Summary
Vi beskriver en metod för att skapa glmS-baserat villkorlig knockdown mutanter i Plasmodiumfalciparum använder CRISPR/Cas9 gen editering.
Abstract
Malaria är en betydande orsak till sjuklighet och dödlighet i hela världen. Denna sjukdom, som främst drabbar dem som lever i tropiska och subtropiska regioner, orsakas av infektion med Plasmodium parasiter. Utvecklingen av mer effektiva läkemedel för att bekämpa malaria kan påskyndas genom att förbättra vår förståelse av biologi av denna komplexa parasit. Genmanipulation av dessa parasiter är nyckeln till att förstå deras biologi; men har historiskt genomet hos P. falciparum varit svårt att manipulera. CRISPR/Cas9 gen editering har nyligen använts i malaria parasiterna, vilket möjliggör enklare protein taggning, generation av villkorlig protein knockdowns och radering av gener. CRISPR/Cas9 gen editering har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att främja malaria forskning. Här, vi beskriver en CRISPR/Cas9 metod för att skapa glmS-baserat villkorlig knockdown mutanter i P. falciparum. Denna metod är mycket anpassningsbar till andra typer av genetiska manipulationer, inklusive protein taggning och gen knockouts.
Introduction
Malaria är en förödande sjukdom orsakad av urdjursparasiter av släktet Plasmodium. P. falciparum, de flesta dödliga mänskliga malariaparasiten, orsakar cirka 445,000 dödsfall per år, mestadels i barn under fem1år. Plasmodium parasiter har en intrikat livscykel som innefattar en mygga vektor och en vertebrate värd. Människor smittas först när en infekterad mygga tar en blodmjöl. Parasiten invaderar sedan levern där den växer, utvecklas och delar för cirka en vecka. Efter denna process släpps parasiterna ut i blodomloppet, där de genomgår asexuell replikering i röda blodkroppar (RBC). Tillväxt av parasiter inom de röda blodkropparna är direkt ansvariga för kliniska symptom i samband med malaria2.
Tills nyligen var produktionen av transgena P. falciparum en mödosam process, som involverar flera omgångar av drogen urval som tog många månader och hade en hög felfrekvens. Detta tidsödande förfarande relieson bryter generering av slumpmässiga DNA i regionen av intresse och parasiten endogena förmåga att laga sin arvsmassa men homologa reparation3,4,5,6 . Nyligen, klustrade regelbundet mellanliggande Palindromic Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) gen editering har framgångsrikt använts i P. falciparum7,8. Införandet av denna nya teknik i malaria forskning har varit avgörande för avancerad förståelse av biologi av dessa dödliga parasiter Plasmodium . CRISPR/Cas9 möjliggör specifik inriktning av gener genom guide RNAs (gRNAs) som är homolog till genen av intresse. Den gärna/Cas9 komplexa erkänner genen genom gärna och Cas9 sedan introducerar en dubbel-strand paus, tvingar inledandet av reparationsmekanismer i organismen9,10. Eftersom P. falciparum saknar maskinen för att reparera DNA pauser genom icke-homolog slutet att gå, det använder homolog rekombination mekanismer och integrerar transfekterade homologa DNA-mallar för att reparera det Cas9/gärna-inducerat dubbel-strand break11,12.
Här presenterar vi ett protokoll för generering av villkorlig knockdown mutanter i P. falciparum använder CRISPR/Cas9 gen editering. Protokollet visar användningen av de glmS ribozym till villkorligt knockdown proteinnivåer av PfHsp70x (PF3D7_0831700), ett förkläde exporteras av P. falciparum till värd röda blodkropparna13,14. Den glmS ribozym aktiveras genom behandling med glukosamin (som omvandlas till glukosamin-6-fosfat i celler) för att klyva dess associerade mRNA, leder till en minskning av protein14. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att utnyttja andra villkorsstyrda knockdown verktyg, såsom destabilisering domäner eller RNA aptamers4,5,15. Vår protokolldetaljer generering av en reparation plasmid bestående av en hemagglutinin (HA) tag och glmS ribozym kodande sekvens flankerad av sekvenser som är homolog till PfHsp70x öppen läsning ramen (ORF) och 3'-UTR. Vi beskriver också generationen av en andra plasmid att driva uttryck för gärna. Dessa två plasmider, tillsammans med en tredje som driver uttryck för Cas9, är transfekterade i röda blodkroppar och används för att ändra genomet hos P. falciparum parasiter. Slutligen beskriver vi ett polymeras-kedjereaktion (PCR)-baserad teknik för att kontrollera integrationen av den taggen och glmS Ribozym. Detta protokoll är mycket anpassningsbar till ändring eller komplett knockout av någon P. falciparum gener, förbättra vår förmåga att generera nya insikter i biologin av malariaparasiten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kontinuerlig kultur av P. falciparum kräver användning av mänskliga röda blodkroppar, och vi utnyttjas kommersiellt tillgängliga enheter blod som berövats alla identifierare och anonymiseras. Den institutionella Review Board och Office för biosäkerhet på University of Georgia granskas våra protokoll och godkänns alla protokoll som används i vårt labb.
1. att välja en gärna sekvens
- Gå till CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) och välj ' Fasta mål '. Under 'Mål', klistra in 200 basparen från 3' ände ramen öppen läsning (ORF) av en gen och 200 baspar från början av genens 3'-UTR. Under 'I', Välj 'P. falciparum' (3D 7 v3.0), och välj ' CRISPR/Cas9 ' under 'Med'. Klicka sedan på ”Hitta målet webbplatser '.
- Välj en gärna sekvens från de alternativ som presenteras, förtur för den mest effektiva gärna som är närmast till platsen för ändring och som har de minsta off-target-platserna.
Obs: Potentiella gärna sekvenser identifieras eftersom de är omedelbart uppströms av en Protospacer intill motiv (PAM), vilket krävs för rekrytering av Cas9 DNA. Sekvensen som är klonade in pMK-U6, vektorn som driver gärna uttryck, är 20 baserna omedelbart uppströms PAM. PAM specifika för S. pyogenes Cas9 är av nukleotidsekvensen NGG och inte bör ingå i den sekvens som är klonade in pMK-U6.
Obs: CHOPCHOP visuellt rangordnar den gärna sekvenser, Visa de bästa alternativen i grönt, mindre perfekta alternativen i bärnsten och värsta alternativen i rött. CHOPCHOP ger varje gärna sekvens en effektivitet betyg som beräknas med de mest aktuella parametrar som finns i litteraturen, och de förutsäga off-target webbplatser som kunde kännas igen av gärna. Två eller tre gärna sekvenser kan behöva vara försökte hitta den gärna bästa lämpade för en viss gen. - Köp gärna sekvensen och dess reverse-komplement som polyakrylamid gelelektrofores-renat oligos. Gärna sekvensen används till målet PfHSP70x kan hittas i figur 1B.
Obs: Denna oligo bör omfatta 15 baspar homolog till gärna-uttryckande plasmiden, som är nödvändiga för sekvens och ligation-oberoende kloning (SLIC) in i de pMK-U6 vektor16.
2. kloning gärna sekvens till pMK-U6
-
Smälta den pMK-U6 med BtgZI.
- Digest 10 μg av pMK-U6 med 5 μL BtgZI enzym (5 000 enheter/mL) för 3 h vid 60 ° C. Följ enzym tillverkarens protokoll för reaktion villkor.
- Efter 3 h inkubationstiden, lägga till en ytterligare 3 μL BtgZI i reaktionen att säkerställa fullständig nedbrytning av Plasmiden. Smälta för en ytterligare 3 h, fortfarande efter tillverkarens instruktioner för att säkerställa de rätta reaktion villkor.
- För att rena den smält pMK-U6 från reaktionen, använda en kolumnbaserade PCR-rengöring kit enligt tillverkarens anvisningar.
- Separata smält DNA använder en 0,7% agarosgel och extrahera 4.200-baspar bandet.
-
Glödga den oligos som innehåller sekvensen gärna.
- Rekonstruera den sida-renat oligos till en koncentration av 100 μM med nuclease-gratis vatten.
- Kombinera 10 μL av varje oligo med 2,2 μL 10 x buffert 2 (se Tabell för material). Se till att den totala reaktionsvolym är 22,2 μL.
- Kör den gärna glödgning program i en termocykler: steg 1: 95 ° C, 10 min; steg 2: 95 ° C, 1 s, med en minskning i temperaturen på 0,6 ° C/cykel; steg 3: gå till steg 2, 16 gånger; steg 4: 85 ° C, 1 min; steg 5: 85 ° C, 1 s, med en minskning av temperatur av 0,6 ° C/cykel; steg 6: gå till steg 5, 16 gånger; steg 7: 75 ° C, 1 min; steg 8: 75 ° C, 1 s, med en minskning i temperaturen på 0,6 ° C/cykel; steg 9: gå till steg 8, 16 gånger. Steg 10 till 21: Upprepa proceduren används i steg 4 – 9 tills temperaturen når 25 ° C; steg 22:25 ° C, 1 min.
-
Infoga den glödgade gärna oligos i BtgZI-rötas och gel-renat pMK-U6 Plasmiden.
- Kombinera 100 ng av smält pMK-U6 med 1 μL 10 x buffert 2.1 och 3 μL av glödgad gärna oligos. Öka volymen till 9,5 μL med nuclease-gratis vatten.
- Tillsätt 0,5 μL av T4-polymeras och inkubera reaktionen vid rumstemperatur för 2,5 min.
- Flytta reaktionen is och inkubera i 10 min.
- Omedelbart omvandla 5 μL av reaktionen till behöriga E. coli enligt bakterier leverantörens instruktioner. Tallrik bakterier på Lysogeny buljong (LB) agarplattor som innehåller 100 μg/mL Ampicillin.
- Tillåta transformerad bakterierna att växa vid 37 ° C över natten, sedan markera kolonier och extrahera DNA med en kommersiellt tillgänglig plasmiden miniprep kit.
3. designa homologi regioner av mallen för reparation
-
Design sköld mutationer inom mallen homologi reparation för att förhindra omfräsning av DNA som är integrerad i genomet.
Obs: En sköld mutation består vanligtvis av att införa en tyst mutation för att förändra PAM så att Cas9 inte kommer inducerar en paus i mallen reparation. PAM krävs för den Cas9 som används i detta protokoll är av nukleotidsekvensen ”NGG”, där ”N” är en nukleotid. Om möjligt, ändra en av de G nukleotiderna till en A, C eller T.- Om PAM inte kan vara tyst muterade, införa minst 2 tysta mutationer in 6 basparen i direkt anslutning till den PAM7,8.
Obs: Dessa mutationer förhindrar erkännandet av mallen för reparation av gärna och förhindra omfräsning av den reparerade locus av den Cas9/gärna komplexa. Sköld mutationerna kan införas i regionen homologi genom att förstärka DNA med primers som innehåller mutationen.
- Om PAM inte kan vara tyst muterade, införa minst 2 tysta mutationer in 6 basparen i direkt anslutning till den PAM7,8.
-
Förstärka regionen ORF homologi för mallen reparation.
- Med PCR, förstärka 800 baspar från 3' ände målgenens ORF. Design primers som ska användas för att utesluta den stop kodon från denna amplikon.
- Design primers för insättning denna Restriktionsenzymanalys av kopian i den pHA -glmS som har blivit smält med SacII och AfeI genom DNA ligering reaktion eller skära upp i skivor16.
-
Förstärka regionen 3'-UTR homologi för mallen reparation.
- Med PCR, förstärka 800 basparen omedelbart efter den stop kodon av målgenen. Design primers för insättning denna Restriktionsenzymanalys av kopian i den pHA -glmS som har blivit smält med HindIII och NheI genom DNA ligering reaktion eller skära upp i skivor16.
Obs: Höga på innehåll av P. falciparum genomet kan försvåra amplifiering av regioner såsom utr. En alternativ metod för att använda PCR syntetisera Regionkommittén homologi.
- Med PCR, förstärka 800 basparen omedelbart efter den stop kodon av målgenen. Design primers för insättning denna Restriktionsenzymanalys av kopian i den pHA -glmS som har blivit smält med HindIII och NheI genom DNA ligering reaktion eller skära upp i skivor16.
4. kloning homologi regioner in reparation plasmiden
-
Sätt in ORF homologi regionen i den pHA -glmS.
- Smälta den pHA -glmS med SacII och AfeI, enligt enzym tillverkarens anvisningar. Sätt in ORF homologi regionen PCR-produkten i smält plasmiden med SLIC16.
- Omvandla till behöriga E. coli som utförs i steg 2.3.4 och 2.3.5.
-
Infogar en pHA-glmS plasmid som redan innehåller ORF homologi regionen regionen 3'-UTR homologi (se steg 4.1).
- Smälta plasmiden med HindIII och NheI enligt enzym tillverkarens anvisningar. Sätt in 3'-UTR homologi regionen ospädd i smält plasmiden med SLIC16.
- Omvandla till behöriga E. coli och extrahera plasmiden DNA (steg 2.3.4 och 2.3.5).
5. utfällning DNA för Transfection
- Lägga till 40 μg varje av pMK-U6, pUF1-Cas9 och pHA -glmS DNA (för sammanlagt 120 μg DNA) till en steril 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Lägg till 1/10th volymen av DNA 3 M natriumacetat i vatten (pH 5.2) till röret och blanda den väl med en virvel (t.ex. om volymen i steg 5.1 var 100 μL, tillsätt 10 μL av natriumacetat).
- Tillsätt 2,5 gånger volymen av 100% etanol till röret och blanda väl med en virvel i minst 30 s (t.ex. om volymen i 5.1 var 100 μL, tillsätt 250 μL av 100% etanol).
- Placera röret på is eller vid-20 ° C under 30 minuter.
- Centrifugera röret vid 18.300 x g under 30 minuter vid 4 ° C.
- Ta försiktigt bort supernatanten från röret. Inte störa pelleten.
- Tillsätt 3 gånger volymen av 70% etanol till röret och blanda kort använder en virvel (t.ex., om volymen i 5.1 var 100 μL, tillsätt 300 μL av 70% etanol).
- Centrifugera röret vid 18.300 x g under 30 minuter vid 4 ° C.
Obs: Detta steg bör utföras under sterila förhållanden i biologiska säkerhetsdragskåp. - Ta försiktigt bort supernatanten från röret. Inte störa pelleten. Låt röret öppet och låt pelleten lufttorka 15 min.
- Lagra den utfällda DNA vid-20 ° C tills den behövs för transfection.
6. isolera mänskliga röda blodkroppar från helblod inför Transfection
- Alikvotens färskt blod in i sterila 50 mL koniska rör (ca 25 mL per rör).
- Centrifugera rören vid 1 088 x g i 12 min, med centrifug bromsar ange 4.
- Aspirera ut supernatant och buffy pälsen. Återsuspendera pelleten RBC med en lika stor volym av ofullständig RPMI.
Obs: Ofullständig RPMI förbereds genom att komplettera RPMI 1640 med 10.32 μM tymidin, 110,2 μM hypoxantin, 1 mM natrium pyruvat, 30 mM natriumbikarbonat, 5 mM HEPES, 11,1 mM glukos och 0,02% (v/v) gentamicin. - Upprepa steg 6,2 – 6.3 två gånger. Efter den sista tvättningen, Återsuspendera de röda blodkropparna i en lika stor volym av ofullständig RPMI och förvara rören vid 4 ° C.
7. transfecting röda blodkroppar med CRISPR/Cas9 plasmidsna (måste göras aseptiskt)
Obs: P. falciparum kulturer underhålls som beskrivs i andra rapporter17. Behålla alla kulturer vid 37 ° C under 3% O2, 3% CO2och 94% N2 om inte annat anges. När blod används i detta protokoll, är det att hänvisa till de rena röda blodkroppar som bereddes i steg 6. Det blod som används bör inte vara äldre än 6 veckor, eftersom det finns vanligtvis en minskning av parasiten spridning i äldre blod. Följande steg beskriver före lastning röda blodkropparna med DNA och lägga en parasit kultur till de transfekterade cellerna. Andra etablerade transfection protokoll är kompatibla med transfecting dessa konstruktioner18,19.
- Förbereda en 1 x cytomix buffert i vatten (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10 mM K2HPO4, 25 mM HEPES, pH 7,6). Filter-sterilisera bufferten med 0,22 μm filter.
- Lägg till 380 μL av de 1 x cytomix till DNA fälls ut i steg 5 och vortex att upplösa. Tillåta DNA att upplösa i det 1 x cytomix för 10 minuter, vortexa alla 3 min för 10 s.
- I en steril 15 mL koniska rör, kombinera 300 μL av röda blodkroppar (50% hematokrit, från steg 6) i den ofullständiga RPMI med 4 mL 1 x cytomix.
- Centrifugera de röda blodkropparna från steg 7,3 på 870 x g i 3 min och ta sedan bort supernatanten från RBC pelleten.
- Återsuspendera av RBC pelleten med DNA/cytomix blandningen från steg 6,2 och överföra till en 0,2 cm elektroporation kyvetten.
- Electroporate de röda blodkroppar med hjälp av följande villkor: 0,32 kV, 925 μF, kapacitans inställd på ”hög Cap”, och motståndet inställt på ”oändlig”.
- Efter elektroporation, överföra innehållet från kyvetten till en 15 mL koniska innehållande 5 mL av komplett RPMI (cRPMI). Centrifugera röret på 870 x g under 3 minuter vid 20 ° C, och sedan Dekantera supernatanten.
Obs: cRPMI är beredd genom samma metod som ofullständig RPMI med tillägg av 0,25% (w/v) lipid-rika bovint serum albumin. - Återsuspendera pelleten i 4 mL cRPMI och överföring till en brunn i en 6-väl vävnadsodling tallrik. Tillsätt 400 μL av en hög-schizont kultur (7 – 10% schizont parasitemia är idealiska) till de transfekterade röda blodkropparna.
Obs: Parasitemia är definierad som andelen parasit-infekterade röda blodkroppar. - Nästa dag, tvätta kulturen med 4 mL cRPMI. Centrifugera kulturen på 870 x g i 3 min och Aspirera supernatanten. Återsuspendera kulturen i 4 mL cRPMI.
- 48 h efter steg 7,6, tvätta kulturen med 4 mL cRPMI. Sedan Återsuspendera kulturen i cRPMI som innehåller 1 μM DSM1 välja för Cas9 Plasmiden.
-
Fortsätt tvätta kulturerna varje dag med cRPMI tills parasiter inte längre synliga av blod smeta. Efter denna punkt ersätta odlingssubstratet med färska cRPMI plus 1 μM DSM1 varje 48 h.
- Att göra en blod smeta, tillsätt 150 μL av kulturen i ett 0,6 mL centrifugrör. Pellet cellerna genom centrifugering vid 1.700 x g i 30 s.
- Aspirera av supernatanten. Använd en pipett för att överföra pelleterat cellerna till en glasskiva. Använder en andra glasskiva som hölls i 45° vinkel mot den första bilden, smeta blod droplet-programmet. Fläck i bilden med hjälp av ett kommersiellt tillgängliga färgning kit enligt tillverkarens protokollet.
- Visa parasiterna med hjälp av en 100 X oljeimmersionsobjektivet.
- Beginning 5 dagar efter transfection (steg 7,6), ta bort röda blodkropparna resuspended i odlingsmediet 2 mL av kulturen. Lägg tillbaka 2 mL färsk medium (cRPMI plus 1 μM DSM1) och blod på 2% hematokrit. Lägg till färskt blod på detta sätt en gång i veckan tills parasiter återkommer, som bestäms av tunt blod smeta (steg 7.11).
Obs: Om integration är framgångsrika, parasiter generellt återkommer i kulturen av en månad efter transfection. - En gång parasiter reemerge, ta bort DSM1 drog trycket. Alternativt ta bort drogen trycket efter parasiter har blivit klonad ut.
8. Kontrollera parasiter för Integration av mallen för reparation
- När parasiter är synliga igen av tunt blod smeta, isolera DNA från kulturen med en lämplig kit.
-
Använd PCR för att förstärka regionen modifierade genomet att avgöra om den riktade locus har framgångsrikt ändras och om de omodifierade vildtyps-locus (vägledande av vildtyp parasiter) detekteras.
- För att upptäcka parasiter som har integrerat mallen reparation, Använd en forward primer som sitter i början av ORFEN, utanför regionen klonade homologi. Använd en omvänd primer som sitter i de 3'-UTR.
Obs: Eftersom denna förstärkning innehåller sekvenser av HA Taggar och glmS ribozym, amplikoner från integrerad parasiter blir längre än samma regionen förstärks i vildtyp parasiter.
- För att upptäcka parasiter som har integrerat mallen reparation, Använd en forward primer som sitter i början av ORFEN, utanför regionen klonade homologi. Använd en omvänd primer som sitter i de 3'-UTR.
9. kloning parasiter genom att begränsa utspädning
-
Utföra seriespädningar av parasiten kultur från steg 7.13 att uppnå en slutlig koncentration på 0,5 parasiter/200 μL. Lägga till 200 μL av den utspädda kulturen i brunnarna 96 brunnar vävnadsodling platta.
Obs: Eftersom parasitemia definieras som andelen infekterade röda blodkroppar och hematokrit är också ett definierat antal (2%), antalet parasiter per volymenhet är enkelt härledas.- Förbereda 1 mL av kulturen i cRPMI på 5% parasitemia och 2% hematokrit (på dessa parasitemia och hematocrit nivåer, kultur innehåller 1 x 107 parasiter/mL).
- Späd ut denna kultur 1: 100 med cRPMI. Späd igen 1: 100 med cRPMI.
- Späd 1: 400. Utföra denna utspädning genom att lägga till 62,5 μL av kultur 25 mL cRPMI och 1 mL blod. Denna utspädning medför önskad koncentration på 0,5 parasiter/200 μL.
-
Bibehålla kloning plattan tills parasiter är detekterbara i brunnarna.
- Varje 48 h, ersätta mediet i plattan med 96 brunnar med färska medium.
- En gång i veckan, start 5 dagar efter början kloning plattan (steg 9,1), ta bort 100 μL från varje brunn och lägga tillbaka 100 μL av färskt medium + blod (2% hematokrit).
-
Identifiera eventuella brunnar som innehåller parasiter.
- Placera plattan med 96 brunnar i en 45° vinkel för ca 20 min, så att blodet att bosätta sig i en vinkel inom plattan.
- Placera plattan med 96 brunnar på en ljuslåda. Märke att brunnarna som innehåller parasiter innehåller media som är gul i färgen, jämfört med rosa media av parasit-fri brunnar, på grund av försurning av medlet av parasiter.
- Med serologisk pipett, flytta innehållet i parasit-innehållande brunnarna på en 24-väl vävnadsodling tallrik att tillåta expansion av parasitemia.
- Med hjälp av PCR-analys som beskrivs i steg 8, kontrollera dessa klonal parasit rader för korrekt integrering.
10. Nedslagning av Protein genom att behandla parasiter med glukosamin och bekräftelse via Western Blot analys
- Förbereda en 0,5 M GlcN (glukosamin) stamlösning, som kan förvaras vid-20 ° C.
- Lägg till GlcN till glmS parasit kulturer och tillåta dem att växa i närvaro av GlcN.
Obs: Den slutlig koncentration och tidpunkten för GlcN behandling beror på raden experiment och parasit. GlcN kan påverka parasit tillväxt, så föräldra parasit stammen bör utsättas för en rad av GlcN koncentrationer att fastställa dess känslighet för föreningen. En koncentration av 2.0-7,5 mM GlcN är ofta används13,14,20. - Isolera protein prover från de GlcN-behandlade parasiter13.
-
Använda protein prover för western blot analys för att identifiera minskningar i protein13.
- Använda en anti-HA-antikroppar enligt tillverkarens instruktioner för att identifiera HA-glmS-märkta proteinet. Jämföra HA bandet till en lastning kontroll, såsom PfEF1α.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk av plasmidsna används denna metod som ett exempel på en sköld mutation visas i figur 1. Som ett exempel på hur man identifierar mutant parasiter efter transfection, redovisas resultaten från primärvården för att kontrollera integrationen av den HA -glmS konstruktionen i figur 2. En representativ bild av en kloning plattan visas i figur 3 att Visa färgaändringen av mediet i närvaro av parasiter. Resultaten från ett immunofluorescens test och western blotting experiment visas i figur 4 till demonstrerar funktionerna i den HA etiketten och glmS-baserat minskningar av proteiner i parasiter. Figur 5 visar oförmåga kort homologi armar på PCR-produkter att ändra parasit genomen och få livskraftiga mutanter.
Figur 1: Sammanfattning av våra tre-plasmid strategi för CRISPR/Cas9 och exempel på en gärna oligo och sköld mutation. (A) scheman över tomma pHA-glmS samt pMK-U6 visas med de restriktionsenzym webbplatser som används för kloning. Också visat är pHA-glmS och pMK-U6 efter homologi armarna och gärna sekvenser har blivit klonad i dem, respektive. Slutligen visas pUF1-Cas9. yDHOD = jäst dihydrofolatreduktas, motstånd markören till DSM1. (B) den framåt oligo som används för kloning sekvensen PfHsp70x gärna in pMK-U6 visas, med sekvensen gärna med versaler och pMK-U6 homologi armarna behövs för kloning i gemener (överst). Genomisk målet för den PfHsp70x gärna visas som nedströms PAM, i rött (mitten). Sköld mutationen i den PfHsp70x gärna PAM visas i rött (nederst). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk av CRISPR/Cas9 genomet ändring med hjälp av pHA-glmS och en strategi för att bekräfta integration. (A) Cas9, guidade till en genomisk locus av en gärna, inducerar en dubbel strand paus i DNA. Parasiten reparerar skadan genom dubbla crossover homologa reparation, med pHA-glmS plasmiden som en mall och att införa den HA-glmS-sekvensen i arvsmassan. (B) en PCR test för att identifiera korrekt integrering av HA-glmS sekvensen. Använda primers P1 och P2, är 3na ' ORF av vild typ PfHsp70x och PfHsp70x -glmS mutanter förstärkta13. Ospädd från PfHsp70x-glmS är längre än vildtyp på grund av införande av HA-glmS sekvensen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: identifiering av brunnar som innehåller parasiter i en kloning plattan med 96 brunnar. (A) plattan med 96 brunnar ligger i 45 ° vinkel för ca 20 min så att blodet att bosätta sig i en vinkel i plattan. (B) väl till vänster innehåller en parasit kultur, indikeras av den gula färgen av medlet i jämförelse med rosa medlet av den parasit-fri bra på höger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: ett immunofluorescens-test visar den rätta HA-taggning av PfHsp70x och Western blotting visar minskningen av PfHsp70x proteinnivåer under behandling med glukosamin. (A) PfHsp70x -glmS parasiter var fixeras och färgas med DAPI (nucleus markör) och antikroppar mot HA och MAHRP1 (membran associerade histidin rika Protein 1, en markör för protein export till mottagande RBC)13. (B) PfHsp70x -glmS parasiter behandlades med 7.5 mM glukosamin, och hela-parasit lysates användes för Western blotting analys13. Membranet var utforskad med antikroppar för HA och PfEF1α som en lastning kontrollera13. Som förväntat, resulterade glukosamin behandling i en minskning av protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: använda kort homologi sekvenser för reparation. (A) Schematisk bild visar knockout av GFP i B7 parasiter21. B7 parasiter är ett derivat av 3D 7 där Plasmepsin II har taggats med GFP. PCR-produkter som innehåller 50, 75 eller 100 baspar GFP homologi regioner flankerar en blasticidin S motstånd kassett (märkt ”markör”), tillsammans med pUF1-Cas9-andra-gärna, en plasmid uttrycker Cas9 och en god Jordbrukarsed gärna, var transfekterade till B7 parasiter. Varje transfection genomfördes två gånger. DSM1 drog trycket var tillämpad 2 dagar efter transfection. (B) visas här är PCR-test på DNA isolerade från transfekterade parasiter 5 dagar efter transfection och 2 månader efter transfection. Primer som används för att testa integrationen av BSD motstånd kassetten kommer att ge en 584-baspar produkt för B7 föräldrarnas parasiter och en 2020-baspar produkt för parasiter som har integrerat markören. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genomförandet av CRISPR/Cas9 i P. falciparum har både ökad effektivitet och minskade mängden tid som behövs för att ändra parasitens arvsmassa, jämfört med tidigare metoder för genetisk manipulation. Denna omfattande protokoll beskriver stegen som krävs för att generera villkorlig mutanter med CRISPR/Cas9 i P. falciparum. Medan metoden här är inriktade specifikt för generering av HA -glmS mutanter, kan denna strategi anpassas för en mängd behov, inklusive märkning av gener, gen knockouts och införandet av punktmutationer.
Ett avgörande tidiga steg i detta protokoll är valet av en gärna sekvens. När du väljer en gärna, finns det flera punkter att överväga som där gärna sitter, hur effektiv den är och huruvida det har potential för off-target effekter. Sekvensen gärna bör vara så nära som möjligt till platsen för modifiering, helst inom 200 baspar. Detta minskar sannolikheten för parasiter med mallen reparation fixar deras arvsmassa utan att integrera etiketten. Verktyget används här för att hitta gärna var en kostnadsfri tjänst som kallas CHOPCHOP22. En annan online-verktyg, eukaryota patogen CRISPR guide RNA/DNA designverktyg (EuPaGDT; http://grna.ctegd.uga.edu/), du kan också använda23. EuPaGDT ger ytterligare karakterisering av gärna sekvenser, inklusive Prediktion av off-target träffar och potentiella problem som kan hindra transkription av gärna. EuPaGDT har också verktyg för batch-bearbetning av gRNAs att rikta flera gener eller hela genomet. Den valda gärna bör vara en som sitter närmast till platsen för modifiering med högsta effektivitet och minimal off-target träffar. En viktig begränsning av CRISPR/Cas9 gen redigering som kan uppstå är oförmågan att utforma en lämplig gärna rikta genen av intresse. I sådana fall en trial-and-error strategi kan behövas, med flera suboptimala gärna sekvenser tills bästa alternativet finns, och framgångsrik gen redigering har inträffat.
En annan viktig faktor att beakta när du genererar P. falciparum mutanter med CRISPR/Cas9 är längden av Regionkommittén homologi som används i mallen för reparation. Detta protokoll rekommenderar att Regionkommittén homologi bör vara cirka 800 baspar varje, men vi har också varit framgångsrika i att använda mindre regioner numrering 500 baspar3. Framgångsrika genomet modifiering med CRISPR/Cas9 och kort homologi armar på PCR-produkter har också använts i andra protozo parasiter såsom Toxoplasma gondii och Trichomonas vaginalis24,25. Vi testade möjligheten att använda mindre homologi armar på PCR-produkter (50, 75 eller 100 baspar) genom att försöka knockout GFP i B7 parasiter med hjälp av en blasticidin motstånd kassett21. Vi såg några integration av blasticidin motstånd kassett på 5 dagar post transfection; dock dessa parasiter aldrig återhämtat sig från transfection. För dessa transfections, som vi valt för Cas9-uttryckande plasmiden med DSM1. En urvalsmetod för olika, såsom behandling av transfekterade kulturer med blasticidin S ensamt eller i kombination med DSM1, kan förbättra chanserna att parasiter som återkommer när du använder kortare homologi regioner för att reparera Cas9/gärna-inducerad raster. Vi valde i det här fallet inte med blasticidin S, eftersom vi ville testa om kort homologi armar kan användas i fall där en drug resistance kassett inte att integreras i genomet, till exempel när ett protein är att vara taggade.
De centrala delarna av CRISPR/Cas9 gen redigering är diskuteras den Cas9 Amiiiiin, gärna och mallen för reparation. Vi beskriver en tre-plasmid strategi att införa dessa komponenter i parasiter, där Cas9, gärna och mallen reparation finns i separata plasmider. Utöver detta synsätt, har vårt lab varit framgångsrik i en två-plasmid metod där Cas9 och gärna uttryck drivs av en enda plasmid och reparation mallen finns i en andra plasmid3. Liknande två-plasmid synsätt har också framgångsrikt använts av andra laboratorier att generera mutanter7,8,26,27,28,29. Dessutom använder flera labs en stam av Plasmodium (NF54attB) som konstitutivt uttrycker Cas9 och en T7 RNA-polymeras att driva uttryck för gRNAs30. I detta fall är en enda plasmid som innehåller mallen reparation och gärna transfekterade in NF54attB parasiter31,32. Slutligen använts en plasmid-gratis strategi utnyttjar en renad Cas9-gärna ribonukleoprotein komplexa att infoga mutationer i arvsmassan, som väl33. Framgången för dessa olika synsätt visar flexibilitet av metoder där forskare kan införa Cas9/gärna komponenter i parasiten.
Slutligen kan valet av drogen trycket att gälla transfekterade parasiter ändras, beroende på konstruktioner används. Här visar vi framgångsrik generation av mutanter av övergående välja för Cas9-uttryckande plasmiden med DSM1 tills parasiter återkommer. Generera PfHsp70x knockout parasiter, pfhsp70x ersattes med mänskliga dihydrofolate reduktas genen och parasiter valdes sedan använder WR9921013. Det nyligen beskriven te-PfDOZI knockdown systemet bygger på integration av en plasmid innehållande en blasticidin S motstånd-genen, vilket möjliggör urval av parasiter som använder blasticidin S15,31.
Sammantaget CRISPR/Cas9 gen redigering av P. falciparum har visat sig vara ett kraftfullt verktyg i malaria forskning, och protokollet här Detaljer metoderna för att skapa villkorlig knockdown mutanter3,7,8 , 13 , 20 , 28. detta protokoll är mycket anpassningsbar till enskilda forskningsintressen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Muthugapatti Kandasamy vid University of Georgia (UGA) biomedicinska mikroskopi kärnan för tekniskt bistånd och Jose-Juan Lopez-Rubio för att dela de pUF1-Cas9 och pL6 plasmidsna. Detta arbete stöds av bågar Foundation utmärkelser till D.W.C. och H.M.K., UGA start medel till V.M., bidrag från mars av Dimes Foundation (basilika O'Connor Starter Scholar Research Award) till V.M. och oss National Institutes of Health beviljar (R00AI099156 och R01AI130139) till V.M. och (T32AI060546) till H.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
- World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K.
- Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310 (2012).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
- Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
- Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
- Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
- Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
- Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
- Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).
- Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727 (2016).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
- Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -H., Su, X. -Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
- Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
- Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
- Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
- Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).
- Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
- Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
- Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
- Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
- Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
- Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
- Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).
