Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Sund hjerne-hypofyse skiver for elektrofysiologiske undersøgelser af hypofyse celler i Teleost fisk

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57790
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Artiklen beskriver en optimeret protokol for at gøre levedygtige hjerne-hypofyse væv skiver, ved hjælp af teleost fisk medaka (Oryzias latipes), efterfulgt af elektrofysiologiske optagelser af hypofyse celler ved hjælp af patch-clamp-teknik med den perforeret patch configuration.

Abstract

Elektrofysiologiske undersøgelser af hypofyse celler er blevet gennemført i adskillige vertebrater, men meget få i teleost fisk. Blandt disse er blevet udført et klart flertal på dissocierede primærelementer. For at forbedre vores forståelse af hvordan teleost hypofyse celler, opfører sig i en mere biologisk relevante miljø, viser denne protokol Sådan Forbered levedygtige hjerne-hypofyse skiver ved hjælp af små ferskvandsfisk medaka (Oryzias latipes). Gør hjernen-hypofyse skiver, blev pH og osmolalitet af alle løsninger justeret til værdier fundet i kropsvæsker ferskvands fisk lever ved 25-28 ° C. Efter skive forberedelse viser protokollen hvordan man fører elektrofysiologiske optagelser ved hjælp af perforeret hele-celle patch-clamp-teknik. Patch-clamp-teknik er et kraftfuldt værktøj med hidtil uset tidsmæssige opløsning og følsomhed, giver mulighed for undersøgelse af elektriske egenskaber fra intakt hele celler ned til enkelt Ionkanaler. Perforeret patch er enestående i, at det holder den intracellulære miljø intakt forhindrer regulerende elementer i cytosol i bliver fortyndet af patch pipette elektrode løsning. Derimod når du udfører traditionelle hele-celle optagelser, blev det observeret, at medaka hypofyse celler hurtigt mister deres evne til at fyre handling potentialer. Blandt de forskellige perforering teknikker til rådighed demonstrerer denne protokol hvordan man kan opnå perforation af lappet membranen ved hjælp af fungicid Amphotericin B.

Introduction

Hypofysen er en vigtige endokrine orgel i hvirveldyr placeret under hypothalamus og posteriort for den optiske chiasm. Det producerer og udskiller seks til otte hormoner fra de specifikke celletyper. Hypofyse hormoner udgør en mellemting mellem hjernen og perifere organer og køre en lang række væsentlige fysiologiske processer, herunder vækst, reproduktion og reguleringen af homeostase. Svarende til neuroner, endokrine celler af hypofysen er elektrisk overgearet med evnen til at fyre handling potentialer spontant 1. Rollen, som disse handling potentialer er celle afhængige. I flere celletyper af pattedyr hypofysen, kan handling potentialer løfte den intracellulære Ca2 + tilstrækkeligt til en vedvarende frigivelse af hormonet 2. Derudover modtager hypofysen både stimulerende og hæmmende oplysninger fra hjernen, der påvirker membranen potentiale celler 3,4,5,6. Typisk, stimulerende input øger ophidselse og ofte indebærer frigivelsen af Ca2 + fra intracellulære butikker samt øget fyring frekvens 7. Forstå, hvordan cellen udnytter ion-kanal sammensætning og tilpasser sig disse input signaler fra hjernen er nøglen til forståelse hormon syntese og frigivelse.

Patch-clamp-teknik blev udviklet i slutningen af 1970 ' erne af Sakmann og Neher 8,9,10 og yderligere forbedret ved Hamill 11, og giver mulighed for detaljerede undersøgelser af elektrofysiologiske egenskaber af celler ned til enkelt Ionkanaler. Teknikken kan desuden bruges til at studere både strøm og spænding. I dag, er patch-fastspænding guld standard for måling af elektrofysiologiske egenskaber af cellen. Fire store konfigurationer af tæt forsegling patch-clamp-teknik har været udviklede 11; celle-attached, indefra og ud, udenfor-out og hele-cell-patch. De tre første konfigurationer bruges typisk til enkelt ion-kanal undersøgelser. For det fjerde, efter den celle-attached konfiguration, er et hul i cellemembranen lavet ved hjælp af sub atmosfærisk tryk. Denne konfiguration giver også mulighed for undersøgelser af ion-kanal sammensætning af hele cellen 12. En begrænsning af denne teknik er imidlertid at cytoplasmatisk molekyler udvandes af den patch pipette løsning 13 (fig. 1A), hvilket påvirker de elektriske og fysiologiske reaktioner i de undersøgte celler. Faktisk, nogle af disse molekyler kan spille en vigtig rolle i transduktion af signalet eller regulering af forskellige Ionkanaler. For at undgå dette, udviklet Lindau og Fernandez 14 en metode, hvor en poreformede sammensatte føjes til patch pipette. Efter den celle-attached konfiguration, vil sammensat indarbejde i plasma membranen under patch og langsomt perforere membran skabe elektrisk kontakt med cytosol (figur 1B). Flere forskellige svampemidler såsom nystatin 15 og amphotericin B 16eller overfladeaktive stoffer såsom saponin beta-escin 17,18 kan bruges. Disse forbindelser oprette porer stor nok til at tillade monovalent kationer og Cl- diffusion mellem cytosol og patch pipette samtidig bevare de cytosole niveauer af makromolekyler og større ioner som Ca2 + 15, 16.

Udfordringen ved hjælp af perforeret patch er potentielt høje serie modstand. Serien modstand (Rs) eller adgang modstand er den samlede modstand over patch pipette i forhold til jorden. Under patch-clamp optagelser, Rasmussens vil være parallelt med membran modstand (Rm). Rm og Rs i sideløbende arbejde som en spænding skillevæg. Med høj Rasmussens, vil spændingen falder over Rs give fejl i optagelserne. Fejlen vil blive større med større strømme registreres. Spænding skillevæg er derudover også frekvens afhænger af, at skabe en lav-pass filter, således påvirke den tidsmæssige opløsning. I realiteten kan den perforerede patch ikke altid muligt at optagelser af store og hurtige strømninger som spændingen gated Na+ strømme (for detaljeret aflæsninger Se reference 19). Også, Rasmussens kan variere under patch-clamp optagelser, igen fører til ændringer i den registrerede aktuelle. Således er kan falske positiver opstå i situationer hvor Rs ændringer under stof ansøgning.

Elektrofysiologi på skiver væv blev introduceret af Andersen lab at studere elektrofysiologiske egenskaber af neuroner i hjernen 20. Teknikken, der banede vejen for detaljerede undersøgelser af enkelt celler samt celle-celle kommunikation og celle kredsløb i en mere intakt miljø. En lignende teknik til at gøre hypofyse skiver blev indført i 1998 af Guérineau et al. 21. det var dog ikke før 2005, at hjernen-hypofyse skive forberedelse blev brugt med succes til patch-clamp undersøgelser i teleost 22. I denne undersøgelse rapporterede forfatterne også brugen af perforeret patch-clamp optagelser. Men langt de fleste af de elektrofysiologiske undersøgelser af hypofyse celler er blevet ført i pattedyr, og kun en håndfuld andre hvirveldyr, herunder teleost fisk 1,2,22,23 . I teleosts, blev næsten alle undersøgelser udført på primære dissocierede celler 24,25,26,27,28,29,30 .

I det foreliggende papir skitsere vi en optimeret protokol for forberedelse af sund hjerne-hypofyse skiver fra model fisk medaka. Metoden repræsenterer flere fordele i forhold til primære dissocierede cellekulturer. Først, registreres cellerne i et relativt konserveret miljø i forhold til dissocieres celle kultur betingelser. Andet, Skive præparater tillade os at studere indirekte veje medieret af celle-celle kommunikation 22, som er ikke muligt i dissocierede celle kultur betingelser. Desuden demonstrere vi, hvordan man gennemføre elektrofysiologiske optagelser på de opnåede væv skiver med perforeret hele-celle patch-clamp-teknik med amphotericin B som poreformede agent.

Medaka er en lille ferskvandsfisk native til Asien, især findes i Japan. Fysiologi, embryologi og genetik af medaka er blevet grundigt undersøgt for over 100 år 31, og det er et almindeligt anvendt forskning model i mange laboratorier. Af særlig betydning for dette dokument er de forskellige morfologiske organisation af hypothalamus-hypofyse-kompleks i teleost fisk: boer i pattedyr og fugle af hypothalamus neuroner frigive deres neuro-hormoner regulerer hypofysens endokrine celler ind i den portal systemet af medianen eminence er der en direkte nervøs projektion af hypothalamus neuroner på de endokrine celler af hypofysen i teleost fisk 32. Således er nøje gennemført hjerne-hypofyse udskæring af særlig betydning i fisk, så vi kan undersøge elektrofysiologiske egenskaber af hypofyse cellerne i et velbevaret hjerne-hypofyse-netværk, og især hvordan hypofyse celler styre deres ophidselse og dermed Ca2 + homøostase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr håndtering blev udført efter anbefalinger til pleje og dyrevelfærd, forskning på det norske Universitet af biovidenskab og under tilsyn af autoriserede efterforskere.

1. fremstilling af instrumenter og løsninger

Bemærk: Alle løsninger skal være steril. Omhyggelig opmærksomhed bør gives til pH og osmolalitet (osmol/kg vand) af alle løsninger, som bør være nøje tilpasset det ekstracellulære miljø af de undersøgte arter. pH og osmolalitet bør justeres med præcis elektronisk udstyr såsom pH-meter og frysepunkt osmometer henholdsvis.

  1. Gøre 500 mL af ekstra-cellulære løsning uden Ca2 + (Ca2 + gratis EF): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, 4 mM glukose, 10 mM Hepes.
    1. 4,38 g NaCl, 186.37 mg af KCl, 61.89 mg af MgCl2, 360.32 mg af glukose og 1,19 g af HEPES i 450 mL i ultrarent opløses (0,055 kr. / cm ved 25 ° C, resistivitet på 18.2 MOhm) H2O i et glas bægerglas ved hjælp af en magnetisk omrører.
    2. PH indstilles til 7,75 med NaOH.
    3. Opløsningen overføres til en 500 mL målekolbe. Fyld den målekolbe med laves H2O indtil 500 mL.
    4. Bland opløsningen godt før måling af osmolalitet. Justere til 290-300 mOsm med mannitol. Filter sterilisere den løsning ved hjælp af vand vakuum system og 0,2 µm filter.
  2. Gøre 500 mL af ekstra-cellulære løsning (EF): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM glukose, 10 mM Hepes.
    1. Opløse 4,38 g NaCl, 186.37 mg af KCl, 147.01 mg CaCl2, 61.89 mg af MgCl2, 360.32 mg af glukose og 1,19 g af HEPES i 450 mL i ultrarent H2O i et glas bægerglas ved hjælp af en magnetisk omrører.
    2. PH indstilles til 7,75 med NaOH.
    3. Opløsningen overføres til en 500 mL målekolbe. Fyld den målekolbe med laves H2O indtil 500 mL.
    4. Bland opløsningen godt før måling af osmolalitet. Justere til 290-300 mOsm med mannitol. Filter sterilisere den løsning ved hjælp af vand vakuum system og 0,2 µm filter.
  3. Gøre 500 mL af ekstra-cellulære løsning med 0,1% bovint serumalbumin (EF med BSA): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM glukose, 10 mM Hepes.
    1. Opløse 4,38 g NaCl, 186.37 mg af KCl, 147.01 mg CaCl2, 61.89 mg af MgCl2, 360.32 mg af glukose og 1,19 g af HEPES i 450 mL i ultrarent H2O i et glas bægerglas ved hjælp af en magnetisk omrører.
    2. PH indstilles til 7,75 med NaOH.
    3. Opløsningen overføres til en 500 mL målekolbe. Fyld den målekolbe med laves H2O indtil 500 mL.
    4. Bland opløsningen godt før måling af osmolalitet. Justere til 290-300 mOsm med mannitol. Filter sterilisere den løsning ved hjælp af vand vakuum system og 0,2 µm filter. Tilføje 50 mg BSA.
  4. Gøre 250 mL af intracellulære løsning (IC): 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, 20 mM saccharose.
    1. Opløse 1,54 g KOH, 327.75 mg af KCl, 595.75 mg af HEPES og 1.712 g saccharose i 450 mL i ultrarent H2O i et glas bægerglas ved hjælp af en magnetisk omrører.
    2. PH indstilles til 7,2 med (N-morpholino) Ethan sulfonsyre (MES) syre.
    3. Opløsningen overføres til en 250 mL målekolbe. Fyld den målekolbe med laves H2O indtil 250 mL.
    4. Bland opløsningen godt før måling af osmolalitet. Justere til 280-290 mOsm (10 mOsm lavere end EF) med saccharose. Filter sterilisere den løsning ved hjælp af vand vakuum system og 0,2 µm filter.
  5. Gøre 100 mL 2% lavt smeltepunkt Agarosen opløsning i Ca2 + og BSA gratis EF (2 g af lav smeltepunkt Agarosen i 100 mL af Ca2 + gratis EF). Opløses med en mikroovn og placere den smeltede Agarosen i et vandbad ved 40 ° C. Lad det køle ned indtil 40 ° C før anvendelse på væv.
    Bemærk: EF, Ca2 + gratis EF kan opbevares ved 4 ° C for flere uger hvis sterile og IC løsninger ved-20 ° C, i flere måneder. Agarosen kan opbevares i en uge ved 4 ° C og kan genbruges 3 – 5 gange af kortvarigt mikrobølgeovn. Overdreven genbrug vil føre til fordampning og ændring af Agarosen og salt koncentration og kvalitet.
  6. Gøre agar bridge:
    1. Varme 7,5 mm lang borsilikatglas kapillærer med udvendig diameter (OD) 2 mm og indvendig diameter (I.D.) 1.16 mm ved hjælp af en bunsenbrænder på en fokal pege omkring 1/3 fra den ene ende indtil glasset begynder at bøje. Fjerne glasset fra flammen og lade glasset til at bøje med en vinkel på omkring 120 grader (fig. 2A).
    2. Smelt 2% agar i normal EF uden glukose ved hjælp af en mikrobølgeovn, og mens Agarosen er flydende fyld pre-made glasset kapillær bruger kapillarvirkning styrker ved at sætte en af enderne af glasset i væsken og venter på få minutter. Gemme broer indtil brug ved 4 ° C i EF uden glukose.
  7. Forberede borsilikatglas med glødetråd patch pipetter ved hjælp af en egnet pipette puller. Se i brugervejledningen til den pipette aftrækker at opnå den ønskede elektrode modstand.
    Bemærk: Tilspidsning af pipetten bør være så kort som muligt. Korte pipette taper opnås ved hjælp af 4-6 trækker trin. Den elektrode modstand skal være mellem 2 og 6 MΩ afhængigt af Cellestørrelse.
  8. For at undgå bevægelse af væv under patch-clamp eksperimenter coat overfladen af optagelse kammer med 0,1% af polyethylenimine (PEI) i Borat buffer.
    1. Forberede 500 mL af Borat buffer (25 mM):
      1. 4.768 g Na2B4O710 H2O i 450 mL i ultrarent H2O i et glas bægerglas ved hjælp af en magnetisk omrører opløses.
      2. Justere pH til 8,4 med HCl.
      3. Opløsningen overføres til en 500 mL målekolbe. Fyld den målekolbe med laves H2O, indtil 500 mL og 0,2 µm filter sterilisere den løsning ved hjælp af vand vakuum system.
    2. Forberede en 1% stamopløsning af PEI (1 mL 50% PEI til 49 mL 25 mM Borat buffer) og en 0,1% PEI fortynding ved at fortynde 10 µL af 1% stamopløsning i 100 µL af Borat buffer for den endelige anvendelse.
    3. Der tilsættes 2 mL af 0,1% PEI på glas af indehaveren af skive og lade belægningen inkuberes i 1 minut. Derefter kortvarigt vaske glas to gange med 5 mL i ultrarent H2O og lad lufttørre indtil brug.
  9. Forberede amphotericin B løsninger.
    1. Gøre 60 mg/mL stamopløsning ved at opløse 3 mg af amphotericin B pulver i 50 µL dimethylsulfoxid (DMSO), i en 1 mL tube beskyttet mod lys. Vortex ved den maksimale hastighed for 30 s og Rens med ultralyd i 15 min at homogenisere. Gemme delprøver i 3-5 rør ved-20 ° C og bruge en alikvot pr. dag.
      Bemærk: Hvis amphotericin B stamopløsningen ikke er klar og gul farve men mælkeagtig (stadig gul) efter 15-20 min sonikering gøre en ny stamopløsning.
    2. Gøre IC løsning med amphotericin B af pipettering 2 mL af IC i et rent glas bægerglas med mere end 10 mL kapacitet. Tilsæt 8 µL af amphotericin B stamopløsning oploesningen pipette og bland af pipettering. Wrap bægerglasset med aluminiumsfolie og sted på køl indtil brug og forny det hver 3 h.

2. dissektion og udskæring med Vibratome

  1. Forberede dissektion værktøjer før dissekere, herunder en skarp og en stærk pincet med saks. Ren redskaber (væv indehaveren, pensel, pincet) med ethanol og sørg for, at de anvendes kun til dissektion formål og aldrig i kontakt med faste væv. Holde dem i en separat boks til at undgå forurening.
  2. Aflive fisk i kold is vand i 1 min.
  3. Følg de efterfølgende trin for at hurtigt dissekere medaka hjerne og hypofyse med skarpe pincet (brug ikke mere end 3 min).
    1. Mens holder fisk med stærk pincet svær de to synsnerverne bag øjnene med saks eller skarpe pincet.
    2. Åbn den dorsale del af kraniet fra bageste til den forreste side ved at bryde kranieknogler trin for trin med stærk pincet.
    3. Skalle af kraniet på den ene side med stærk pincet.
    4. Svær rygmarven med saks eller skarpe pincet.
    5. Forsigtigt, grab rygmarven med pincet, flip hjernen fra posteriort for forreste og læg det i en skål med iskoldt Ca2 + gratis EF.
  4. Fyld en 1,5-2 cm3 metal mug med flydende Agarosen og placere den på isen.
  5. Lige før Agarosen størkner (på omkring 25-30 ° C), forsigtigt grab hjernen af rygmarven med pincet, tør pincet med et stykke fint papir og sætte væv i agarosegelelektroforese. Hurtigt mix Agarosen fortyndes spor af EF forladt omkring væv og orientere væv og lad mug på isen i et par sekunder, indtil Agarosen hærder.
    Bemærk: Det er afgørende for dette skridt til at være hurtig. Agarosen størkner hurtigt som metal formen er afkølet af isen.
  6. Trimme en firkantet blok af Agarosen indeholdende væv med en skalpel kniv og lim det på vibratome præparatholderen brug af lim. panelerne kirurgi (ikke-giftige).
  7. Fylde kuvette af vibratome modtager præparatholderen (hjerne-hypofyse) med iskold Ca2 + gratis EF.
  8. Placere præparatholderen i vibratome og snit Agarosen blok for at gøre parasagittal sektioner af 150 µm, ved hjælp af høj frekvens og lav hastighed for at skære. Saml de markerede sektioner og placere dem i patch-clamp optagelse kammer med 3 mL iskold Ca2 + gratis EF
  9. Placer gitter harpe (figur 2B) på afsnittet væv.
    Bemærk: Harpe vil sammen med belægningen stabilisere væv og forhindre det i at flytte under patch-clamp optagelser.
  10. Efter harpe er på plads, skal du ændre Ca2 + gratis EF medium til den normale EF med Ca2 + og BSA. Lad væv hvile i 10 min.

3. perforerede Patch-clamp og elektrofysiologiske optagelser

  1. Før du starter eksperimentet, chlorid sølv wire elektroder af følgende trin: først skal du bruge et fint sandpapir (p180) til at rense sølvtråd elektroder. For det andet Skyl med 2 mL, 70% ethanol. For det tredje, dyppe ledninger i 2 mL, 2-5% klor i 10 min. Endelig, skyl med 2 mL, laves H2O.
  2. Placere optagelse kammer med hjerne-hypofyse skive i stadiet mikroskop og finde målområdet (hypofysen) ved hjælp af 10 X mål og inspicere celler ved hjælp af 40 X mål.
    Bemærk: Hvis forberedelsen er vellykket, meget få runde celler skal være synlige. Disse runde celler er normalt beskadigede celler, der afmontering fra vævet.
  3. Sted grundstødning elektrode gennem 2% agar broen ind i EF badet.
  4. Find en sund celle ved hjælp af det 40 X mål.
    Bemærk: En sund celle bør være fast knyttet til væv skive og ikke rundet op og løsrevet fra Skive.
  5. Indstille forstærkeren i spænding-klemme (VC; Figur 4A punkt 1) tilstand. Åben seglet test-vinduet og tryk på badet konfiguration (figur 4B punkt, 1 og 2. Brug en 5-mV puls til at overvåge pipette modstand (figur 4B punkt 3).
  6. Opfyldning spidsen af patch pipette med svampedræbende gratis IC løsning før du tilføjer IC løsning med amphotericin B ved hjælp af en mikro-filler sprøjte (Se figur 3).
  7. Tilføje en smule positiv lufttryk i patch pipette ved hjælp af 1 mL sprøjte.
    Bemærk: Dette gør en lille flydende flow fra patch pipette, undgå forurening af spidsen.
  8. En gang i badet, vurdere patch pipette modstand og sørg for, at ingen partikler er knyttet til spidsen af pipetten (figur 4 c).
    Bemærk: Et lille stykke tape er fastgjort på skærmen viser formen videooptagelse af synsfeltet. Dette gør positionering af patch pipette i forhold til celle nemmere når målet ikke er at fokusere på cellen.
  9. Guide patch pipette ned til den celle, ved hjælp af micromanipulators.
    Bemærk: Sørg for at pipetten er ren ved at kigge efter små partikler, der kan have tilknyttet til spidsen af en pipette. Pludselige ændringer i modstanden kan også være et resultat af partikler stukket i pipette tip.
  10. Justere pipette når nogle få mikron over cellen således at spidsen af pipetten vil røre celle 1/3 fra midten af cellen, som vist i figur 5. Når rørende cellen, trykket og anvende den blide suge for at gøre en sæl.
    NOTE: Tid fra patch pipette træder badet til en vellykket seal bør holdes så kort som muligt. Ikke mere end 1-1,5 min for at undgå amphotericin B at nå frem til spidsen af pipetten og lække ind i badet.
  11. Straks skifte til vinduet patch i patch-clamp software (figur 4 D punkt 1) og har en bedrift potentiale mellem-50 og -60 mV (figur 4D punkt 2). Nul ud den hurtige kapacitans består af glas pipette (figur 4D punkt 3).
  12. Skifte til vinduet celle i patch-clamp software (figur 4E nr. 1 og 2) og begynde at overvåge adgang modstand, Ra, vises i vinduet. Nul ud membran kapacitans i forstærker software (figur 4E punkt 3) efter tilstrækkelig adgang.
    Bemærk: Tilstrækkelig adgang kan tage 10 til 30 min (figur 4E punkt 2). En god adgang for nuværende klemme optagelser skal være under 20 M.
  13. Skifte til nuværende clamp, IC, i forstærker software vindue (figur 4F punkt 1). Justere de hurtig-kapacitiv strømninger i vinduet - clamp forstærker software (figur 4F nr. 2 og 3) til den samme værdi som i 3.12. Kontrollere membran potentiale (figur 4F punkt 1).
    Bemærk: Vigtigere, hvis membran potentiale er lavvandet (typisk over-35 mV) cellen kan være beskadiget. Annullere optagelsen og finde en ny celle.
  14. Efter at finde en sund celle (solidt fastgjort til væv med membran potentiale under-40 mV), starter de eksperimentelle optagelser som beskrevet i producentens protokol 33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol viser en trin for trin protokol om, hvordan man opnå pålidelige elektrofysiologiske optagelser fra hypofysen (gonadotrope) celler, ved hjælp af en medaka transgene linje [Tg (lhb- hrGfpII)] hvor målet celler (Lh-producerende gonadotropes) er mærket med grønne fluorescerende proteiner (NGL).

I første omgang, blev de elektrofysiologiske undersøgelser gennemført ved hjælp af hele-celle konfiguration. Dog blev spontan handling potentialer ikke overholdt i nogen af de undersøgte celler. I en delmængde af celler, kunne handling potentialer udløses ved hjælp af små aktuelle injektioner (5-9 pA) fra en hvilende potentiale mellem-50 og -60 mV (figur 6). Disse handling potentialer havde en hurtig gennemgang, og efter ca. 4-6 min. udløste handling potentialer ikke længere muligt. Den særlig hurtig gennemgang observeret kan forklares med den lille Cellestørrelse. I almindelighed, er hypofyse celler mindre end neuroner 30. For eksempel, gennemsnitlige membran kapacitans af gonadotrope celler varierer mellem 4 og 10 pF 3,30,35. Svarende til disse resultater medaka gonadotrope celler havde en gennemsnitlig membran kapacitans af (gennemsnit ± R.L) 3,4 ± 0,9 pF (n = 67).

Skifter til den perforerede patch konfiguration ved hjælp af amphotericin B, spontan handling potentialer blev observeret i omkring 50% af de optagne celler (fig. 7A, n = 63 celler fra dyr, 21). Derudover kunne handling potentialer udløses i 95% af disse celler med ingen observerbare gennemgang selv efter langvarig optagelser (maks. 1 h). Vigtigere, for at opnå pålidelig og høj kvalitet optagelser, er det nødvendigt at først udfylde spidsen med svampedræbende-fri IC løsning. Hvis små mængder af svampemidler undslippe pipette spidsen før at gøre gigaseal, kan det beskadige målcellen som såvel som de omgivende celler.

For at teste, hvis celler i konfigurationen af perforeret patch er i stand til at reagere på deres vigtigste frigive hormon, anvendte vi 1 µM Gnrh1 puff skubbet ud på target-cellerne. Forsøgene blev udført i den nuværende klemme til at tillade os at overvåge ændringer i spænding. Disse eksperimenter revealed et bifasisk respons (fig. 7B). Den første fase er en hyperpolarisering hvor frigivelsen af Ca2 + fra interne butikker aktivere Ca2 + aktiveret K+ kanaler forårsager hyperpolarisering. Den første fase efterfølges af en depolarisering og øget aktionspotentialet frekvens fra 1-2 Hz til ca 3 Hz. I nogle af optagelserne havde anden fase pseudo plateau potentialer hvor 2 eller 3 små pigge blev observeret før repolarisering.

Figure 1
Figur 1 : Forskellen mellem hele-celle (A) og perforeret patch (B) konfigurationer af patch-clamp-teknik. Efter gigaseal er på plads, er et hul i hele-celle konfiguration (A) lavet i membranen ved at anvende en lille undertryk i patch pipette. I denne konfiguration, kan vigtige intracellulære molekyler såsom signalering molekyler fortyndes i patch pipette løsning således påvirker de elektriske og fysiologiske reaktioner i cellen. Dette fænomen er endnu mere vigtigt i små celler, såsom hypofyse celler. Derimod i perforeret patch configuration (B), efter gigaseal, elektrisk kontakt mellem cytosol og patch består pipette af svampemidler eller overfladeaktive stoffer. Svampedræbende eller overfladeaktivt stof er indlæst i patch pipette før programrettelser og vil blive indarbejdet i plasma membranen under patch, derved langsomt perforering membran, så kun små molekyler som monovalent ioner til at passere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Billeder af Agar bro (A) og harpe (B) anvendes i protokollen. Skala i mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Udfylde af plaster-pipette. (A) svampedræbende gratis IC løsning (blå væske) er tilbagefyldt af kapillære kræfter på grund af glødetråden inde pipetten. (B) efter påfyldning pipette tip med svampedræbende gratis IC, den bageste del af pipetten er fyldt med IC løsning indeholdende amphotericin B (gul væske) ved hjælp af en sprøjte nål (mikro filler). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4A
Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4B
Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4C
Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4D
Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4E
Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4F
Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Software screenshots. (A) viser forstærker software vindue. 1. fremhæver (rød cirkel) området tilstand, der giver mulighed for skifte mellem spænding klemme (VC), nuværende klemme uden nogen aktuelle injektion (jeg = 0) og nuværende klemme med mulighed for nuværende injektioner (IC). 2 højdepunkter (rød cirkel) område for at justere hurtigt kapacitive strøm i spænding klemme samt hele-celle kapacitiv nuværende justeringer. (B) viser patch-clamp softwaren med membran test vindue åbent. 1. fremhæver (rød cirkel) membran testknappen. 2. fremhæver (rød cirkel) forskellige puls konfigurationer, bad, Patch og celle. 3. fremhæver (rød cirkel) puls konfiguration amplitude og frekvens. (C-F) viser en kombineret enke af patch-clamp software (venstre) og forstærker (højre) software. (C) fremhæver (rød cirkel) modstand, når pipetten er i badet og ordentlig jordforbindelse bruger agar bro (i Bad tilstand). (D) 1. fremhæver (rød cirkel) skifte til Patch tilstand efter gigaseal. 2. højdepunkterne (rød cirkel) tilpasning af pulse konfiguration (10 mV puls) og bedrift potentiale til -60 mV. 3. fremhæver (rød cirkel) vinduet for berigtigelse eller nulstilling fast-kapacitive strøm efter et giga segl. (E) 1. fremhæver (rød cirkel) celle tilstand bruges til at overvåge adgang modstand. 2 højdepunkter (rød cirkel) celle parametre, membran kapacitans (Cm), forsegle kvalitet (Rm), access modstand (Ra), tid konstanten (Tau) og holde strøm (Hold). 3. fremhæver (rød cirkel) knappen for at korrigere de membran kapacitive strømninger. (F) 1. Fremhæver (rød cirkel) IC-tilstand til overvågning af membran potentiale. 2. fremhæver (rød cirkel) knappen for at skifte til nuværende klemme justeringer (I-klemme). 3. fremhæver (rød cirkel) vinduet for at korrigere de fast-kapacitive strømninger.

Figure 5
Figur 5 : Mikrograf fra en patch-klemme optagelse på en hypofyse celle ved hjælp af konfigurationen af perforeret patch. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Nuværende klemme optagelser fra en normal god landbrugspraksis-mærket Lh-producerende celle følgende nuværende injektioner bruger normal hele-celle konfigurationen. Cellerne blev holdt mellem-50 og -60 mV. Typiske handling potentialer kunne udløses i et undersæt af celler ved hjælp af 5 – 10 pA nuværende injektioner umiddelbart efter at opnå adgang til celle (sort trace). Efter 1-3 min begyndte aktionspotentialet amplitude at falde, et typisk tegn på gennemgang (cyan trace). Efter 4-6 min. forsvundet aktionspotentialet amplitude næsten helt (magenta trace). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Nuværende klemme optagelse fra en normal god landbrugspraksis-mærket Lh-producerende celle ved hjælp af konfigurationen af perforeret patch, efter stimulation med Gonadotropin - releasing hormon Gnrh1. (A) nuværende klemme optagelse demonstrerer spontan handling potentialer fra en Lh producerende gonadotrope celle. (B) en bifasisk respons hvor Gnrh1 stimulation for 10 s første induceret en hyperpolarisering af cellemembranen efterfulgt af en depolarisering og øget fyring frekvens (fra 1-2 Hz til 3 Hz) af handling potentialer i en celle, som tidligere fyret spontan handling potentialer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Elektrofysiologiske optagelser ved hjælp af patch-clamp-teknik på hjernen-hypofyse skiver kræver omhyggelig optimering. Godt optimeret protokoller live-celle kontrolundersoegelser specifikt i teleosts er begrænset, med fleste af publikationer ved hjælp af protokoller baseret på pattedyr systemer. I denne forbindelse er det vigtigt at være opmærksom på, at flere fysiologiske parametre som pH og osmolalitet er ikke kun arter afhængige, men også meget afhængig hvorvidt den pågældende organisme lever på land eller i vand. For fisk er det også nødvendigt at tage hensyn til, hvis de bor i en marine eller ferskvand miljø. For eksempel, er CO2 partialtrykket meget lavere i fisk i forhold til pattedyr med niveauer fra 1,7-3,4 mmHg pCO2 i fisk og 40 – 46 mmHg pCO2 i pattedyr 36. Baseret på dette, justere vi pH til 7,75 37,38,39,40 i alle løsninger, der anvendes i den aktuelle protokol. Vi bruger også HEPES buffer, som det har vist sig at besidde fremragende bufferkapacitet kapacitet i 7,4-7,8 41pH-regionen. Til osmolalitet bruger vi 290-300 mOsm, hvilket er, hvad er blevet målt i det ekstracellulære miljø af medaka 42. Temperatur bruges under de elektrofysiologiske optagelser er blevet udvalgt ifølge miljø af fisk. Faktisk, medaka lever i vande med et bredt Temperaturområde (fra 4 til 40 ° C), mens i vores laboratorium, de er rejst i et kontrolleret miljø på 26-28 ° C. Baseret på dette, udførte vi vores optagelser ved stuetemperatur (omkring 25 ° C), forskellige fra hvad der bruges til mammale væv (37 ° C) eller for koldt vand fiskearter som torsk (12 ° C) 18.

For at kunne lappe hypofyse celler, er det afgørende at skabe sunde væv skiver. Det er bydende nødvendigt at bruge ren værktøjer (væv indehaveren, pensel, pincet, etc), der er kun i kontakt med levende væv (gratis fikseringsmidler). En hurtig dissektion af hjerne og hypofyse og holde væv ved lav temperatur (4 ° C) mens dissekere og udskæring er andre vigtige faktorer til at levere levedygtig sektioner. Særlig opmærksomhed bør også gives til temperaturen i Agarosen ved integrering af væv. For varmt Agarosen kan beskadige vævet mens for koldt Agarosen ikke vil forlade dig tid til at orientere væv for ordentlig skæring. Derudover udskæring skal ske med EF løsning uden Ca2 + at undgå de beskadigede celler efter skæring for at indgå apoptose. Boblende er ikke nødvendigt, men væv skiver skal afhentes straks efter skæring. Forlade skive ca 15 min efter skæring for at lade cellerne, der hvile lidt før patching.

Teleost fisk er fremragende modeller at undersøge elektrofysiologiske egenskaber af hypofyse celler. Faktisk, i modsætning til pattedyr og fugle, fisk ikke besidder en medianen eminence, hvilket betyder at de hypothalamus neuroner kontrollerende hypofysen direkte projicere deres axoner på deres mål celler 32. Således i en hjerne-hypofyse skive, hypofyse cellerne vedligeholdes i en mere intakt miljø i forhold til primære hypofyse cellekulturer hvor cellerne der dissocieres ved hjælp af kemiske og mekaniske behandlinger. Interessant, kunne ved hjælp af hjerne-hypofyse skiver af medaka, vi observere at aktionspotentialet affyring frekvens i Lh celler, ved Gnrh1 aktivering, øget (figur 5). Disse bemærkninger er enig med hvad er blevet rapporteret i hypofyse celle kultur studier fra vores egen lab 29 angiver, at du bruger primær hypofyse cellekulturer er stadig relevant at karakterisere membran egenskaber af hypofyse celler. Men hjernen-hypofyse skiver tillade os at studere også indirekte virkninger af forskellige forbindelser samt interaktioner mellem cellerne, da den fastholder strukturelle forbindelser, der er tabt i primære hypofyse cellekulturer. Derudover skive forberedelse er hurtigere til at forberede i forhold til en dissocierede primære cellekultur, og elektrofysiologiske optagelser kan gennemføres i de følgende 30 min efter dissektion. Det betyder, at i modsætning til en primær cellekultur, døgnrytmen kan løses på en meningsfuld måde ved hjælp af frisklavede skiver.

På grund af den lille størrelse af hypofyse cellerne i fisk (membran kapacitans omkring 3-10 pF), og vores egne observationer viser, at gonadotrope celler mister deres evne til at fyre handling potentialer (figur 3) og dermed miste deres evne til at reagere på frigive hormoner, når du optager i hele-celle konfiguration, besluttede vi at bruge og præsentere den perforerede patch teknik heri. Faktisk har det vist det hele-celle konfiguration kan føre til diffusion af vigtige cytoplasmatisk molekyler således ændre elektrofysiologiske celle egenskaber 13. Bruger i stedet de perforerede patch konfigurationer med amphotericin B for at perforere cellemembranen i patch pipette, gør kun små huller tillader kun små ioner til at passere gennem 15,16,43, 44, kunne vi undgå denne fortynding og optage den elektriske aktivitet i cellen til en længere tid.

Et vigtigt punkt i den perforerede patch teknik er at første back-fill pipette med IC løsning uden svampemidler for at undgå at frigive svampemidler til mediet og skader alle celler i afsnittet mens nærmer med patch pipette. Ja, på grund af den positive tryk, patch pipette mens nærmer væv, nogle væske er utæt gennem patch pipette indtil patch er lavet. Dette flow hjælper med at holde spidsen ren, indtil du når den målrettede celle men hvis svampedræbende er udgivet i medium før programrettelsen er lavet, det kan perforere alle membraner i alle celler, ændre dramatisk de gennemtrængelige Karakteristik af cellemembraner og dermed deres elektriske egenskaber.

Præsenteres proceduren har været optimeret og med succes brugt til at studere den elektriske aktivitet i medaka gonadotrope celler. Protokollen kan desuden bruges til at studere alle (endokrine) celletyper findes i hypofysen af medaka og andre teleost fiskearter. Husk kun at osmolalitet og pH-værdi i alle løsninger skal justeres til at af kropsvæsker af arten pågældende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at videregive

Acknowledgments

Vi takke Ms. LourdesCarreon G Tan for hendes hjælp til vedligeholdelse af medaka anlæg og Anthony Peltier for de illustrative tal. Dette arbejde blev finansieret af NMBU og af Norges forskning-Rådet grant numre 244461 (akvakultur program) og 248828 (Digital Liv Norge program).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000 S
Chirurgical glue WPI VETBOND 3M Vetbond Tissue Adhesive
Stainless steel blades Campden Instruments 752-1-SS
metal molds SAKURA 4122
steel harp Warner instruments 64-1417
PBS SIGMA D8537
Ultrapure LMP agarose invitrogen 166520-100
patch pipettes Sutter Instrument BF150-110-10HP Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
Microscope Slicescope Scientifica pro6000
P-Clamp10 Molecular Devices #1-2500-0180 sofware
Digitizer Digidata 1550A1 Molecular Devices DD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B
GnRH Bachem 4108604 H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt 
pipette puller Sutter Instrument P-1000
amphotericin B SIGMA A9528 pore-forming antibiotic
polyethylenimine  SIGMA P3143 50% PEI solution
microfiler syringe WPI MF28/g67-5
glass for the agar bridge Sutter Instrument BF200-116-15 Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager software Open Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS camera Qimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicator Elma D-7700 singen
NaCl SiGMA S3014
KCl SiGMA P9541
MgCl2 SiGMA M8266
D-Glucose SiGMA G5400
Hepes SiGMA H4034
CaCl2 SiGMA C8106
Sucrose SiGMA 84097
D-mannitol SiGMA 63565
MES-acid SIGMA M0895
BSA SIGMA A2153

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
  2. Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
  3. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
  4. Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
  5. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
  6. Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
  7. Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  8. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  9. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  10. Neher, E. Techniques in cellular physiology. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  13. Marty, A., Neher, E. Single Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).
  14. Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
  15. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  16. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  17. Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
  18. Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. US. 3-35 (1983).
  20. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  21. Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
  22. Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
  23. Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
  24. Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
  25. Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
  26. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
  27. Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
  28. Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
  29. Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
  30. Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
  31. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
  32. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
  33. pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
  34. MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
  35. Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
  36. Schmidt-Nielsen, K. Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , Cambridge university press. 613 (1997).
  37. Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).
  38. Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
  39. Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
  40. Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
  41. Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
  42. Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12 (2016).
  43. Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
  44. Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).

Tags

Neurovidenskab spørgsmålet 138 hjerne-hypofyse væv-skive Elektrofysiologi fisk patch-clamp endokrine celler
Sund hjerne-hypofyse skiver for elektrofysiologiske undersøgelser af hypofyse celler i Teleost fisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien,… More

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. J. Vis. Exp. (138), e57790, doi:10.3791/57790 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter