手順 2.3.4 および 2.3.5) を抽出します。
5. Transfection のため DNA を沈殿させます。
- PMK U6、pUF1-Cas9、pHAglmS (DNA の 120 μ g の合計) のための DNA を滅菌 1.5 mL 容マイクロ チューブのそれぞれの 40 μ g を追加します。
- 1/10 を追加管へ水 (pH 5.2) での 3 M 酢酸ナトリウムの DNA 量とも渦を使って混ぜる場合手順 5.1 で量は 100 μ L の追加など酢酸ナトリウムの 10 μ L)。
- 管に 2.5 倍量の 100% エタノールを追加し、まあ少なくとも 30 渦を使用してそれをミックス s (例えば5.1 でボリューム 100 μ L であった場合追加 100% エタノールの 250 μ L)。
- 氷の上または-20 ° C で 30 分間でチューブを配置します。
- 4 ° C で 30 分間 18,300 x gでチューブを遠心分離します。
- チューブから上澄みを慎重に取り外します。ペレットが不可でした。
- チューブに 3 回 70% のエタノールのボリュームを追加し、簡単に渦を使用してそれをミックス (e.g。 5.1 ボリューム 100 μ l であった場合、70% のエタノールの 300 μ l を追加)。
- 4 ° C で 30 分間 18,300 x gでチューブを遠心分離します。
注: この手順は、生物学的安全キャビネットで無菌条件の下で実行する必要があります。 - チューブから上澄みを慎重に取り外します。ペレットが不可でした。チューブを開いたままにして 15 分の風乾にペレットを許可します。
- Transfection のため必要になるまでは、-20 ° C で沈殿した DNA を格納します。
6. Transfection のために備えて全血から人間の赤血球を分離します。
- 滅菌 50 mL コニカル チューブ (管あたり約 25 mL) に新鮮な血液を分注。
- 1,088 x g 、12 分間でチューブを遠心分離機、遠心ブレーキが 4 に設定。
- 上澄みとバフィー コートを離れて吸い出しなさい。不完全な RPMI の等量と赤血球ペレットを再懸濁します。
メモ: 不完全な RPMI は 10.32 μ M チミジン、110.2 μ M ヒポキサンチン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム 30 mM、5 mM HEPES、11.1 mM グルコース、0.02% (v/v) ゲンタマイシンを RPMI 1640 で補うことによって準備されます。 - 6.2-6.3 の手順を 2 回繰り返します。最後の洗浄後、不完全な RPMI の等量で赤血球を再懸濁します、4 ° C でチューブを格納
7 CRISPR/Cas9 プラスミドを株赤血球 (無菌行われる) する
注:マラリア文化は他のレポート17で説明されているように維持されます。特に明記しない限りは、3% O23% の CO294% N2下 37 ° C ですべての文化を維持します。血をこのプロトコルで使用するたびに、手順 6 で作製した純粋な赤の血液細胞を参照です。血の使用は、古い血の寄生虫の増殖の減少は通常 6 週間以上経過しないでください。次の手順は、DNA と transfected セルに寄生虫文化を追加する荷重の赤血球をについて説明します。他の確立されたトランスフェクション プロトコルは、これら構造18,19株と互換性が。
- 水 (120 mM KCl、0.15 mM CaCl2、グリコールエーテルジアミン四酢酸、2 mM 5 mM MgCl2, 10 ミリメートル K2HPO4、25 mM HEPES、pH 7.6) の 1 x cytomix バッファーを準備します。0.22 μ m のフィルターを使用してバッファーをフィルター滅菌します。
- 380 μ L の DNA に 1 x cytomix の沈殿のための手順で 5、溶解する渦を追加します。10 分、ボルテックス 10 のすべての 3 分の 1 x cytomix で分解する DNA を許可する s。
- 滅菌 15 mL の円錐管に結合赤血球の 300 μ L (50% ヘマトクリット値、手順 6 から) 4 ml × 1 cytomix の不完全な RPMI で。
- 870 x g 、3 分間でステップ 7.3 から赤血球を遠心し、赤血球ペレットから上澄みを除去します。
- 手順 6.2 から DNA/cytomix 混合物による赤血球ペレットと 0.2 cm エレクトロポレーション キュベットへの転送を再懸濁します。
- Electroporate 次の条件を使用して赤血球: 0.32 kV, 925 μ F,「高キャップ」と抵抗する設定容量を「無限」に設定します。
- エレクトロポレーション、以下完全 RPMI (cRPMI) 15 mL コニカル含む 5 mL にキュベットから内容を転送します。870 x g 20 ° C で 3 分間でチューブを遠心し、上清をデカントします。
注: cRPMI は、0.25% (w/v) 脂質豊富なウシ血清アルブミンを添加した不完全な RPMI と同じ方法を用意しています。 - CRPMI と 6 も組織培養プレートの 1 つの井戸への転送の 4 mL にペレットを再懸濁します。高シゾント文化の 400 μ L を追加 (7-10% シゾント寄生率が理想的です) transfected 赤血球へ。
注: 寄生率は、寄生虫に感染した赤血球の割合として定義されます。 - 次の日は洗って 4 ml cRPMI の文化です。3 分間 870 x g で文化を遠心し、上清を吸引します。CRPMI 4 mL に文化を再懸濁します。
- 7.6 の手順を完了した後 48 時間は洗って 4 ml cRPMI の文化です。1 μ M を含む cRPMI の文化を再懸濁します DSM1 Cas9 プラスミドを選択します。
-
寄生虫が血液塗抹標本では表示されなくなるまで、文化を cRPMI と毎日洗浄を続けます。これ以降、新鮮な cRPMI プラス 1 μ M で培養培地を置き換えます DSM1 すべて 48 時間。
- 血の中傷をするためには、0.6 mL の遠心管に文化の 150 μ L をピペットします。30 1,700 × gで遠心分離によって細胞をペレット s。
- 上清を離れて吸い出しなさい。小球形にされた細胞をスライド ガラスに転送するのにには、ピペットを使用します。2 番目の最初のスライドに 45 ° の角度で握られるガラス スライドを使用して、血しぶきを汚れ。製造元のプロトコルによると市販染色キットを使用してスライドを染色します。
- 油浸対物レンズ × 100 を使用して寄生虫を表示します。
- 5 日から始まる後トランスフェクション (ステップ 7.6) は培養培地で再停止される赤血球と文化の 2 mL を削除します。新鮮な媒体のバック 2 mL を追加 (cRPMI 1 μ M プラス DSM1) と 2% ヘマトクリット血。新鮮な血液この方法で追加まで週寄生虫が再現したら薄い血液塗抹標本 (ステップ 7.11) によって決定されます。
注: 統合が成功した場合、寄生虫一般的で再現されます文化 1 ヶ月後トランスフェクションによって。 - 一度寄生虫は再び姿を現す、DSM1 薬剤圧を削除します。また、寄生虫がクローンされた後薬剤圧を削除します。
8. 修理テンプレートの統合のための寄生虫のチェック
- 寄生虫は薄い血液塗抹標本によって再度表示されている場合は、適切なキットを使用して文化から DNA を分離します。
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ターゲットの軌跡が正常に変更された場合、変更されていない野生型の軌跡 (野生型原虫の指標) が検出可能な場合を決定するのにゲノムの変更された領域を増幅するのに PCR を使用します。
- 修理テンプレートを統合している寄生虫が検出、ORF、クローンとして作成された相同領域の外側の先頭に座って前方のプライマーを使用します。3' UTR に座って逆プライマーを使用します。
注: この増幅には、HA タグとglmSリボザイムのシーケンスが含まれています, と統合された寄生虫から amplicons が野生型寄生虫で増幅される同じ領域よりも長くなります。
- 修理テンプレートを統合している寄生虫が検出、ORF、クローンとして作成された相同領域の外側の先頭に座って前方のプライマーを使用します。3' UTR に座って逆プライマーを使用します。
9. 限界希釈による寄生虫のクローニング
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ステップ 0.5 寄生虫/200 μ L の最終的な集中を達成するために 7.13 から寄生虫文化のシリアル希薄を実行します。96-well ティッシュの培養皿の井戸に希釈した文化の 200 μ L を追加します。
注: ので、寄生率は感染した赤血球の割合として定義され、ヘマトクリット値は、定義された番号 (2%)、単位体積あたりの寄生虫の数が簡単に推論されます。- 5% の寄生率と 2% のヘマトクリット値で cRPMI で文化の 1 mL を準備 (これらの寄生率とヘマトクリットのレベルで文化は 1 × 107寄生虫/mL を含む)。
- CRPMI ではこの文化の 1: 100 を希釈します。CRPMI と 1: 100 を希釈再び。
- 1: 400 を希釈します。この希釈を実行するには、25 mL cRPMI、血液 1 mL に文化の 62.5 μ L を追加します。この希釈 0.5 寄生虫/200 μ L の望ましい集中で起因します。
-
井戸に寄生虫が検出されるまで、クローンのプレートを維持します。
- すべての 48 h は、新鮮な媒体で 96 ウェル プレートで媒体を置き換えます。
- 週に一度、クローニング プレート (ステップ 9.1) の初めの後の 5 日を開始、各ウェルから 100 μ L を削除し、血 (2% のヘマトクリット値) + 新鮮な媒体のバック 100 μ L を追加します。
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寄生虫を含む任意の井戸を識別します。
- 96 ウェル プレートをプレート内の角度で解決する血を許可する約 20 分の 45 ° の角度で配置します。
- 96 ウェル プレートをライト ボックスに配置します。寄生虫を含む井戸が寄生虫による媒体の酸性化のための無料の寄生虫の井戸のピンクのメディアと比較して、色は黄色ですメディアを含むことに注意してください。
- 血清ピペットを使用して、24 ウェル培養プレート、寄生率の拡張を可能にする寄生虫を含む井戸の内容を移動します。
- 手順 8 で説明されているように PCR 解析を使用して、正しい統合のためこれらのクローンの寄生虫の行を確認します。
10. グルコサミンと西部のしみの分析による確認で寄生虫の治療によるタンパク質のノックダウン
- -20 ° C で保存することができます 0.5 M GlcN (グルコサミン) ストック溶液を調製します。
- GlmS寄生虫文化に GlcN を追加し、GlcN の存在下で成長できるように。
注: 最終濃度と GlcN 治療のタイミングは、実験と寄生虫のラインに依存します。親の寄生虫のひずみは、化合物への感度を決定する GlcN の範囲の濃度にさらされるべきであるので、GlcN は寄生虫の成長に影響します。多くの場合、2.0 7.5 mM GlcN の濃度は使用される13,14,20です。 - GlcN 治療寄生虫13からの蛋白質のサンプルを分離します。
-
西部のしみの分析のための試料を使って蛋白質13の削減を検出します。
- 製造元の指示に従って抗 HA 抗体を使用すると、タグ付き glmS の HA 蛋白質を検出できます。PfEF1α などの荷重コントロールに HA バンドを比較します。
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Representative Results
シールドの突然変異の例と同様、このメソッドで使用されるプラスミドの模式図は、図 1のとおりです。トランスフェクション後突然変異体の寄生虫を識別する方法の例として図 2に HAglmSコンストラクトの統合をチェックするため Pcr の結果が表示されます。クローン板の代表的な画像は、寄生虫の存在下で培地の色の変化を示すため、図 3に示すが。蛍光抗体法と西部のしみが付く実験からの結果は、HA タグとglmSの機能を示す図 4に示す-寄生虫の蛋白質の削減をしました。図 5は、寄生虫のゲノムを変更し、実行可能な突然変異体を取得する PCR の製品の短いホモロジー腕の無力を示しています。
図 1: CRISPR/Cas9 と gRNA オリゴとシールドの突然変異の例を 3 つプラスミド取り組みの概要。クローニングに使用制限の酵素のサイトと空 pHA glmS と pMK U6 の (A) の回路図が表示されます。また示されている pHA glmS と pMK U6 ホモロジー腕後、gRNA シーケンスは、それぞれ、それらにクローニングされています。最後に、pUF1 Cas9 が表示されます。yDHOD 酵母ジヒドロ葉酸還元酵素、DSM1 に抵抗性マーカーを =。前方の oligo pMK U6 に PfHsp70x gRNA シーケンスをクローン作成に使用が表示されます、(B) で大文字と小文字 (top) のクローニングに必要な pMK U6 ホモロジー腕 gRNA シーケンスを持つ。PfHsp70x gRNA のゲノムのターゲットは、赤 (中央) で、下流の PAM として表示されます。PfHsp70x gRNA PAM のシールドの突然変異は、赤 (下) に表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: CRISPR/Cas9 ゲノム修正 pHA glmS と戦略を使用して統合を確認するためのスケマティック。(A) Cas9、genomic 位置を gRNA に導かれる DNA の二重鎖切断を誘導します。寄生虫は、ダブル クロス オーバー相同修理、pHA glmS プラスミドをテンプレートとして使用し、HA glmS シーケンスのゲノムに導入によって破損を修復します。(B) A PCR を HA glmS シーケンスの正しい統合を識別するためにテストします。P1 と P2 のプライマーを用いて、3' ORF 野生型 PfHsp70x と PfHsp70x -glmS変異体の増幅された13。PfHsp70x glmS から増幅バンドがより長い HA glmS シーケンスの挿入による野生型。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 96 ウェル クローン プレートで寄生虫を含む井戸の識別。96 ウェル プレートは、プレートの角度で解決する血を許可する約 20 分の 45 ° の角度でセットです (A)。(B) 左側もには右側も寄生虫フリー ピンクの媒体と比較して中の黄色の色によって示される寄生虫文化が含まれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 蛍光抗体法 PfHsp70x の正しいな HA タグ、グルコサミンによる治療中に PfHsp70x 蛋白質のレベルの減少を示しています西部にしみが付くこと.(A) PfHsp70x -glmS寄生虫は固定され、DAPI (核マーカー) とハと MAHRP1 に対する抗体で染色 (膜関連するヒスチジン豊富な蛋白質 1、赤血球にタンパク質マーカー)13。(B) PfHsp70x -glmS寄生虫が 7.5 mM グルコサミンと扱われた、全体寄生虫 lysates はウエスタンブロット解析13に使用されました。膜は HA の PfEF1α 抗体を読み込んで制御13がプローブされます。予想通り、グルコサミン治療は蛋白質の減少で起因しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 修理のため短い相同性シーケンスを使用します。(A) B7 寄生虫21で GFP の模式図を示すのノックアウト。B7 の寄生虫は、プラスメプシン II を GFP をタグ付けされた 3 7 の誘導体です。PUF1-Cas9-eGFP-gRNA と一緒に 50、75、または GFP 相同領域 (ラベルは「マーカー」)、ブラストサイジン S 耐カセット側面の 100 塩基対を含む PCR の製品、Cas9、GFP gRNA を発現プラスミドは B7 寄生虫に導入させた。各トランスフェクションが 2 回実施されました。DSM1 薬物圧力は応用 2 日後トランスフェクションだった(B) 表示ここでは、transfected 寄生虫遺伝子導入 5 日後、2 ヶ月後トランスフェクションから分離された DNA の PCR テストです。BSD 抵抗カセットの統合のテストに使用されるプライマーは B7 親寄生 584 塩基対商品とマーカーを統合している寄生虫の 2020 塩基対商品になります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
マラリアに CRISPR/Cas9 の実装が両方の効率を高め、寄生虫のゲノム、遺伝子操作の以前の方法と比較してを変更するために必要な時間の量を減少します。この包括的なプロトコルでは、マラリアに CRISPR/Cas9 を使用して条件付き変異体を生成するために必要な手順について説明します。ここにメソッドは、具体的には HAglmS変異体の世代向け、この戦略多様なニーズ、遺伝子、遺伝子ノックアウトおよび点突然変異の導入へのタグ付けを含むために適応させることができます。
このプロトコルの重要な初期ステップは gRNA シーケンスの選択です。ときに、gRNA を選択すると、gRNA が座っている、どのように効率的なだ、オフターゲット効果の可能性があるかどうかなどを検討するいくつかのポイントがあります。GRNA シーケンスは変更、理想的には 200 塩基以内のサイトにできるだけ近くする必要があります。修理テンプレートを使ってタグを統合せずにそのゲノムを解決する寄生虫の可能性を減らします。ここで、gRNA を検索するためのツールだった CHOPCHOP22と呼ばれる無料のオンライン サービスです。別のオンライン ツール、真核生物病原体 CRISPR ガイド RNA ・ DNA デザイン ツール (EuPaGDT; http://grna.ctegd.uga.edu/)、23使用することができます。EuPaGDT は、ターゲットをヒットし、gRNA の転写を妨げる可能性のある潜在的な問題の予測を含む、gRNA シーケンスの追加特性を提供します。EuPaGDT 複数の遺伝子やゲノム全体を対象とする gRNAs のバッチ処理のためのツールがあります。選択した gRNA は、最高の効率と最小のターゲットをヒットに変更されたサイトに近いに位置して 1 つにする必要があります。生じる CRISPR/Cas9 遺伝子の編集の重要な制限事項は、興味の遺伝子をターゲットに適切な gRNA をデザインすることができないことです。このような場合は、試行錯誤のアプローチを必要と可能性があります、最高のオプションが見つかるまでに複数のサブ最適な gRNA シーケンスを使用して、巧妙な遺伝子編集が発生しました。
CRISPR/Cas9 を使用してマラリア変異体を生成するときに考慮する別の重要な要因は、修理テンプレートで使用される相同領域の長さです。このプロトコルでは、相同領域は約 800 塩基対、それぞれをする必要がありますが、我々 はまた 500 塩基対3の番号より小さい領域の使用に成功しているをお勧めします。PCR の製品に CRISPR/Cas9 と相同性を短い腕を使用して成功したゲノム修正は、トキソ プラズマ、トリコモナスの24,25.など他の原虫で使用されています。ブラストサイジン抵抗カセット21を使用して B7 寄生虫でノックアウト GFP を試みることによって PCR の製品 (50、75、100 塩基対) の小さいホモロジー腕を使用しての可能性をテストしました。5 日ポスト トランスフェクション; でブラストサイジン抵抗カセットのいくつかの統合を見ましたしかし、これらの寄生虫は、トランスフェクションから決して回復しました。これらの transfections の DSM1 を使用して Cas9 を表現するプラスミッドのため選びました。単独で、または組み合わせて DSM1、ブラストサイジン S と transfected 文化の治療などの別の選択方法は、寄生虫と Cas9/gRNA 誘起改を修理するため短い相同領域を使用して再表示のチャンスを改善可能性があります。この場合、短いホモロジー腕をゲノム、タンパク質がタグ付けされている場合などに薬物耐性カセットは統合されていないインスタンスで使用できる場合をテストしたいのでブラストサイジン S で選択しなかった私たち。
CRISPR/Cas9 遺伝子の編集のコア コンポーネントには、Cas9 エンドヌクレアーゼ、gRNA、修理テンプレート、説明。寄生虫、Cas9、gRNA、および修理テンプレート別のプラスミッドの場所にこれらのコンポーネントを導入する 3 プラスミド アプローチについて述べる。このアプローチに加えて私たちの研究室は、Cas9 と gRNA 式は、単一のプラスミッドによって駆動され、修復テンプレートは、2 番目のプラスミド3「2 プラスミド アプローチを使用して成功います。2 プラスミドの同様のアプローチも採用されている正常に他の実験室によって変異体7,8,26,27,28,29を生成します。さらに、いくつかのラボは、マラリア原虫(NF54attB) Cas9 と gRNAs30ドライブ式に T7 RNA ポリメラーゼを恒常言いあらわしたのひずみを使用しています。この場合、修理のテンプレートと、gRNA を含む単一のプラスミドは NF54attB寄生虫31,32に導入しました。最後に、よく33として、ゲノムに突然変異を挿入する精製 Cas9 gRNA リボヌクレオタンパク質複合を利用したプラスミド無料アプローチが使用されています。これらの異なるアプローチの成功は、研究者が寄生虫に Cas9/gRNA コンポーネントを導入することができる方法の柔軟性を示しています。
最後に、transfected 寄生虫に適用する薬剤圧の選択に応じて変更できます、使用される構造。一過性寄生虫の再現まで DSM1 を使用して Cas9 を表現するプラスミッドのため選択して突然変異体の発生の成功を紹介します。人間のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子に置き換えられましたpfhsp70x PfHsp70x ノックアウト寄生虫を生成して寄生虫は、WR9921013を使用してそれから選ばれました。最近、説明 TetR PfDOZI ノックダウン方式はブラストサイジン S15,31を使用して寄生虫を選択できるブラストサイジン S の抵抗性遺伝子を含むプラスミドの統合に依存します。
全体的に、マラリア研究の強力なツールであると証明 CRISPR/Cas9 遺伝子はマラリアの編集が、ここのプロトコル詳細条件ノックダウン変異体3,7、8を生成する方法,13,20,28します。 このプロトコルは、個々 の研究の興味に適合性の高い。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
PUF1 Cas9 と pL6 プラスミドを共有、技術支援のためジョージアの大学 (UGA) 生体顕微鏡コア Muthugapatti Kandasamy とホセ フアン ・ ロペス ・ ルビオ監督に感謝します。この作品は v. m. v. m.、および米国国立衛生ダイム財団 (バジル ・ オコナー スターター学者研究賞) の 3 月から助成金に UGA スタートアップ資金を付与円弧財団賞 D.W.C. と H.M.K.、によって支えられた (R00AI099156 とR01AI130139) 参加して (T32AI060546) H.M.K. に
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
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