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Neuroscience

Tranches de cerveau-hypophyse saines pour les études électrophysiologiques des cellules hypophysaires chez les poissons téléostéens

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57790
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

L’article décrit un protocole optimisé pour faire des tranches de tissus de cerveau-hypophysaire viables, en utilisant le médaka poissons téléostéens (Oryzias latipes), suivie par des enregistrements électrophysiologiques des cellules hypophysaires en utilisant la technique de patch clamp avec le configuration de patch perforé.

Abstract

Des études électrophysiologiques des cellules hypophysaires ont été menées dans nombreuses espèces de vertébrés, mais très peu chez les poissons téléostéens. Parmi ceux-ci, la nette majorité ont été réalisée sur des cellules primaires dissociées. Pour améliorer notre compréhension des cellules hypophysaires chez les téléostéens comment se comporter dans un milieu biologiquement plus adéquat, ce protocole montre comment préparer des tranches de cerveau-hypophysaire viables utilisant le médaka de petits poissons d’eau douce (Oryzias latipes). Faire des tranches de cerveau-hypophysaire, pH et l’osmolarité de toutes les solutions ont été ajustées aux valeurs contenues dans les fluides corporels de poissons d’eau douce vivant à 25 à 28 ° C. Après préparation de tranches, le protocole montre comment effectuer les enregistrements électrophysiologiques en utilisant la technique de patch-clamp de la cellule entière perforé. La technique du patch-clamp est un outil puissant avec résolution temporelle sans précédent et sensibilité, permettant l’étude des propriétés électriques des cellules entières intacts jusqu'à des canaux ioniques isolés. Patch perforé est unique en ce qu’il garde l’environnement intracellulaire intact empêchant des éléments de régulation dans le cytosol de dilution de la solution d’électrodes patch pipette. En revanche, lorsque vous effectuez des enregistrements de cellules entières traditionnelles, on a observé que les cellules hypophysaires médaka perdent rapidement leur capacité à tirer des potentiels d’action. Parmi les diverses techniques de perforation disponibles, ce protocole montre comment atteindre la perforation de la membrane raccordée à l’aide du fongicide amphotéricine b.

Introduction

L’hypophyse est un organe clef endocrine chez les vertébrés situés au-dessous de l’hypothalamus et derrière le chiasma optique. Il produit et sécrète des hormones de six à huit des types spécifiques de cellules. Hormones hypophysaires constituent un intermédiaire entre le cerveau et les organes périphériques et conduire un large éventail de processus physiologiques essentiels dont la croissance, la reproduction et la régulation de l’homéostasie. Similaire aux neurones, les cellules endocrines de l’hypophyse sont électriquement excitables avec la possibilité de tirer des potentiels d’action spontanément 1. Le rôle de ces potentiels d’action est la cellule dépendante. Dans plusieurs types de cellules de l’hypophyse chez les mammifères, les potentiels d’action peuvent élever l’intracellulaire Ca2 + suffisamment pour une libération prolongée de l’hormone 2. En outre, l’hypophyse reçoit des informations de stimulateurs et inhibiteurs du cerveau qui affecte le potentiel de membrane des cellules 3,4,5,6. En règle générale, entrée stimulatrice augmente l’excitabilité et souvent implique la libération de Ca2 + des réserves intracellulaires ainsi augmenté tir fréquence 7. Comprendre comment la cellule utilise la composition de canal d’ion et s’adapte à ces signaux du cerveau est la clé de la synthèse des hormones compréhension et libération.

La technique du patch-clamp a été développée dans les années 1970 par Sakmann et Neher 8,9,10 et encore améliorée par Hamill 11et permet des enquêtes détaillées sur les propriétés électrophysiologiques des cellules vers le bas pour les canaux ioniques isolés. Par ailleurs, la technique peut être utilisée pour l’étude de courant et tension. Aujourd'hui, serrage patch est l’étalon-or pour mesurer les propriétés électrophysiologiques de la cellule. Quatre principales configurations de la technique de patch clamp d’étanchéité ont été développés 11; la cellule-attachée, la dedans-dehors, l’extérieur-out et le patch de cellules entières. Les trois premières configurations sont généralement utilisées pour les enquêtes de canal ionique unique. Pour la quatrième, suivant la configuration cellule-attachée, un trou dans la membrane cellulaire est réalisée à pression atmosphérique Sub. Cette configuration permet également aux enquêtes de la composition de canal ionique de la cellule entière 12. Cependant, une des limites de cette technique sont que les molécules cytoplasmiques sont dilués par le patch pipette solution 13 (Figure 1A), ce qui influe sur les réponses électriques et physiologiques des cellules étudiées. En effet, certaines de ces molécules peuvent jouer un rôle important dans la transduction du signal ou la régulation des canaux ioniques différentes. Pour éviter cela, Lindau et Fernandez 14 a développé une méthode où un composé formant des pores est ajouté à la pipette. Après la configuration de la cellule-attachée, le composé sera intégrer dans la membrane plasmique sous le timbre et lentement perforer la membrane créant un contact électrique avec le cytosol (Figure 1B). Plusieurs différents antifongiques comme nystatine 15 et amphotéricine B 16, ou les agents tensio-actifs comme la saponine bêta-escine 17,18 peuvent être utilisé. Ces composés créer pores assez grands pour permettre des cations monovalents et Cl– diffusion entre le cytosol et la pipette tout en préservant les niveaux cytosoliques des macromolécules et des ions plues comme Ca2 + 15, 16.

Le défi de l’utilisation de patch perforé est la résistance série potentiellement élevés. Résistance série (R,s) ou accès résistance dépasse la résistance combinée la pipette relativement au sol. Pendant les enregistrements de patch-clamp, le Rs sera en parallèle avec la résistance de la membrane (Rm). Rm et Rs dans un travail parallèle comme un diviseur de tension. Avec la haute Rs, la tension risque de tomber le R des des erreurs dans les enregistrements. L’erreur deviendra plus grande avec les plus grands courants enregistrés. En outre, le diviseur de tension est aussi fréquence dépendant de création d’un filtre passe-bas, affectant ainsi la résolution temporelle. En effet, le patch perforé ne permette pas toujours les enregistrements d’un grand et rapide comme le voltage dépendants des courants Na+ (pour les lectures détaillées voir référence 19). En outre, Rs peuvent varier pendant les enregistrements de patch clamp, encore une fois, conduisant à des changements dans le courant enregistré. Ainsi, les faux positifs peuvent se produire dans les situations où Rs change pendant la demande de drogue.

L’électrophysiologie sur le tissu en tranches a été introduite par le laboratoire d’Andersen à l’étude des caractéristiques électrophysiologiques des neurones dans le cerveau de 20. La technique a ouvert la voie à des investigations détaillées des cellules isolées, mais aussi des circuits de communications et de la cellule de cellules dans un environnement plus intact. Une technique similaire pour faire des tranches hypophysaires a été introduite en 1998 par Guérineau et al. 21. Toutefois, il n’était pas avant 2005, cette préparation de tranches de cerveau-hypophysaire a été utilisée avec succès pour les études de patch clamp en téléostéens 22. Dans cette étude, les auteurs signalent également l’utilisation d’enregistrements perforés patch clamp. Toutefois, de loin, la plupart des études électrophysiologiques des cellules hypophysaires ont été réalisée chez les mammifères et seule une poignée d’autres vertébrés, y compris les poissons téléostéens 1,2,22,23 . Chez les téléostéens, presque toutes les études ont été réalisées sur des cellules dissociées primaire 24,25,26,27,28,29,30 .

Dans le présent document, nous décrivons un protocole optimisé pour la préparation des tranches de cerveau-hypophysaire sains du médaka poisson de modèle. L’approche représente plusieurs avantages par rapport aux cultures primaires de cellules dissociées. Tout d’abord, les cellules sont enregistrées dans un environnement relativement préservé par rapport à dissocié des conditions de culture cellulaire. Deuxièmement, préparations de tranches nous permettent d’étudier les voies indirectes médiées par les cellules de communication 22, qui n’est pas possible dans les conditions de culture de cellules dissociées. En outre, nous montrent comment effectuer des enregistrements électrophysiologiques sur les tranches de tissus obtenus à l’aide de la technique de patch-clamp de la cellule entière perforé avec l’amphotéricine B comme agent formant des pores.

Médaka est un petit poisson d’eau douce originaire d’Asie, présent principalement au Japon. La physiologie, embryologie et la génétique des médakas ont été largement étudiée pour plus de 100 ans 31, et c’est un modèle de recherche communément utilisé dans de nombreux laboratoires. Une importance particulière à ce document est l’organisation morphologique distincte du complexe hypothalamus-pituitaire chez les poissons téléostéens : alors que chez les mammifères et les oiseaux, les neurones hypothalamiques libèrent leurs neuro-hormones régulation hypophysaires cellules endocrines dans le système de la porte de l’éminence médiane, il y a une projection nerveuse directe des neurones hypothalamiques sur les cellules endocrines de l’hypophyse de poissons téléostéens 32. Ainsi, soigneusement conduite cerveau-hypophysaire trancher, c’est d’une importance particulière chez les poissons, nous permettant d’étudier les caractéristiques électrophysiologiques des cellules hypophysaires dans un réseau de cerveau-hypophysaire bien préservé et des cellules en particulier comment hypophysaires contrôler leur excitabilité et, partant, l’homéostasie de Ca2 + .

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Protocol

Tous les animaux de manutention a été réalisée conformément aux recommandations pour les soins et le bien-être des animaux de recherche à l’Université norvégienne des Sciences de la vie et sous la supervision des enquêteurs agréés.

1. préparation des Instruments et Solutions

Remarque : Toutes les solutions doivent être stériles. Il faudrait une attention particulière pour le pH et l’osmolarité (osmol/kg d’eau) de toutes les solutions, qui doit être soigneusement adaptée à l’environnement extracellulaire des espèces étudiées. pH et l’osmolalité doivent être ajustées avec un appareil électronique précis tels que le pH mètre et le point de congélation osmomètre respectivement.

  1. Faire 500 mL de solution extra-cellulaires sans Ca2 + (Ca2 + gratuit EC) : 150 mM NaCl, KCl, 1,3 mM MgCl2, 5 mM 4 mM de glucose, 10 mM Hepes.
    1. Dissoudre 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de Glucose et 1,19 g de HEPES dans 450 mL d’ultrapure (0,055 uS / cm à 25 ° C, la résistivité de 18,2 MOhm) H2O dans un bécher de verre à l’aide d’un agitateur magnétique.
    2. Ajuster le pH à 7,75 avec NaOH.
    3. Transvaser la solution dans une fiole jaugée de 500 mL. Remplir la fiole jaugée avec ultrapure H2O jusqu'à 500 mL.
    4. Mélanger la solution bien avant la mesure de l’osmolalité. Ajuster à 290 à 300 mOsm avec du mannitol. Filtre de stériliser la solution en utilisant le système d’aspiration eau et 0,2 µm filtre.
  2. Faire 500 mL de solution extra-cellulaires (EC) : 150 mM NaCl, KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 5 mM 4 mM de glucose, 10 mM Hepes.
    1. Dissoudre 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, mg 61,89 MgCl2, 360,32 mg de Glucose et 1,19 g de HEPES dans 450 mL d’ultrapure H2O dans un bécher de verre à l’aide d’un agitateur magnétique.
    2. Ajuster le pH à 7,75 avec NaOH.
    3. Transvaser la solution dans une fiole jaugée de 500 mL. Remplir la fiole jaugée avec ultrapure H2O jusqu'à 500 mL.
    4. Mélanger la solution bien avant la mesure de l’osmolalité. Ajuster à 290 à 300 mOsm avec du mannitol. Filtre de stériliser la solution en utilisant le système d’aspiration eau et 0,2 µm filtre.
  3. Faire 500 mL de solution extra-cellulaires avec 0,1 % d’albumine sérique bovine (EC avec BSA) : 150 mM NaCl, KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 5 mM 4 mM de glucose, 10 mM Hepes.
    1. Dissoudre 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, mg 61,89 MgCl2, 360,32 mg de Glucose et 1,19 g de HEPES dans 450 mL d’ultrapure H2O dans un bécher de verre à l’aide d’un agitateur magnétique.
    2. Ajuster le pH à 7,75 avec NaOH.
    3. Transvaser la solution dans une fiole jaugée de 500 mL. Remplir la fiole jaugée avec ultrapure H2O jusqu'à 500 mL.
    4. Mélanger la solution bien avant la mesure de l’osmolalité. Ajuster à 290 à 300 mOsm avec du mannitol. Filtre de stériliser la solution en utilisant le système d’aspiration eau et 0,2 µm filtre. Ajouter 50 mg BSA.
  4. Faire 250 mL de solution intracellulaire (IC) : 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, saccharose 20 mM.
    1. Dissoudre 1,54 g KOH, 327,75 mg de KCl, 595,75 mg de HEPES et 1,712 g de saccharose dans 450 mL d’ultrapure H2O dans un bécher de verre à l’aide d’un agitateur magnétique.
    2. Ajuster le pH à 7,2 avec acide (N-morpholino) éthane sulfonique (MES).
    3. Transvaser la solution dans une fiole jaugée de 250 mL. Remplir la fiole jaugée avec ultrapure H2O jusqu'à 250 mL.
    4. Mélanger la solution bien avant la mesure de l’osmolalité. Ajuster à 280-290 mOsm (inférieur à EC 10 mOsm) avec saccharose. Filtre de stériliser la solution en utilisant le système d’aspiration eau et 0,2 µm filtre.
  5. Faire 100 mL de solution d’agarose fusion faible de 2 % dans ce libre de BSA et de Ca2 + (EC exempts de 2 g de basse fusion agarose dans 100 mL de Ca2 + ). Dissoudre à l’aide d’un four à micro-ondes et placer l’agarose fondu au bain-marie à 40 ° C. Laisser refroidir jusqu'à ce qu’il atteigne 40 ° C avant de l’utiliser sur les tissus.
    NOTE : EC, Ca2 + EC libre peut-être être conservé à 4 ° C pendant plusieurs semaines si stérile et solutions IC à-20 ° C, pendant plusieurs mois. Agarose peut être stocké pendant une semaine à 4 ° C et peut être réutilisé de 3 à 5 fois par brièvement au micro-ondes. Réutilisation excessive conduira à évaporation et altération de gel d’agarose et de concentration de sel et de qualité.
  6. Faire le pont de l’agar :
    1. Faites chauffer les capillaires en verre borosilicaté long 7,5 mm diamètre extérieur (diamètre extérieur) 2 mm et diamètre interne (D.I.) 1,16 mm à l’aide d’un bec Bunsen à un focal point environ 1/3 d’un bout jusqu'à ce que le verre commence à plier. Retirer le verre de la flamme et laisser le verre se plier avec un angle de 120 degrés (Figure 2A).
    2. Faire fondre 2 % d’agar dans EC normal sans glucose à l’aide d’un four à micro-ondes, et alors que l’agarose est liquide remplir le verre pré-faites capillaire à l’aide de capillarité des forces en mettant une des extrémités du verre dans le liquide et attendre quelques minutes. Stocker les ponts jusqu'à l’utilisation à 4 ° C en EC sans glucose.
  7. Préparer en verre borosilicate avec pipettes de patch de filaments à l’aide d’un extracteur adapté pipette. Consulter le manuel d’extracteur de pipette pour obtenir la résistance souhaitée électrode.
    Remarque : Le cône de la pipette doit être aussi court que possible. Cône court pipette est obtenue en utilisant les 4 – 6 étapes traction. La résistance de l’électrode doit être entre 2 et 6 MΩ selon la taille des cellules.
  8. Pour éviter tout mouvement du tissu au cours des expériences de patch clamp recouvrir la surface de la chambre d’enregistrement avec 0,1 % de polyéthylènimine (PEI) en tampon borate.
    1. Préparer 500 mL de tampon de borate (25 mM) :
      1. Dissoudre 4,768 g de Na2B4O710 H2O dans 450 mL d’ultrapure H2O dans un bécher de verre à l’aide d’un agitateur magnétique.
      2. Ajuster le pH à 8.4 avec HCl.
      3. Transvaser la solution dans une fiole jaugée de 500 mL. Remplir la fiole jaugée avec ultrapure H2O jusqu'à 500 mL et 0,2 µm filtre stérilisent la solution en utilisant le système de vide de l’eau.
    2. Préparer une solution 1 % of PEI (PEI de 50 % 1 mL de tampon de borate 49 mL 25 mM) et une dilution de PEI de 0,1 % en diluant 10 µL de la solution mère de 1 % dans 100 µL de tampon de borate pour usage final.
    3. Ajouter 2 mL de PEI de 0,1 % sur le verre du titulaire de la tranche et laisser le revêtement à incuber pendant 1 minute. Ensuite brièvement laver le verre deux fois avec 5 mL d’ultrapure H2O et laissez l’air sec jusqu'à utilisation.
  9. Préparer les solutions d’amphotéricine B.
    1. Faire 60 mg/mL de solution par dissolution de 3 mg de poudre d’amphotéricine B à 50 µL diméthylsulfoxyde (DMSO), dans un tube de mL 1 abri de la lumière. Vortex à la vitesse maximale pendant 30 s et laisser agir pendant 15 min homogénéiser. Stocker les aliquotes dans des tubes de 3-5 à-20 ° C et utilisez une aliquote par jour.
      Remarque : Si la solution mère de l’amphotéricine B n’est pas clair et jaune couleur mais laiteux (toujours jaune) après 15 à 20 min de sonication faire une nouvelle solution.
    2. Faire la solution IC avec l’amphotéricine B par pipetage 2 mL de l’IC dans un bécher de verre propre avec plus de capacité de 10 mL. Ajouter 8 µL de solution mère de l’amphotéricine B dans la solution de la pipette et la composition de pipetage. Envelopper le bécher avec une feuille d’aluminium et placez sur la glace jusqu'à l’utilisation et la renouveler toutes les 3 h.

2. dissection et trancher avec Vibratome

  1. Préparer les outils de dissection avant la dissection, y compris un tranchant et une pince solide avec des ciseaux. Nettoyer les outils (mouchoirs, brosse, pince) avec de l’éthanol et s’assurer qu’ils sont utilisés uniquement aux fins de la dissection et jamais en contact avec des tissus fixés. Conservez-les dans une boîte séparée pour éviter la contamination.
  2. Euthanasier le poisson dans l’eau froide glacée pendant 1 min.
  3. Suivez les étapes suivantes pour disséquer rapidement le cerveau chez les sujets exposés et l’hypophyse avec une forte pince (utilisez pas plus de 3 min).
    1. Tout en maintenant le poisson avec la pince forte grave les deux nerfs optiques derrière les yeux avec des ciseaux ou des pinces.
    2. Ouvrir la partie dorsale du crâne de la partie postérieure de la face antérieure en brisant les os du crâne étape par étape avec une pince forte.
    3. Décollez le crâne d’un côté avec une pince forte.
    4. Sévère de la moelle épinière avec des ciseaux ou une pince forte.
    5. Doucement, prenez la moelle épinière avec la pince, retourner le cerveau postérieur à la partie antérieure et placez-le dans un plat avec la glacée Ca2 + gratuit EC.
  4. Remplissez un moule métallique de 1,5 à 2 cm3 avec liquide d’agarose et placez-le sur la glace.
  5. Juste avant que l’agarose se solidifie (aux environs de 25 – 30 ° C), doucement, saisir le cerveau de la moelle épinière avec la pince, sécher la pince avec un morceau de papier fin et mettre le tissu dans l’agarose. Mélanger rapidement le gel d’agarose pour diluer les traces d’EC à gauche autour du tissu et orienter le tissu et laisser le moule sur la glace pendant quelques secondes jusqu'à ce que l’agarose durcisse.
    Remarque : Il est essentiel pour cette étape être rapide. L’agarose se solidifie rapidement comme le moule métallique est refroidi par la glace.
  6. Coupez un bloc carré d’agarose contenant le tissu avec une lame de bistouri et le coller sur le porte-échantillon vibratome avec de la colle de la chirurgie (non toxique).
  7. Remplir la cuvette de la vibratome reçoit le porte-échantillon (cerveau-hypophysaire) avec glacée Ca2 + gratuit EC.
  8. Placez le porte-échantillon dans le vibratome et coupez le bloc de gel d’agarose pour rendre parasagittale sections de 150 µm, à l’aide de fréquence haute et la basse vitesse pour le sectionnement. Recueillir les sections sélectionnées et les placer dans la chambre d’enregistrement patch clamp avec 3 mL de glacée Ca2 + gratuit EC.
  9. Placez la harpe de la grille (Figure 2B) sur la section de tissu.
    Remarque : La harpe sera ainsi que le revêtement stabiliser le tissu et empêchez-le de se déplacer pendant les enregistrements de patch clamp.
  10. Après que la harpe est en place, remplacez le Ca2 + EC milieu sans la ce normal avec Ca2 + et BSA. Laisser le reste de tissu pendant 10 min.

3. perforé Patch-clamp et enregistrements électrophysiologiques

  1. Avant de commencer l’expérience, le chlorure d’argent fil électrodes par les étapes suivantes : tout d’abord, utilisez un papier de verre fin (p180) pour nettoyer les électrodes de fil d’argent. Ensuite, rincer avec 2 mL, éthanol à 70 %. Troisièmement, faire tremper les fils dans 2 mL, 2 – 5 % de chlore pendant 10 min. Enfin, rincez avec 2 mL, ultrapure H2O.
  2. Placez la chambre d’enregistrement avec la tranche de cerveau-hypophyse dans la platine du microscope et repérez la zone cible (hypophyse) utilisant l’objectif 10 X et inspecter les cellules à l’aide d’objectif 40.
    Remarque : Si la préparation est réussie, très peu de cellules rondes doit être visible. Ces cellules rondes sont généralement endommagés qui sont détacher du tissu.
  3. Placer l’électrode de mise à la terre à travers le pont de 2 % d’agar dans le bain d’EC.
  4. Localiser une cellule saine en utilisant l’objectif X 40.
    Remarque : Une cellule saine doit être fermement attachée à la tranche de tissu arrondie et non détachée de la tranche.
  5. Configurer l’amplificateur en tension-bride (VC ; Mode de la figure 4 a , point 1). Ouvrir le sceau tester fenêtre et appuyez sur configuration de la salle de bain (Figure 4 b point 1 et 2. Une impulsion de 5-mV permet de surveiller la résistance de pipette (Figure 4 b point 3).
  6. Remblayez l’embout de la pipette avec la solution antifongique de IC libre avant d’ajouter la solution IC avec l’amphotéricine B, à l’aide d’une seringue de remplissage-micro (voir Figure 3).
  7. Ajouter une pression légèrement positive dans la pipette à l’aide de la seringue de 1 mL.
    Remarque : Cela fait un petit écoulement de liquide de la pipette qui évitent la contamination de l’embout.
  8. Une fois dans le bain, évaluer la résistance de pipette de patch et assurez-vous qu’aucune particule n’est attachés à l’extrémité de la pipette (Figure 4).
    Remarque : Un petit morceau de ruban est attaché sur le moniteur afficher le formulaire d’enregistrement vidéo du champ de vision. Ce qui rend le positionnement de la pipette par rapport à la cellule plus facile lorsque l’objectif n’est pas en se concentrant sur la cellule.
  9. Guide de la pipette vers le bas pour la cellule à l’aide de micromanipulateurs.
    Remarque : Assurez-vous que la pipette est propre en recherchant les petites particules peuvent avoir attachés à l’extrémité de la pipette. Des changements soudains dans la résistance peuvent également résulter de particules coincé dans l’embout de la pipette.
  10. Réajuster la pipette lors de quelques microns au-dessus de la cellule afin que l’embout de la pipette ne touche la cellule 1/3 du milieu de la cellule, comme illustré à la Figure 5. Lorsque vous touchez la cellule, relâchez la pression et appliquer la succion douce pour faire un joint d’étanchéité.
    NOTE : Le temps de la pipette pénètre dans le bain à un succès joint doit être aussi courts que possible. Pas plus de 1 – 1,5 min afin d’éviter l’amphotéricine B pour atteindre l’extrémité de la pipette et la fuite dans le bain.
  11. Immédiatement basculer vers la fenêtre patch dans le logiciel de patch clamp (Figure 4 D point 1) et ont un potentiel de maintien entre-50 et -60 mV (point 2 dela Figure 4 ). Zéro out la capacitance rapide composée par la pipette de verre (point 3 dela Figure 4 ).
  12. Basculer vers la fenêtre de la cellule dans le logiciel de patch clamp (Figure 4E point 1 et 2) et commencer à surveiller la résistance accès, Ra, affichée dans la fenêtre. Après un accès suffisant à zéro la capacité de la membrane dans le logiciel de l’amplificateur (Figure 4E point 3).
    Remarque : Un accès suffisant peut prendre 10 à 30 min (Figure 4E point 2). Un bon accès pour les enregistrements de pince actuel devrait être inférieure à 20 M.
  13. Passer à la pince ampèremétrique, IC, dans la fenêtre du logiciel amplificateur (Figure 4F point 1). Ajuster les courants capacitifs-rapide dans la fenêtre j’ai-pince du logiciel amplificateur (Figure 4F point 2 et 3) sur la même valeur qu’en 3.12. Vérifier le potentiel de membrane (Figure 4F point 1).
    NOTE : Ce qui est important, si le potentiel de membrane est peu profond (typiquement au-dessus -35 mV) la cellule pourrait être endommagée. Annulez l’enregistrement et trouver une nouvelle cellule.
  14. Après avoir trouvé une cellule saine (solidement fixé au tissu avec membrane potentiel au-dessous de -40 mV), commencer les enregistrements expérimentaux comme indiqué dans protocole 33,34 les directives du fabricant.

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Representative Results

Ce protocole montre un protocole étape par étape comment réaliser des enregistrements électrophysiologiques fiables des cellules de l’hypophyse (gonadotrope), en utilisant une ligne de médakas transgéniques [Tg (lhb- hrGfpII)] où la cible des cellules (gonadotropes Lh-production) sont étiquetés avec la protéine fluorescente verte (GFP).

Au départ, les études électrophysiologiques ont été effectuées à l’aide de la configuration de la cellule entière. Cependant, les potentiels d’action spontanées n’a pas été observés dans aucune des cellules étudiées. Dans un sous-ensemble de cellules, les potentiels d’action peuvent être déclenchées à l’aide de petites injections de courant (5-9 pA) d’un potentiel de repos entre-50 et -60 mV (Figure 6). Ces potentiels d’action avait un aperçu rapide, et après environ 4 à 6 min des potentiels d’action déclenchées n’étaient plus possibles. Bienvenue dans la jungle particulièrement rapide observée peut s’expliquer par la taille de petites cellules. En général, les cellules hypophysaires sont plus petits que les neurones 30. Par exemple, membrane moyenne capacité de gonadotrope cellules se situe entre 4 et 10 pF 3,30,35. Semblable à ces médaka conclusions gonadotrope cellules ont une capacité moyenne de membrane de pF de 3,4 ± 0,9 (moyenne ± SD) (n = 67).

Passer à la configuration de patch perforé à l’aide de l’amphotéricine B, les potentiels d’action spontanées ont été observés chez environ 50 % des cellules enregistrés (Figure 7A, n = 63 cellules des 21 animaux). En outre, les potentiels d’action peuvent être déclenchées 95 % de ces cellules avec aucun aperçu observable même après des enregistrements prolongées (jusqu'à 1 h). Ce qui est important, afin de réaliser des enregistrements fiables et de qualité, il faut d’abord remplir la pointe avec la solution IC sans antifongique. Si de petites quantités d’antifongiques échappent l’embout de la pipette avant de faire le gigaseal, il peut endommager la cellule cible sous forme de cellules bien comme environnantes.

Afin de vérifier si les cellules dans la configuration de patch perforé sont en mesure de répondre à leur principale hormone libérant, nous avons appliqué 1 bouffée de Gnrh1 µM éjectée sur les cellules cibles. Les expériences ont été effectuées dans la pince ampèremétrique pour nous permettre de surveiller les modifications de la tension. Ces expériences ont montré une réponse biphasique (Figure 7B). La première phase est une hyperpolarisation où la libération de Ca2 + des réserves internes activer Ca2 + activé K+ canaux provoquant l’hyperpolarisation. La première phase est suivie d’une dépolarisation et la fréquence des potentiels d’action accrue de 1 à 2 Hz à 3 Hz environ. Dans certains des enregistrements, la deuxième phase a pseudo potentiels en plateau où 2 ou 3 petits épis ont été observées avant la repolarisation.

Figure 1
Figure 1 : Différence entre la cellule entière (A) et les configurations de patch perforé (B) de la technique du patch-clamp. Dans la configuration de la cellule entière (A), après que gigaseal est en place, un trou est fait dans la membrane en appliquant une petite dépression dans la pipette. Dans cette configuration, les molécules intracellulaires importantes comme les molécules de signalisation peuvent être dilués dans la solution de la pipette patch ce qui influe sur les réponses physiologiques et électriques de la cellule. Ce phénomène est encore plus important dans petites cellules, telles que les cellules hypophysaires. En revanche, en configuration perforées-patch (B), suite de gigaseal, le contact électrique entre le cytosol et le patch pipette est composé des antifongiques ou agents tensio-actifs. L’antifongique ou surfactant est chargé dans la pipette avant de patcher et est incorporée dans la membrane plasmique sous le timbre, ainsi lentement perforation de la membrane, ce qui permet uniquement de petites molécules comme les ions monovalents pour passer. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Photos du pont Agar (A) et la harpe (B) utilisées dans le protocole. Échelle à mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Remplissage de la pipette-. (A) solution IC libre antifongique (liquide bleu) est remblayé par des forces capillaires en raison du filament à l’intérieur de la pipette. (B) après que la pipette de remplissage avec IC gratuit antifongique, la partie postérieure de la pipette est rempli de solution IC contenant l’amphotéricine B (liquide jaune) à l’aide d’une aiguille de seringue (micro remplissage). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4A
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Figure 4B
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Figure 4C
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Figure 4D
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Figure 4E
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Figure 4F
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Figure 4 : Logiciel screenshots. (A) affichage fenêtre du logiciel de l’amplificateur. 1. faits saillants (cercle rouge) la zone de la mode qui permet de basculer entre la bride de tension (VC), pince de courant sans aucune injection de courant (I = 0) et pince ampèremétrique avec possibilité pour les injections de courant (IC). 2 met en évidence (cercle rouge) la zone de réglage de courant rapide capacitif à bride de tension ainsi que les ajustements courants capacitifs cellule entière. (B) montre le logiciel patch clamp avec la fenêtre de test de membrane ouverte. 1. faits saillants (cercle rouge) le bouton de test de membrane. 2. faits saillants (cercle rouge) les impulsions différentes configurations, bain, Patch et cellulaire. 3. faits saillants (cercle rouge) l’impulsion configuration amplitude et la fréquence. (C-F) montre une veuve combinée du logiciel de patch clamp (à gauche) et du logiciel (à droite) amplificateur. (C) met en évidence (cercle rouge) la résistance quand la pipette est dans le bain et bonne mise à la terre à l’aide de pont d’agar (en mode de bain). (D) 1. faits saillants (cercle rouge) le passage en mode Patch suivant gigaseal. 2. faits saillants (cercle rouge) la configuration de pulsation (impulsions de 10 mV) et potentiel de maintien ajustés à -60 mV. 3. faits saillants (cercle rouge) de la fenêtre de correction ou de mise à zéro les courants capacitifs-rapide suite à un joint de giga. (E) 1. (cercle rouge) met en évidence le mode de cellule utilisé pour surveiller la résistance de l’accès. 2 met en évidence (cercle rouge), les paramètres de la maille, capacité membranaire (Cm), sceau de qualité (Rm), accéder à la résistance (Ra), la constante de temps (Tau) et courant de maintien (Hold). 3. attire l’attention (cercle rouge) le bouton de correction des courants capacitifs de membrane. (F) 1. (Cercle rouge) met en évidence le mode de l’IC pour la surveillance de potentiel de membrane. 2. faits saillants (cercle rouge), le bouton pour passer à des ajustements de pince actuel (I-bride). 3. faits saillants (cercle rouge) de la fenêtre pour corriger les courants capacitifs-rapide.

Figure 5
Figure 5 : Micrographie d’un patch-clamp d’enregistrement sur une cellule hypophysaire à l’aide de la configuration patch perforé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Cours enregistrements pince un GFP-étiqueté Lh produisant des cellules suite à des injections de courant à l’aide de la configuration normale de cellules entières. Les cellules ont été conservés entre-50 et -60 mV. Des potentiels d’action typiques pourrait être déclenchées dans un sous-ensemble de cellules à l’aide de 5 à 10 injections de courant pA immédiatement après l’obtention d’un accès à la cellule (trace noire). Après 1 à 3 min, l’amplitude du potentiel d’action a commencé à diminuer, un signe typique de diminution des effectifs (cyan trace). Après 4 à 6 min, l’amplitude du potentiel d’action a presque complètement disparu (trace magenta). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Pince ampèremétrique enregistrement à partir d’une cellule de production GFP-étiqueté Lh utilisant la configuration patch perforé, suite à la stimulation avec le Gonadotropin - releasing hormone Gnrh1. (A) enregistrement clamp actuelle démontrant des potentiels d’action spontanées d’une cellule de gonadotrope productrice de Lh. Réponse biphasique (B) A où Gnrh1 stimulation pour 10 s a tout d’abord induit une hyperpolarisation de la membrane cellulaire, suivie d’une dépolarisation et a augmenté la fréquence (de 1 à 2 à 3 Hz) de tir des potentiels d’action dans une cellule qui précédemment ont tiré potentiels d’action spontanées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Des enregistrements électrophysiologiques utilisant la technique du patch-clamp sur des tranches de cerveau-hypophysaire nécessitent optimisation minutieuse. Des protocoles bien optimisés pour mener des enquêtes de cellules vivantes spécifiquement chez les téléostéens sont limitées, la majorité des publications à l’aide de protocoles basés sur les systèmes mammaliens. À cet égard, il est important d’être conscient du fait que plusieurs paramètres physiologiques tels que pH et l’osmolalité sont non seulement les espèces dépendantes, mais aussi très largement tributaire de savoir si l’organisme en question vit sur terre ou dans l’eau. Pour les poissons, il est également nécessaire tenir compte, s’ils vivent dans un environnement marin ou d’eau douce. Par exemple, la pression partielle de CO2 est beaucoup plus faible chez les poissons par rapport aux mammifères aux niveaux allant de 1,7 à 3,4 mmHg BCP2 chez les poissons et 40 à 46 mmHg BCP2 mammifères 36. Sur cette base, nous ajuster le pH à 7,75 37,38,39,40 dans toutes les solutions utilisées dans le protocole actuel. Nous utilisons également un tampon HEPES puisqu’il a été démontré posséder d’excellentes capacités de mise en mémoire tampon dans la région de pH de 7,4 à 7,8 41. Nous utilisons pour l’osmolalité, 290 à 300 mOsm, qui est ce qui a été mesuré dans l’environnement extracellulaire des médakas 42. La température recommandée durant les enregistrements électrophysiologiques a été sélectionnée selon l’environnement du poisson. En effet, chez les sujets exposés sont vivant dans les eaux avec une large plage de températures (de 4 à 40 ° C), alors que dans notre laboratoire, qu'ils sont élevés dans un environnement contrôlé à 26 et 28 ° C. Sur cette base, nous avons effectué nos enregistrements à température ambiante (environ 25 ° C), différente de celui qui est utilisé pour les tissus de mammifères (37 ° C) ou pour les espèces de poissons d’eau froide comme la morue de l’Atlantique (12 ° C) 18.

Pour pouvoir raccorder les cellules hypophysaires, il est essentiel pour produire des tranches de tissus sains. Il est impératif d’utiliser des outils propres (mouchoirs, brosse, pinces, etc.) qui sont uniquement en contact avec les tissus vivants (sans fixatifs). Une dissection rapide du cerveau et pituitaire et maintien le tissu à basse température (4 ° C) tandis que la dissection et de découpage sont autres facteurs clés pour fournir des sections viables. Il faudrait aussi une attention particulière à la température de l’agarose à l’incorporation de tissu. Agarose trop chaud peut endommager les tissus alors que l’agarose trop froid ne vous laissera pas temps d’orienter le tissu pour le sectionnement approprié. En outre, le découpage doit se faire avec solution EC sans Ca2 + pour éviter les cellules endommagées après sectionnement pour entrer dans l’apoptose. Formation de bulles n’est pas nécessaire, mais les tranches de tissus doivent être prélevés immédiatement après le sectionnement. Quitter la tranche environ 15 min après découpe pour laisser les cellules reposer un peu avant de patcher.

Les poissons téléostéens sont excellents modèles pour étudier les propriétés électrophysiologiques des cellules hypophysaires. En effet, contrairement aux mammifères et aux oiseaux, poissons ne possèdent pas une éminence médiane, ce qui signifie que les neurones hypothalamiques contrôlant l’hypophyse directement projettent leurs axones sur leurs cellules de cible 32. Ainsi, dans une tranche de cerveau-hypophysaire, cellules hypophysaires sont maintenues dans un environnement plus intact par rapport à des cultures primaires de cellules hypophysaires lorsque les cellules sont dissociées en utilisant des traitements chimiques et mécaniques. Fait intéressant, en utilisant des tranches de cerveau-hypophysaire de medaka, nous avons pu observer que le potentiel d’action tir de fréquence dans les cellules de Lh, lors de l’activation de la Gnrh1, augmenté (Figure 5). Ces observations sont en accord avec ce qui a été signalée dans des études de culture de cellules hypophysaires de notre propre laboratoire de 29 , indiquant que l’utilisation de cultures primaires de cellules hypophysaires sont toujours d’actualité caractériser les propriétés de la membrane des cellules hypophysaires. Cependant, des tranches de cerveau-hypophysaire nous permettent d’étudier aussi les effets indirects des différents composés ainsi que les interactions entre les cellules, comme il le soutient des connexions structurales qui sont perdues dans des cultures primaires de cellules hypophysaires. En outre, préparation de tranche est plus rapide à préparer par rapport à une culture dissocié de cellules primaires, et les enregistrements électrophysiologiques peuvent être menées dans les 30 min suivant après dissection. Cela signifie que, contrairement à une culture de cellules primaires, rythmes circadiens peut être adressées d’une manière significative en utilisant des tranches fraîchement préparées.

En raison de l’exiguïté des cellules hypophysaires chez les poissons (capacité de la membrane autour de 3 à 10 pF) et nos propres observations montrant que gonadotrope cellules perdent leur capacité de feu de potentiels d’action (Figure 3) et perdent ainsi leur capacité à répondre aux libérant des hormones lors de l’enregistrement dans la configuration de la cellule entière, nous avons décidé d’utiliser et de présenter la technique du patch perforé dans les présentes. En effet, il a été démontré que la configuration cellule entière pourrait conduire à la diffusion des molécules cytoplasmiques importantes, ce qui modifie les propriétés de cellule électrophysiologiques 13. Utilisez à la place les configurations patch perforé avec l’amphotéricine B pour perforer la membrane cellulaire dans la pipette, faisant seulement de petits trous, ce qui permet uniquement de petits ions de passer à travers 15,16,43, 44, nous pourrions éviter cette dilution et enregistrer l’activité électrique de la cellule pendant une période prolongée.

Un point important dans la technique du patch perforé est à premier remblai la pipette avec solution IC sans antifongiques afin d’éviter de relâcher antifongiques dans le milieu et endommager toutes les cellules de la section alors qu’il approchait avec la pipette. En effet, en raison de la pression positive appliquée à la pipette alors qu’il approchait du tissu, certain liquide fuit par le biais de la pipette jusqu'à ce que le patch est fait. Ce flux permet de nettoyer le bout jusqu'à ce que vous atteignez la cellule ciblée mais si antifongique est libéré dans le milieu avant le patch est fait, il peut perforer toutes les membranes de toutes les cellules, changeant radicalement les caractéristiques perméabilités des membranes cellulaires et donc leurs propriétés électriques.

La procédure présentée a été optimisée et utilisée avec succès pour étudier l’activité électrique des cellules de gonadotrope chez les sujets exposés. En outre, le protocole peut servir à étudier tous les types de cellules (système endocrinien) trouvés dans l’hypophyse des médakas et autres espèces de poissons téléostéens. N’oubliez pas seulement que l’osmolalité et pH des solutions doivent être ajustées à celle des fluides corporels de l’espèce en question.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Acknowledgments

Nous remercions Mme LourdesCarreon G Tan pour son aide à maintenir l’installation chez les sujets exposés et Anthony Peltier pour les chiffres indicatifs. Ce travail a été financé par ERNM et par le Conseil de recherche norvégien, grant Grant numbers 244461 (programme d’Aquaculture) et 248828 (programme de vie numérique Norvège).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000 S
Chirurgical glue WPI VETBOND 3M Vetbond Tissue Adhesive
Stainless steel blades Campden Instruments 752-1-SS
metal molds SAKURA 4122
steel harp Warner instruments 64-1417
PBS SIGMA D8537
Ultrapure LMP agarose invitrogen 166520-100
patch pipettes Sutter Instrument BF150-110-10HP Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
Microscope Slicescope Scientifica pro6000
P-Clamp10 Molecular Devices #1-2500-0180 sofware
Digitizer Digidata 1550A1 Molecular Devices DD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B
GnRH Bachem 4108604 H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt 
pipette puller Sutter Instrument P-1000
amphotericin B SIGMA A9528 pore-forming antibiotic
polyethylenimine  SIGMA P3143 50% PEI solution
microfiler syringe WPI MF28/g67-5
glass for the agar bridge Sutter Instrument BF200-116-15 Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager software Open Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS camera Qimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicator Elma D-7700 singen
NaCl SiGMA S3014
KCl SiGMA P9541
MgCl2 SiGMA M8266
D-Glucose SiGMA G5400
Hepes SiGMA H4034
CaCl2 SiGMA C8106
Sucrose SiGMA 84097
D-mannitol SiGMA 63565
MES-acid SIGMA M0895
BSA SIGMA A2153

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References

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Tranches de cerveau-hypophyse saines pour les études électrophysiologiques des cellules hypophysaires chez les poissons téléostéens
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Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien,… More

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. J. Vis. Exp. (138), e57790, doi:10.3791/57790 (2018).

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