Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

شرائح المخ--الغدة النخامية سليمة للتحقيقات الكهربية من خلايا الغدة النخامية في الأسماك تيليوست

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57790
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكولا أمثل لصنع شرائح أنسجة المخ--الغدة النخامية قابلة للتطبيق، استخدام الأسماك تيليوست الميداكا (Oryzias latipes)، تليها التسجيلات الكهربية من خلايا الغدة النخامية باستخدام تقنية المشبك التصحيح مع تكوين تصحيح مثقب.

Abstract

وقد أجريت تحقيقات الكهربية خلايا الغدة النخامية في العديد من الأنواع الفقارية، ولكن عدد قليل جداً في الأسماك تيليوست. ومن بين هذه، تم إجراء غالبية واضحة على ينتابها الابتدائية الخلايا. لتحسين فهمنا لكيفية تيليوست خلايا الغدة النخامية، وتتصرف في بيئة ذات صلة أكثر بيولوجيا، هذا البروتوكول يوضح كيفية إعداد شرائح المخ--الغدة النخامية قابلة للتطبيق استخدام الميداكا الصغيرة من أسماك المياه العذبة (Oryzias latipes). جعل شرائح المخ--الغدة النخامية، درجة الحموضة وأوسمولاليتي لجميع الحلول عدلت إلى القيم الموجودة في سوائل الجسم من أسماك المياه العذبة التي تعيش في 25 إلى 28 درجة مئوية. وبعد إعداد شريحة، البروتوكول يوضح كيفية إجراء التسجيلات الكهربية باستخدام تقنية ثقب كامل الخلية التصحيح-المشبك. تقنية التصحيح-المشبك أداة قوية مع الأزمنة لم يسبق لها مثيل وحساسية، السماح بالتحقيق في خصائص الكهربائية من الخلايا كلها سليمة وصولاً إلى قنوات أيون واحد. مثقب التصحيح فريدة من نوعها في ذلك فإنه يحتفظ بالبيئة داخل الخلايا سليمة منع العناصر التنظيمية في سيتوسول من يجري تمييع الحل الكهربائي ماصة التصحيح. وفي المقابل، عند إجراء تسجيلات كامل الخلية التقليدية، فقد لوحظ أن خلايا الغدة النخامية الميداكا تفقد بسرعة قدرتها على إطلاق إمكانات العمل. بين انثقاب مختلف التقنيات المتاحة، هذا البروتوكول يوضح كيفية تحقيق انثقاب الغشاء مصححة باستخدام مبيد الامفوتريسين باء

Introduction

الغدة النخامية جهاز الغدد الصماء رئيسية في الفقاريات الموجودة أدناه تحت المهاد والخلفية إلى chiasm البصرية. وتنتج وتفرز الهرمونات ستة إلى ثمانية من أنواع الخلايا المحددة. هرمونات الغدة النخامية تشكل وسيط بين الدماغ والأجهزة الطرفية ومحرك مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية الأساسية بما في ذلك النمو والتكاثر، وتنظيم التوازن. مشابهة للخلايا العصبية، خلايا الغدد الصماء الغدة النخامية منفعل كهربائياً مع القدرة على إطلاق إمكانات العمل تلقائياً 1. ودور هذه إمكانات العمل هو الخلية التابعة. في العديد من أنواع الخلايا في الغدة النخامية الثدييات، إمكانات العمل يمكن أن ترفع داخل الخلية Ca2 + بما فيه الكفاية لإطلاق سراح المطرد لهرمون 2. وبالإضافة إلى ذلك، يتلقى الغدة النخامية معلومات محفزة والمثبطة على حد سواء من الدماغ الذي يؤثر على إمكانات غشاء الخلايا 3،4،،من56. عادة، مدخلات تنشيطية يزيد استثارة وغالباً ما ينطوي على إطلاق سراح Ca2 + من مخازن داخل الخلايا، فضلا عن زيادة إطلاق تردد 7. فهم كيف يستخدم تكوين قناة أيون الخلية وتتكيف مع هذه الإشارات الإدخال من الدماغ مفتاح لفهم هرمون التجميعي والإفراج.

تقنية التصحيح-المشبك وضعته زاكمان ونيهر9،،من 810 في أواخر السبعينات وزيادة تحسين طريق هاميل 11، ويسمح بتحقيقات مفصلة للخصائص الكهربية للخلايا وصولاً إلى قنوات أيون واحد. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة كل من التيار والجهد. واليوم، لقط التصحيح هو المعيار الذهبي لقياس الخصائص الكهربية للخلية. وكانت أربعة تكوينات رئيسية تقنية التصحيح-المشبك ختم ضيق 11من البلدان المتقدمة النمو؛ الخلية-المرفقة والداخل إلى الخارج، الخارج، وتصحيح كامل الخلية. ثلاثة تكوينات الأولى تستخدم عادة للتحقيقات قناة أيون واحد. للدورة الرابعة، بعد تكوين خلية يولي، ثقب في غشاء الخلية باستخدام ضغط الغلاف الجوي الفرعية. يسمح هذا التكوين أيضا التحقيقات المتعلقة بتكوين خلية كله 12قناة أيون. بيد أن القيد واحد من هذا الأسلوب أن جزيئات هيولى مخففة بالتصحيح ماصة حل 13 (الشكل 1أ)، مما يؤثر على الاستجابات الكهربائية والفسيولوجية للخلايا المدروسة. وفي الواقع، بعض من تلك الجزيئات قد تؤدي أدواراً هامة في توصيل الإشارات أو في تنظيم قنوات أيون مختلفة. لتجنب هذا، وضعت لينداو وفرنانديز 14 طريقة حيث يتم إضافة مركب تشكيل المسام إلى ماصة التصحيح. بعد تكوين خلية يولي، سوف تدرج في غشاء البلازما تحت التصحيح المجمع والتسلخات ببطء الغشاء إنشاء الاتصال الكهربائية مع سيتوسول (الشكل 1ب). ويمكن استخدام العديد من الأنواع مختلفة مثل النيستاتين 15 والامفوتريسين ب 16، أو التوتر السطحي مثل ال 17،صابونين بيتا-إيسين18 . إنشاء هذه المركبات المسام كبيرة بما يكفي للسماح بالأيونات الموجبة الفموي الأحادي التكافؤ ونشرها بين في سيتوسول وماصة التصحيح مع الحفاظ على مستويات الجزيئات والايونات أكبر مثل Ca2 + 15، سيتوسوليك من Cl– 16.

ويتمثل التحدي في استخدام التصحيح مثقبة المقاومة سلسلة يحتمل أن تكون عالية. سلسلة المقاومة (Rs) أو الوصول إلى المقاومة هي المقاومة مجتمعة على ماصة التصحيح بالنسبة للأرض. خلال تسجيلات المشبك التصحيح، سيكون Rs بالتوازي مع مقاومة الغشاء (Rم). Rm و Rs في العمل بالتوازي مقسم الجهد. مع ارتفاع Rs، ستسقط الجهد عبر Rs يعطي أخطاء في التسجيلات. الخطأ سوف تصبح أكبر مع التيارات الكبيرة المسجلة. وباﻹضافة إلى ذلك، مقسم الجهد هو أيضا التردد يعتمد إنشاء مرشح تمرير منخفض، مما يؤثر في الأزمنة. في الواقع، التصحيح مثقب قد لا تسمح دائماً تسجيلات تيارات الكبيرة والسريعة مثل الجهد عن طريق بوابة التيارات نا+ (لقراءات مفصلة، انظر المرجع 19). أيضا، قد تختلف Rs أثناء تسجيلات المشبك التصحيح، مرة أخرى مما يؤدي إلى تغييرات في الحالي مسجل. وهكذا، قد تحدث إيجابيات كاذبة في حالات حيث يتغير Rs أثناء تطبيق المخدرات.

الكهربية في الأنسجة شرائح قدم لأول مرة بالمعمل أندرسن لدراسة الخصائص الكهربية للخلايا العصبية في الدماغ 20. الأسلوب الذي مهد الطريق لتحقيقات مفصلة للخلايا المفردة، فضلا عن دوائر الاتصالات وخلية خلية خلية في بيئة سليمة أكثر. تقنية مماثلة لصنع شرائح الغدة النخامية قدم في عام 1998 Guérineau et al. 21-ومع ذلك، فإنه لم يكن قبل عام 2005، استخدمت ذلك إعداد شريحة الدماغ-الغدة النخامية بنجاح للدراسات التصحيح-المشبك في تيليوست 22. في هذه الدراسة، ذكر الكتاب أيضا استخدام تسجيلات المشبك التصحيح مثقب. ومع ذلك، حتى الآن، معظم التحقيقات الكهربية من خلايا الغدة النخامية قد أجريت في الثدييات، وحفنة فقط من الفقاريات الأخرى، بما في ذلك الأسماك تيليوست 1،2،22،23 . في اريوكروماس، وتقريبا جميع دراسات أجريت على خلايا معزولة الابتدائي 24،25،26،27،،من2829،30 .

في هذه الورقة، فإننا مخطط بروتوكولا أمثل لإعداد شرائح المخ--الغدة النخامية سليمة من الميداكا الأسماك النموذجية. النهج الذي يمثل العديد من المزايا المقارنة للثقافات الخلية ينتابها الأولية. أولاً، يتم تسجيل الخلايا في بيئة المحافظة نسبيا مقارنة بفصل شروط ثقافة الخلية. ثانيا، الأعمال التحضيرية شريحة تسمح لنا بدراسة مسارات غير مباشرة توسط خلية خلية الاتصالات 22، التي ليس من الممكن في ظروف الثقافة خلية معزولة. وعلاوة على ذلك، نحن لشرح كيفية إجراء التسجيلات الكهربية على شرائح الأنسجة التي تم الحصول عليها استخدام تقنية ثقب كامل الخلية التصحيح-المشبك مع الامفوتريسين B كعامل تشكيل المسام.

الميداكا أسماك المياه العذبة صغيرة أصلي إلى آسيا، وجدت في المقام الأول في اليابان. علم وظائف الأعضاء، وعلم الأجنة، وعلم الوراثة من الميداكا قد درست على نطاق واسع لما يزيد على 100 سنة 31، ونموذج بحث شائعة استخدام في العديد من المختبرات. أهمية خاصة لهذه الورقة هو المنظمة المورفولوجية متميزة للمجمع تحت المهاد-النخامية في الأسماك تيليوست: بينما في الثدييات والطيور الخلايا العصبية طائي الإفراج عن الهرمونات العصبية تنظيم خلايا الغدد الصماء الغدة النخامية نظام المدخل لنيافة الوسيط، هناك إسقاطات عصبية مباشرة لطائي من الخلايا العصبية إلى خلايا الغدد الصماء الغدة النخامية في الأسماك تيليوست 32. وهكذا، تجري بعناية تشريح الدماغ-الغدة النخامية له أهمية خاصة في الأسماك، مما يسمح لنا بالتحقيق في الخصائص الكهربية لخلايا الغدة النخامية في شبكة الدماغ-الغدة النخامية الحفاظ عليها جيدا، ولا سيما كيف الغدة النخامية خلايا التحكم استثارة وبالتالي Ca2 + التوازن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجرى جميع الحيوانات معالجة وفقا لتوصيات للعناية والرعاية للحيوانات البحوث في الجامعة النرويجية لعلوم الحياة، وتحت إشراف المحققين المأذون بها.

1-إعداد الأدوات والحلول

ملاحظة: يجب أن تكون جميع الحلول العقيمة. ينبغي إيلاء الاهتمام إلى درجة الحموضة وأوسمولاليتي (أوسمول/كغ ماء) لجميع الحلول، التي ينبغي أن تتكيف البيئة خارج الخلية للأنواع المدروسة بعناية دقيقة. ينبغي أن تعدل الحموضة و osmolality مع المعدات الإلكترونية الدقيقة مثل مقياس الأس الهيدروجيني ودرجة التجمد أوسموميتير على التوالي.

  1. جعل 500 مل من محلول خارج الخلوية دون Ca2 + (Ca2 + مجاناً الجماعة الأوروبية): 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 1.3 مم مجكل2، الجلوكوز 4 مم، 10 مم حبيس.
    1. حل ز 4.38 من كلوريد الصوديوم، 186.37 مغ بوكل، مغ 61.89 مجكل2، مغ 360.32 الجلوكوز وز 1.19 حبيس في 450 مل من عالي النقاوة (0.055 الولايات المتحدة/سم عند 25 درجة مئوية، والمقاومة موهم 18.2) ح2س في كوب زجاج استخدام المحرض مغناطيسية.
    2. قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.75 مع هيدروكسيد الصوديوم.
    3. نقل الحل إلى دورق حجمي 500 مل. شغل دورق حجمي مع عالي النقاوة ح2س حتى 500 مل.
    4. مزيج الحل جيدا قبل قياس أوسمولاليتي. ضبط لموسم 290 – 300 مع المانيتول. فلتر تعقيم الحل باستخدام نظام فراغ الماء و 0.2 ميكرون فلتر.
  2. جعل 500 مل من محلول خارج الخلوية (الجماعة الأوروبية): 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 2 مم كاكل2، 1.3 مم مجكل2، الجلوكوز 4 مم، 10 مم حبيس.
    1. حل ز 4.38 من كلوريد الصوديوم، ملغ 186.37 من بوكل، ملغ 147.01 كاكل2، ملغ 61.89 مجكل2، مغ 360.32 الجلوكوز وز 1.19 حبيس في 450 مل من النقاوة ح2س في كوب زجاج استخدام المحرض مغناطيسية.
    2. قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.75 مع هيدروكسيد الصوديوم.
    3. نقل الحل إلى دورق حجمي 500 مل. شغل دورق حجمي مع عالي النقاوة ح2س حتى 500 مل.
    4. مزيج الحل جيدا قبل قياس أوسمولاليتي. ضبط لموسم 290 – 300 مع المانيتول. فلتر تعقيم الحل باستخدام نظام فراغ الماء و 0.2 ميكرون فلتر.
  3. جعل 500 مل من محلول خارج الخلوية مع ألبومين المصل البقري 0.1% (المفوضية الأوروبية مع جيش صرب البوسنة): 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 2 مم كاكل2، 1.3 مم مجكل2، الجلوكوز 4 مم، 10 مم حبيس.
    1. حل ز 4.38 من كلوريد الصوديوم، ملغ 186.37 من بوكل، ملغ 147.01 كاكل2، ملغ 61.89 مجكل2، مغ 360.32 الجلوكوز وز 1.19 حبيس في 450 مل من النقاوة ح2س في كوب زجاج استخدام المحرض مغناطيسية.
    2. قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.75 مع هيدروكسيد الصوديوم.
    3. نقل الحل إلى دورق حجمي 500 مل. شغل دورق حجمي مع عالي النقاوة ح2س حتى 500 مل.
    4. مزيج الحل جيدا قبل قياس أوسمولاليتي. ضبط لموسم 290 – 300 مع المانيتول. فلتر تعقيم الحل باستخدام نظام فراغ الماء و 0.2 ميكرون فلتر. إضافة 50 ملغ جيش صرب البوسنة.
  4. جعل 250 مل من محلول داخل الخلايا (IC): 110 مم كوه، 20 مم بوكل، 10 مم حبيس، السكروز 20 مم.
    1. حل ز 1.54 كوه وملغ 595.75 من حبيس وملغ 327.75 من بوكل ز 1.712 السكروز في 450 مل من النقاوة ح2س في كوب زجاج استخدام المحرض مغناطيسية.
    2. قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع الإيثان (N-morpholino) سولفونيك (MES) حمض.
    3. نقل الحل إلى دورق حجمي 250 مل. شغل دورق حجمي مع عالي النقاوة ح2س حتى 250 مل.
    4. مزيج الحل جيدا قبل قياس أوسمولاليتي. ضبط لموسم 280-290 (10 موسم أقل من الجماعة الأوروبية) مع السكروز. فلتر تعقيم الحل باستخدام نظام فراغ الماء و 0.2 ميكرون فلتر.
  5. جعل 100 مل محلول [اغروس] ذوبان منخفضة 2% في Ca2 + والمفوضية الأوروبية الحرة جيش صرب البوسنة (ز 2 من [اغروس] انصهار منخفضة في 100 مل من Ca2 + مجاناً الجماعة الأوروبية). حل استخدام ميكروويف ووضع [اغروس] المذابة في حمام مائي عند 40 درجة مئوية. ندعه يبرد حتى تصل إلى 40 درجة مئوية قبل استخدامها في الأنسجة.
    ملاحظة: الجماعة الأوروبية، Ca2 + المفوضية الأوروبية الحرة قد تكون مخزنة في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع في حالة معقمة وحلول IC في-20 درجة مئوية، لعدة أشهر. [اغروس] يمكن تخزينها لمدة أسبوع في 4 درجات مئوية، ويمكن استخدامها من 3 – 5 مرات قبل فترة وجيزة مايكرويف. إعادة الاستخدام المفرط يؤدي إلى التبخر وتحوير [اغروس] وتركيز الملح والجودة.
  6. جعل الجسر أجار:
    1. حرارة الشعيرات طويلة البورسليكات الزجاج 7.5 ملم مع خارج القطر (نقلت) 2 مم وداخل القطر (معرف) 1.16 مم باستخدام موقد بنسن في تنسيق نقطة حوالي 1/3 من طرف واحد حتى يبدأ الزجاج لثني. إزالة الزجاج من اللهب والسماح بالزجاج لينحني بزاوية مقدارها حوالي 120 درجة (الشكل 2أ).
    2. تذوب أجار 2% في المفوضية الأوروبية العادية دون الجلوكوز باستخدام ميكروويف، وفي حين [اغروس] هو ملء السائل الزجاج مسبقة الصنع الشعرية الشعرية باستخدام القوات بوضع أحد طرفي الزجاج السائل، والانتظار لبضع دقائق. تخزين الجسور حتى الاستخدام عند 4 درجة مئوية في المفوضية الأوروبية دون السكر.
  7. إعداد البورسليكات الزجاج مع خيوط التصحيح الممصات باستخدام ساحبة ماصة مناسبة. أرجع إلى دليل ساحبة ماصة للحصول على مقاومة القطب المنشود.
    ملاحظة: تفتق ماصة ينبغي أن تكون قصيرة قدر الإمكان. ويتحقق باستخدام الخطوات 4-6 سحب ماصة قصيرة مستدقة. ينبغي أن تكون مقاومة القطب بين 2 و 6 MΩ تبعاً لحجم الخلية.
  8. لتجنب معطف حركة الأنسجة أثناء تجارب التصحيح-المشبك على سطح قاعة تسجيل مع 0.1% بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد) في المخزن المؤقت بورات.
    1. إعداد 500 مل من المخزن المؤقت بورات (25 مم):
      1. حل ز 4.768 نا2ب4س7ح 102س في 450 مل من النقاوة ح2س في كوب زجاج استخدام المحرض مغناطيسية.
      2. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 8.4 مع HCl.
      3. نقل الحل إلى دورق حجمي 500 مل. ملء قارورة الحجمي مع عالي النقاوة ح2س حتى 500 مل و 0.2 ميكرون فلتر تعقيم الحل باستخدام نظام الشفط المياه.
    2. تحضير حلاً أسهم 1% بي (1 مل بي 50% إلى 49 مل 25 مم بورات المخزن المؤقت) وإضعاف بي 0.1% بتمييع ميليلتر 10 حل الأسهم 1% في 100 ميليلتر من بورات المخزن المؤقت للاستخدام النهائي.
    3. إضافة 2 مل بي 0.1% على الزجاج حامل شريحة واسمحوا للطلاء احتضانها لمدة 1 دقيقة. ثم بإيجاز يغسل الزجاج مرتين مع 5 مل من النقاوة ح2س واسمحوا الهواء الجاف حتى الاستخدام.
  9. إعداد الحلول الامفوتريسين B.
    1. جعل الحل الأسهم 60 ملغ/مل بتذويب 3 ملغ مسحوق الامفوتريسين بفي 50 ميليلتر ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، في أنبوب 1 مل محمية من الضوء. دوامة في السرعة القصوى لمدة 30 ثانية و sonicate لمدة 15 دقيقة مجانسة. تخزين مختبرين في أنابيب 3-5 في-20 درجة مئوية واستخدام قاسمة واحد يوميا.
      ملاحظة: إذا لم يكن الحل الامفوتريسين باﻷسهم واضح والأصفر اللون ولكن حليبي (الأصفر لا يزال) بعد 15 – 20 دقيقة سونيكيشن جعل حل مخزون جديد.
    2. جعل الحل IC مع الامفوتريسين B من بيبيتينج 2 مل من المجتمع الدولي في كوب زجاج نظيفة مع أكثر من قدرة 10 مل. إضافة 8 ميليلتر الامفوتريسين باﻷسهم الحل إلى الحل ماصة، ومزيج من بيبيتينج. التفاف أخلطه مع رقائق الألومنيوم ومكان على الجليد حتى استخدامها وتجديدها كل ح 3.

2-تشريح وتقطيع مع فيبرتوم

  1. إعداد أدوات التشريح قبل تشريح، بما في ذلك واحدة حادة وملقط قوي واحد مع المقص. تنظيف الأدوات (حامل مناديل، فرشاة، الملقط) مع الإيثانول والتأكد من أنها تستخدم فقط لأغراض التشريح، وابدأ على اتصال الأنسجة الثابتة. الاحتفاظ بها في مربع منفصل لتجنب التلوث.
  2. Euthanize الأسماك في المياه الباردة الجليد لمدة 1 دقيقة.
  3. اتبع الخطوات اللاحقة لتشريح الميداكا الدماغ والغدة النخامية بسرعة بالملقط حادة (استخدام لا يزيد عن 3 دقائق).
    1. في حين عقد السمك مع الملقط قوية شديدة الأعصاب البصرية هما وراء العينين مع مقص أو الملقط حادة.
    2. فتح الجزء الظهرية الجمجمة من مؤخرة الجانب الأمامي بكسر عظام الجمجمة خطوة بخطوة مع الملقط قوية.
    3. تقشر الجمجمة على جانب واحد مع الملقط قوية.
    4. شديد على الحبل الشوكي مع مقص أو الملقط حادة.
    5. بلطف، الاستيلاء على الحبل الشوكي مع الملقط والوجه الدماغ من الخلفي إلى الأمامي ووضعه في طبق مع المثلج Ca2 + مجاناً الجماعة الأوروبية.
  4. ملء قالب معدني 1.5 – 2 سم3 مع سائل [اغروس] ووضعه على الجليد.
  5. فقط قبل أن يقوي [اغروس] (في حوالي 25-30 درجة مئوية)، بلطف الاستيلاء على المخ بالحبل الشوكي مع الملقط والجاف الملقط مع قطعة من الورق الجميلة ووضع الأنسجة [اغروس]. مزيج [اغروس] تمييع آثار الجماعة الأوروبية تركت حول الأنسجة وتوجيه الأنسجة واسمحوا العفن على الجليد لبضع ثوان حتى يصلب [اغروس] بسرعة.
    ملاحظة: من الضروري لهذه الخطوة أن تكون سريعة. [اغروس] يتصلب بسرعة كما يتم تبريده العفن معدنية بالجليد.
  6. تقليم كتلة مربعة من [اغروس] التي تحتوي على الأنسجة بشفرة المبضع والصقه على صاحب العينة فيبرتوم استخدام الغراء جراحة (غير سامة).
  7. ملء ومبومو فيبرتوم تلقي صاحب (الدماغ-الغدة النخامية) عينة مع المثلج Ca2 + مجاناً ec.
  8. ضع صاحب العينة إلى فيبرتوم وخفض الكتلة [اغروس] جعل المقاطع باراساجيتال من 150 ميكرومتر، استخدام الترددات العالية وسرعة منخفضة لتمزيقها. تجميع المقاطع المحددة ووضعها في دائرة تسجيل التصحيح-المشبك مع 3 مل من المثلج Ca2 + مجاناً ec.
  9. ضع القيثارة الشبكة (الشكل 2ب) على قسم الأنسجة.
    ملاحظة: القيثارة سوف جنبا إلى جنب مع الطلاء استقرار الأنسجة ومنعه من التحرك خلال تسجيلات المشبك التصحيح.
  10. بعد القيثارة في مكان، تغيير Ca2 + مجاناً المفوضية الأوروبية المتوسطة للمفوضية الأوروبية العادية مع Ca2 + وجيش صرب البوسنة. ترك بقية الأنسجة لمدة 10 دقائق.

3-مثقب التصحيح-المشبك والتسجيلات الكهربية

  1. قبل البدء التجربة، كلوريد الفضة سلك كهربائي بالخطوات التالية: أولاً، استخدام الصنفرة غرامة (p180) لتنظيف أقطاب الأسلاك الفضية. وثانيا، شطف مع 2 مل، إيثانول 70%. ثالثا، تراجع الأسلاك في 2 مل، الكلور 2-5% لمدة 10 دقائق. وأخيراً، شطف مع 2 مل، عالي النقاوة H2o.
  2. ضع دائرة التسجيل مع شريحة الدماغ-الغدة النخامية في مرحلة مجهر وتحديد موقع المنطقة المستهدفة (الغدة النخامية) باستخدام 10 X الهدف وفحص الخلايا باستخدام 40 X الهدف.
    ملاحظة: إذا كان الإعداد بنجاح، يجب أن تكون قليلة جداً من الخلايا جولة مرئية. من هذه الخلايا جولة عادة تلف الخلايا التي يتم فصلها من الأنسجة.
  3. ضع قطب التأريض من خلال جسر أجار 2% إلى حمام المفوضية الأوروبية.
  4. حدد موقع خلية صحية باستخدام هدف X 40.
    ملاحظة: خلية صحية ينبغي إيمانا راسخا تعلق بشريحة الأنسجة ولا تقريب وفصل من الشريحة.
  5. تعيين مكبر للصوت في الجهد-المشبك (اتفاقية فيينا؛ وضع نقطة 4A الشكل 1). فتح الختم اختبار تكوين الحمام نافذة والصحافة (الشكل 4 باء النقطة 1 و 2. استخدام نبضة 5-أم لمراقبة مقاومة ماصة (الشكل 4 باء النقطة 3).
  6. الردم غيض ماصة التصحيح مع الحل IC الحرة المضادة للفطور قبل إضافة الحل IC مع الامفوتريسين باستخدام المحاقن الصغيرة-حشو (انظر الشكل 3).
  7. إضافة ضغط هواء إيجابي طفيف في ماصة التصحيح باستخدام المحاقن 1 مل.
    ملاحظة: وهذا يجعل تدفق سائل صغيرة من ماصة التصحيح التي تجنب تلوث الحافة.
  8. مرة واحدة في الحمام، تقييم مقاومة ماصة التصحيح والتأكد من لا جزيئات ترتبط غيض الماصة (الشكل 4).
    ملاحظة: يتم إرفاق قطعة صغيرة من الشريط على شاشة عرض النموذج تسجيل الفيديو مجال الرؤية. وهذا يجعل الموضع من ماصة التصحيح بالنسبة للخلية أسهل عندما لا تركز في الخلية الهدف.
  9. دليل ماصة التصحيح وصولاً إلى الخلية باستخدام ميكرومانيبولاتورس.
    ملاحظة: تأكد من أن الماصة نظيفة بالبحث عن الجسيمات الصغيرة التي قد تعلق على تلميح الماصة. التغيرات المفاجئة في المقاومة قد تكون أيضا نتيجة لجسيمات عالقة في تلميح ماصة.
  10. تعديل ماصة عند عدد قليل ميكرون فوق الخلية حيث أنه سوف غيض ماصة اللمس الخلية 1/3 من منتصف الخلية، كما هو موضح في الشكل 5. عند لمس الخلية، الإفراج عن الضغط وتطبيق الشفط لطيف لجعل ختم.
    ملاحظة: الوقت من ماصة التصحيح يدخل الحمام لناجحة ينبغي أن يوضع خاتم قصيرة قدر الإمكان. لا أكثر من 1 – 1.5 دقيقة بغية تجنب الامفوتريسين بالتوصل إلى طرف الماصة وتسرب في الحمام.
  11. قم بالتبديل إلى إطار التصحيح في برامج التصحيح-المشبك (النقطةرقم 4 د 1) على الفور وعلى إمكانية عقد بين أم-50 و-60 (النقطة 2 منالشكل 4 ). صفر السعة السريع الذي يتكون من ماصة زجاجية (النقطة 3 منالشكل 4 ).
  12. التبديل إلى إطار الخلية في برامج التصحيح-المشبك (الرقم 4E النقطة 1 و 2) والبدء في رصد وصول المقاومة، جمهورية أرمينيا، المعروضة في الإطار. صفر خارج الغشاء السعة في برنامج مكبر للصوت (الرقم 4E النقطة 3) بعد وصول كافية.
    ملاحظة: قد يستغرق وصول كافية 10 إلى 30 دقيقة (الرقم 4E النقطة 2). ينبغي أن يكون منفذ جيد لتسجيلات المشبك الحالية أدناه 20 مترا.
  13. قم بالتبديل إلى الحالي المشبك، IC، في إطار برنامج مكبر للصوت (الرقم 4F النقطة 1). ضبط التيارات سعوية تعمل بسرعة في إطار برنامج مكبر للصوت (الرقم 4F نقطة 2 و 3) إلى نفس القيمة كما هو الحال في 3.12 -المشبك . التحقق من إمكانات غشاء (الرقم 4F النقطة 1).
    ملاحظة: الأهم من ذلك، إذا كان الغشاء المحتملة الضحلة (نموذجي أعلاه-35 mV) الخلية قد يكون معطوباً. إلغاء التسجيل والبحث عن خلية جديدة.
  14. بعد العثور على خلية صحية (المرفقة بحزم للأنسجة مع غشاء المحتملة أدناه-40 mV)، تبدأ التسجيلات التجريبية كما هو مفصل في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة،من 3334.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح هذا البروتوكول بروتوكول خطوة بخطوة عن كيفية تحقيق موثوق بها التسجيلات الكهربية من خلايا الغدة النخامية (جونادوتروبي)، باستخدام خط الميداكا المعدلة وراثيا [تيراغرام (لهب-هرجفبيي)] حيث الخلايا المستهدفة (Lh المنتجة جونادوتروبيس) تتم تسمية مع البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل).

في البداية، أجريت التحقيقات الكهربية باستخدام التكوين كامل الخلية. ومع ذلك، لوحظت إمكانات العمل العفوي لا في أي من الخلايا المدروسة. في مجموعة فرعية خلايا، يمكن أن تسبب إمكانات العمل استخدام الحقن الحالية الصغيرة (5-9 باسكال) من إمكانات راحة بين أم-50 و-60 (الشكل 6). إمكانات العمل هذه قد المتهدمة سريعة، وبعد حوالي 4 – 6 دقيقة المشغلة إمكانات العمل لم يعد ممكناً. ويمكن تفسير المتهدمة سريعة لا سيما لاحظ بحجم الخلية الصغيرة. وبصفة عامة، أن خلايا الغدة النخامية أصغر من الخلايا العصبية 30. على سبيل المثال، متوسط السعة غشاء من جونادوتروبي الخلايا تتراوح بين 4 و 10 pF 3،،من3035. مشابهة لهذه النتائج التي توصل إليها الميداكا الخلايا جونادوتروبي كان غشاء متوسط سعة (يعني ± S.D) 3.4 ± 0.9 الجبهة الوطنية (n = 67).

التحول إلى التكوين التصحيح مثقبة باستخدام الامفوتريسين B، لوحظت إمكانات العمل العفوي في حوالي 50% الخلايا مسجل (الشكل 7A, n = 63 الخلايا من الحيوانات 21). وعلاوة على ذلك، يمكن أن تسبب إمكانات العمل في 95% من هذه الخلايا مع لا المتهدمة يمكن ملاحظتها حتى بعد تسجيلات مطولة (ما يصل إلى 1 ساعة). الأهم من ذلك، من أجل تحقيق تسجيلات موثوقة وعالية الجودة، من الضروري أولاً ملء التلميح مع الحل IC خالية من مضاد. إذا كانت كميات صغيرة من الأنواع الهروب نصيحة ماصة قبل جيجاسيل، فإنه يمكن أن تلحق الضرر الخلية الهدف كالخلايا المحيطة كما جيدا.

من أجل اختبار إذا كانت قادرة على الاستجابة لهرمون إطلاق سراح الرئيسي على الخلايا في تكوين التصحيح مثقبة، طبقنا 1 ميكرومتر Gnrh1 نفخة إخراج في الخلايا الهدف. وأجريت التجارب في المشبك الحالية للسماح لنا برصد التغيرات في الجهد. وكشفت هذه التجارب استجابة ثنائية الطور (الشكل 7ب). هو المرحلة الأولى فرط الاستقطاب فيها إطلاق سراح Ca2 + من المخازن الداخلية تفعيل قنوات Ca2 + تنشيط ك+ مما تسبب في فرط الاستقطاب. ويتبع المرحلة الأولى depolarization وتواتر زيادة إمكانات العمل من 1 – 2 هرتز إلى حوالي 3 هرتز. في بعض التسجيلات، كان المرحلة الثانية إمكانات الهضبة زائف حيث لوحظت زيادات صغيرة 2 أو 3 قبل ريبولاريزيشن.

Figure 1
الشكل 1 : الفرق بين تكوينات التصحيح مثقب (ب) أسلوب التصحيح-المشبك وكامل الخلية (A). في تكوين كل خلية (A)، بعد جيجاسيل في مكان، يتم إجراء ثقب في الغشاء عن طريق تطبيق ضغط سلبي صغيرة إلى ماصة التصحيح. في هذا التكوين، يمكن أن تضعف الجزيئات داخل الخلايا الهامة مثل إشارات الجزيئات في المحلول ماصة التصحيح مما يؤثر على الاستجابات الكهربائية والفيزيولوجية للخلية. هذه الظاهرة أكثر أهمية في زنزانات صغيرة، مثل خلايا الغدة النخامية. وفي المقابل، في تكوين التصحيح مثقب (ب)، بعد جيجاسيل، تماس كهربائي بين في سيتوسول والتصحيح ماصة يتكون من الأنواع أو التوتر السطحي. مضاد أو الفاعل تم تحميله إلى ماصة التصحيح قبل التصحيح وسوف تدمج في غشاء البلازما تحت التصحيح، تثقيب الغشاء، مما يسمح فقط من جزيئات صغيرة مثل أيونات الفموي الأحادي التكافؤ لتمرير ذلك ببطء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : صور من الجسر أجار (A) والقيثارة (ب) المستخدمة في البروتوكول. مقياس في مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : سد للتصحيح-الماصة. (A) المضادة للفطور مجاناً IC الحل (السائل الأزرق) تردم قوات الشعرية نظراً خيوط داخل الماصة. (ب) بعد ملء نصيحة ماصة مع IC الحرة المضادة للفطور، الجزء الخلفي من ماصة مليء بالحل IC تحتوي على الامفوتريسين ب (سائل أصفر) باستخدام إبرة محقن (حشو الصغرى). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4A
الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4B
الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4C
الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4D
الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4E
الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4F
الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4 : لقطات من البرامج- (أ) عرض مكبر للصوت البرمجيات النافذة. 1-يبرز (دائرة حمراء) منطقة وضع يسمح للتبديل بين الجهد المشبك (VC)، المشبك الحالية دون أي حقن الحالية (أنا = 0) والمشبك الحالية مع إمكانية للحقن الحالية (IC). ويبرز 2 (دائرة حمراء) مجال لتعديل سريع بالسعة الحالية المشبك الجهد، فضلا عن التعديلات الحالية سعوية تعمل بكامل الخلية. (ب) يبين برنامج التصحيح-المشبك مع نافذة اختبار الغشاء مفتوح. 1-يبرز (دائرة حمراء) الزر اختبار الغشاء. 2-يبرز (دائرة حمراء) تكوينات مختلفة نبض وحمام، والتصحيح، والخلية. 3-ويبرز (دائرة حمراء) نبض التكوين السعة والتردد. ويبين (ج-F) أرملة الجمع بين برامج التصحيح-المشبك (يسار) والبرمجيات (يمين) مكبر للصوت. (ج) يبرز (دائرة حمراء) المقاومة عندما يكون الماصة في الحمام والسليم التأريض باستخدام جسر أجار (في وضع حمام). (د) 1. ويبرز (دائرة حمراء) التبديل إلى وضع التصحيح عقب جيجاسيل. 2-ويبرز (دائرة حمراء) نبض التكوين (10 mV نبض) وإمكانية إجراء تعديل إلى-60 أم. 3-يبرز (دائرة حمراء) النافذة لتصحيح أو التصفير تيارات سعوية تعمل بسرعة بعد ختم جيجا. (ﻫ) 1. ويسلط الضوء على (دائرة حمراء) وضع الخلية المستخدمة لرصد المقاومة الوصول. 2 يسلط الضوء على (دائرة حمراء) المعلمات الخلية، غشاء السعة (سم)، وختم الجودة (Rm)، الوصول إلى المقاومة (Ra)، وقت ثابت (تاو) وعقد الحالي (عقد). 3-يبرز (دائرة حمراء) الزر الخاص بتصحيح تيارات سعوية الغشاء. (و) 1. ويسلط الضوء على (دائرة حمراء) وضع IC لرصد غشاء المحتملة. 2-ويبرز (دائرة حمراء) على زر للتبديل إلى تسويات المشبك الحالية (I-المشبك). 3-يبرز (دائرة حمراء) النافذة لتصحيح تيارات سعوية تعمل بسرعة.

Figure 5
الشكل 5 : صورة مجهرية من تصحيح-المشبك التسجيل في خلية الغدة النخامية باستخدام التكوين التصحيح مثقب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : تسجيلات المشبك الحالية من بروتينات فلورية خضراء المسمى Lh منتجة للخلية بعد الحقن الحالية باستخدام التكوين كامل الخلية العادية- وأبقى الخلايا بين أم-50 و-60. يمكن أن تسبب إمكانات العمل النموذجية في مجموعة فرعية خلايا باستخدام الحقن الحالية السلطة الفلسطينية 5 – 10 فورا بعد تحقيق الوصول إلى الخلية (تتبع السوداء). بعد 1 – 3 دقيقة بدأت السعة إمكانات العمل تنخفض، علامة نموذجية من الخلاصة (تتبع السماوي). بعد 4 – 6 دقيقة اختفت السعة إمكانات العمل تماما تقريبا (أرجواني التتبع). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 : المشبك الحالي تسجيل من خلية إنتاج بروتينات فلورية خضراء المسمى Lh استخدام تكوين التصحيح مثقبة، بعد التحفيز مع تروج – الإفراج عن هرمون Gnrh1. (أ) تسجيل المشبك الحالية مما يدل على إمكانات العمل العفوي من خلية جونادوتروبي Lh منتجة. استجابة ثنائية الطور (ب) حيث التحفيز Gnrh1 ل 10 s أولاً المستحث فرط الاستقطاب في غشاء الخلية متبوعاً ديبولاريزيشن وزيادة إطلاق التردد (من 1 – 2 هرتز إلى 3 هرتز) من إمكانات العمل في خلية التي أطلقت سابقا إمكانات العمل العفوي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التسجيلات الكهربية باستخدام تقنية التصحيح-المشبك على شرائح المخ--الغدة النخامية تتطلب التحسين الدقيق. بروتوكولات جيدا الأمثل لإجراء تحقيقات خلية يعيش على وجه التحديد في اريوكروماس محدودة، مع غالبية المنشورات باستخدام البروتوكولات القائمة على نظم الثدييات. وفي هذا الصدد، من المهم أن تدرك حقيقة أن العديد من المعلمات الفسيولوجية مثل درجة الحموضة و osmolality ليس فقط الأنواع معتمدة، ولكن أيضا يتوقف إلى حد كبير على ما إذا كان الكائن الحي في السؤال تعيش على الأرض أو في المياه. للأسماك، ومن الضروري أيضا، أن تأخذ في الاعتبار، إذا كانوا يعيشون في بيئة البحرية أو المياه العذبة. على سبيل المثال، أقل بكثير في الأسماك مقارنة بالثدييات بمستويات تتراوح بين 1.7 – 3.4 ملم زئبق pCO2 في الأسماك و 40 – 46 ملم زئبق pCO2 في الثدييات 36الضغط الجزئي2 CO. وبناء على هذا، نحن ضبط درجة الحموضة إلى 7.75 37،،من3839،40 في جميع الحلول المستخدمة في البروتوكول الحالي. نستخدم أيضا حبيس المخزن المؤقت، فقد ثبت أن تمتلك قدرات التخزين المؤقت ممتازة في منطقة الأس الهيدروجيني 7.4 – 7.8 41. Osmolality، نستخدم في موسم 290 – 300 وما قد تم قياسه في البيئة خارج الخلية الميداكا 42. لقد تم اختيار درجة الحرارة المستخدمة خلال التسجيلات الكهربية وفقا لبيئة الأسماك. وفي الواقع، يعيش الميداكا في المياه مع طائفة واسعة من درجات حرارة (من 4 إلى 40 درجة مئوية)، بينما في المختبر تنشئتهم في بيئة تسيطر عليها في 26-28 درجة مئوية. وبناء على هذا، أجرينا لدينا التسجيلات في درجة حرارة الغرفة (حوالي 25 درجة مئوية)، تختلف عن ما يتم استخدام أنسجة الثدييات (37 درجة مئوية) أو لأنواع أسماك المياه الباردة مثل سمك القد الأطلسي (12 درجة مئوية) 18.

لتكون قادراً على التصحيح خلايا الغدة النخامية، من الضروري إنشاء شرائح الأنسجة السليمة. لا بد من استخدام أدوات نظيفة (حامل مناديل، فرشاة، الملقط، إلخ) التي فقط على اتصال الأنسجة الحية (مجاناً نسيجية). تشريح سريع للدماغ والغدة النخامية وحفظ الأنسجة في درجة حرارة منخفضة (4 درجات مئوية) بينما تشريح وتقطيع عوامل رئيسية أخرى لتوفير أقسام قابلة للحياة. كما ينبغي إيلاء اهتمام خاص إلى درجة حرارة [اغروس] عند تضمين الأنسجة. [اغروس] حارة جداً يمكن أن يلحق الضرر الأنسجة بينما الباردة جداً [اغروس] لن اترك لكم الوقت لتوجيه الأنسجة لتقطيع مناسب. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تقطيع مع حل الجماعة الأوروبية دون Ca2 + لتجنب الخلايا التالفة بعد تمزيقها للدخول في المبرمج. السطح غير ضروري، ولكن ينبغي أن تجمع شرائح الأنسجة مباشرة بعد تمزيقها. اترك الشريحة حوالي 15 دقيقة بعد تمزيقها للسماح للخلايا الراحة قليلاً قبل التصحيح.

الأسماك تيليوست نماذج ممتازة للتحقيق في خصائص الكهربية من خلايا الغدة النخامية. وفي الواقع، خلافا للثدييات والطيور، الأسماك لا تمتلك نيافة وسيط، بمعنى أن الخلايا العصبية طائي التحكم في الغدة النخامية مباشرة المشروع على محاور عصبية على الخلايا المستهدفة على 32. وهكذا في شريحة الدماغ-الغدة النخامية، تمسك خلايا الغدة النخامية في بيئة سليمة أكثر مقارنة بالثقافات الخلية الغدة النخامية الأولية حيث يتم فصل الخلايا باستخدام العلاجات الكيميائية والميكانيكية. من المثير للاهتمام، باستخدام شرائح المخ--الغدة النخامية من الميداكا، يمكن أن نلاحظ أن زيادة إمكانات العمل إطلاق التردد في خلايا ناحية اليسار، عند التنشيط Gnrh1، (الشكل 5). هذه الملاحظات بالاتفاق مع ما قيل في دراسات الثقافة خلايا الغدة النخامية من منطقتنا مختبر 29 تشير إلى أن استخدام الثقافات الخلية الغدة النخامية الأولية ذات الصلة لا تزال تميز خصائص الغشاء من خلايا الغدة النخامية. ومع ذلك، شرائح المخ--الغدة النخامية تسمح لنا بالدراسة أيضا الآثار غير المباشرة لمركبات مختلفة فضلا عن التفاعلات بين الخلايا، كما أنها تحتفظ باتصالات الهيكلية التي تضيع في الثقافات الخلية الغدة النخامية الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إعداد شريحة أسرع لإعداد مقارنة بثقافة ينتابها الابتدائية خلية، ويمكن إجراء التسجيلات الكهربية في 30 دقيقة التالية بعد تشريح. وهذا يعني، خلافا لثقافة خلية الأولية، يمكن أن تعالج إيقاعات circadian بطريقة ذات معنى باستخدام الشرائح الطازجة.

بسبب صغر حجم خلايا الغدة النخامية في الأسماك (السعة غشاء حول الجبهة الوطنية 3-10)، والملاحظات الخاصة بنا تظهر أن الخلايا جونادوتروبي تفقد قدرتها على إطلاق إمكانات العمل (الشكل 3)، وهكذا تفقد قدرتها على الاستجابة ل الإفراج عن الهرمونات عند تسجيل في تكوين كل خلية، قررنا استخدام وتقديم تقنية تصحيح مثقبة هنا. وفي الواقع، لقد ثبت التكوين كامل الخلية التي يمكن أن تؤدي إلى انتشار جزيئات هيولى الهامة وبالتالي تغيير خصائص الخلية الكهربية 13. استخدام بدلاً من تكوينات التصحيح مثقب مع الامفوتريسين B إلى انثقب غشاء الخلية إلى ماصة التصحيح، مما يجعل الثقوب الصغيرة فقط السماح فقط الأيونات الصغيرة بالمرور عبر 15،،من1643، 44، ونحن يمكن أن تجنب هذا التخفيف وسجل النشاط الكهربائي للخلية لفترة طويلة.

هو نقطة هامة في أسلوب التصحيح مثقبة لأول مرة أخرى--تعبئة الماصة مع الحل IC دون الأنواع بغية تجنب إطلاق الأنواع في المتوسط وتلف الخلايا كل قسم في حين يقترب مع ماصة التصحيح. في الواقع، بسبب الضغط الإيجابي التي تطبق على ماصة التصحيح أثناء اقتراب الأنسجة، هو تسرب بعض السائل من خلال ماصة التصحيح حتى يتم إجراء التصحيح. هذا التدفق يساعد على الاحتفاظ نصيحة نظيفة حتى تصل إلى الخلية المستهدفة ولكن إذا أفرج عن مضاد في المتوسط قبل التصحيح، فإنه يمكن أن التسلخات جميع أغشية جميع الخلايا، تغيير شكل كبير خصائص نفاذية أغشية الخلايا وبالتالي خصائصها الكهربائية.

وقد الأمثل الإجراء المقدم واستخدمت بنجاح في دراسة النشاط الكهربائي لخلايا جونادوتروبي الميداكا. وبالإضافة إلى ذلك، قد تستخدم البروتوكول لدراسة جميع أنواع الخلايا (الغدد الصماء) وجدت في الغدة النخامية الميداكا وغيرها من الأنواع السمكية تيليوست. ضع في اعتبارك إلا أنه يتعين تعديل osmolality ودرجة الحموضة من جميع الحلول لسوائل الجسم من الأنواع المعنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgments

ونشكر السيدة لورديسكاريون ز تان لمساعدة لها صيانة المرفق الميداكا وبلتيير أنتوني لأرقام توضيحية. تم تمويل هذا العمل نمبو، ومجلس البحوث في النرويج، أرقام المنح 244461 (برنامج تربية الأحياء المائية) و 248828 (برنامج النرويج الحياة الرقمية).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000 S
Chirurgical glue WPI VETBOND 3M Vetbond Tissue Adhesive
Stainless steel blades Campden Instruments 752-1-SS
metal molds SAKURA 4122
steel harp Warner instruments 64-1417
PBS SIGMA D8537
Ultrapure LMP agarose invitrogen 166520-100
patch pipettes Sutter Instrument BF150-110-10HP Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
Microscope Slicescope Scientifica pro6000
P-Clamp10 Molecular Devices #1-2500-0180 sofware
Digitizer Digidata 1550A1 Molecular Devices DD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B
GnRH Bachem 4108604 H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt 
pipette puller Sutter Instrument P-1000
amphotericin B SIGMA A9528 pore-forming antibiotic
polyethylenimine  SIGMA P3143 50% PEI solution
microfiler syringe WPI MF28/g67-5
glass for the agar bridge Sutter Instrument BF200-116-15 Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager software Open Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS camera Qimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicator Elma D-7700 singen
NaCl SiGMA S3014
KCl SiGMA P9541
MgCl2 SiGMA M8266
D-Glucose SiGMA G5400
Hepes SiGMA H4034
CaCl2 SiGMA C8106
Sucrose SiGMA 84097
D-mannitol SiGMA 63565
MES-acid SIGMA M0895
BSA SIGMA A2153

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
  2. Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
  3. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
  4. Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
  5. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
  6. Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
  7. Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  8. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  9. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  10. Neher, E. Techniques in cellular physiology. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  13. Marty, A., Neher, E. Single Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).
  14. Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
  15. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  16. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  17. Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
  18. Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. US. 3-35 (1983).
  20. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  21. Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
  22. Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
  23. Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
  24. Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
  25. Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
  26. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
  27. Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
  28. Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
  29. Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
  30. Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
  31. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
  32. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
  33. pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
  34. MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
  35. Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
  36. Schmidt-Nielsen, K. Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , Cambridge university press. 613 (1997).
  37. Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).
  38. Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
  39. Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
  40. Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
  41. Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
  42. Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12 (2016).
  43. Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
  44. Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).

Tags

علم الأعصاب، العدد 138، الدماغ-الغدة النخامية، شريحة الأنسجة، الكهربية، والأسماك، والتصحيح-المشبك، خلايا الغدد الصماء
شرائح المخ--الغدة النخامية سليمة للتحقيقات الكهربية من خلايا الغدة النخامية في الأسماك تيليوست
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien,… More

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. J. Vis. Exp. (138), e57790, doi:10.3791/57790 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter