Summary
Ovariell vävnadskulturer kan användas som modeller av follikeln utveckling, ägglossning och follikeln atresi och ange regleringsmekanismer av dynamiska cystor processer.
Abstract
Däggdjurs honor ägglossning regelbundet en nästan konstant antalet oocyter under varje estrus cykel. För att upprätthålla sådan regelbundenhet och periodicitet, uppstår förordning på hypotalamus-hypofysaxeln nivå och utveckla folliklar i äggstockarna. Trots aktiva studier är mekanismer för utveckling av follikeln inte tydliga på grund av de flera steg inblandade från vilande primordial follikeln aktiveringen till ägglossning, och den förordning komplexitet som skiljer sig i varje follikulär fas. För att undersöka mekanismer för follikeln utveckling och dynamiken i folliklar under brunst livscykel, utvecklade vi en musmodell för äggstockscancer vävnad kultur som kan användas att iaktta follikeln utveckling med hjälp av ett mikroskop. Systematisk follikeln utveckling, periodiska ägglossning och follikeln atresi kan alla reproduceras i odlade äggstock modellen, och villkoren kultur kan moduleras experimentellt. Här visar vi nyttan av denna metod i studiet av regleringsmekanismer av follikeln utveckling och andra cystor fenomen.
Introduction
Kvinnliga mus äggstockarna innehåller flera tusen folliklar1, och regelbunden ägglossning mognar cirka tio oocyter vid varje estrus cykel. Folliklar är indelade i flera utvecklingsstadier: primordial, primär, sekundär, antral, och Graafian folliklar, beroende på vilken form av lagrets granulosa cellulära kring varje äggcell. De flesta primordial folliklar är vilande, och några av dem aktiveras och växa till primära folliklar på varje estrus cykel2. Efter den sekundära follikulär fas regleras follikeln utveckling främst gonadotropiner, follikulära stimulerande hormon (FSH) och luteiniserande hormon (LH). Dock primordial och primära follikelstimulerande utveckling är oberoende av gonadotropin, och de reglerande mekanismer som styr dessa stadier förblir dåligt inderstood3,4,5. Förutom tillväxt faktorer och hormoner regleras primordial och primära follikeln interaktioner bland folliklar6,7. Därför vi utfört analyser av follikeln dynamics i mus äggstockarna vävnader och undersökt de associera regleringsmekanismer som använder cystor vävnadskulturer8,9,10.
Häri, introducerar vi två cystor vävnadsodling model metoder. Först används för att analysera follikeln utveckling genom mätning av follikulära områden, och andra används för att studera den reglerande mekanismen under tidig follikeln utveckling från primordial till sekundär follikel scenen med transgena möss. För follikeln utveckling analys används vi främst äggstockarna av 4 - veckor gammal honmöss eftersom de möjliggör enkel visualisering av folliklar. För att inducera periodiska ägglossning och modell i vivo follikeln utveckling, återgav vi LH-ökning och observerade ägglossning, follikeln atresi och sekretion av estradiol vävnadsodling villkor. Bilder av odlade äggstockarna fångades och follikeln utvecklingsprocesser analyserades av spårning förändringar i området follikulära. Men i ljusa fält mikroskopi analyser var skillnaden mellan primordial och tidiga primära folliklar oklart. Således vi utvecklat en metod för att upptäcka små folliklar, och skilja mellan primordial, primär och sekundär follikel i odlade äggstockarna vävnader med hjälp Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 och R26-H2B-mCherry transgena möss äggstockarna på dag 0 och 4 efter födelse11. Oog1 uttryck är detekterbart i oocyter efter ikraftträdandet meios och ökar gradvis med follikeln utveckling, tillåter observation av övergången från primordial till primära folliklar med time-lapse bilder av odlade äggstock vävnad11 ,12. Även om morfologiska metoder har använts för att studera faktorer som aktiverar vilande primordial hårsäckarna13,14,15,16, är fysiologiska follikeln utveckling i äggstockarna svårt att observera, och effekterna av olika faktorer förblir uncharacterized. De nuvarande kultur metoderna utformades för att åtgärda denna brist i realtid analyser av mål faktorer.
I den aktuella studien, vi spårade follikulär utveckling med en time-lapse bildgivande metod och kännetecknas av follikeln utveckling. Vår nya metoder erbjuder en oöverträffad verktyg för att undersöka physiologyen av äggstockarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Möss var inrymt i ett miljömässigt kontrollerade rum på 23 ±1 ° C med en 12 h ljus/12 h mörka cykel. Djurvård protokoll och experiment genomfördes i enlighet med riktlinjerna för djur experiment på Aichi Medical University och godkändes av den vilande djur vård och användning kommittén.
1. beredning av odlingsmedium och rätter
- För att förbereda grundläggande odlingsmedium, tillsätt fetalt bovint serum (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL), och penicillin-streptomycin (penicillin, 100 U/mL; streptomycin, 100 mg/mL) till minsta nödvändiga medium alfa (MEM-alfa) och blanda i 50 mL rör.
Obs: Totala mängder krävs kultur media varierar mellan experiment, men 1 mL odlingsmedium är normalt tillräckligt för 3,5 cm glasbotten kultur rätter. - Häll 1 mL portioner av blandade odlingsmedium i 3,5 cm glasbotten kultur rätter och ställa in plats 30 mm cell kultur skär i rätter. Pre varma media och rätter i en inkubator (5% CO2 och 37 ° C).
2. förberedelse för äggstocksvävnad
- Pre varma fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (−) och MEM-alpha som innehåller 5% FBS, 100 U/mL penicillin och 100 mg/mL streptomycin i en inkubator (5% CO2 och 37 ° C).
Obs: Ca 3 mL alikvoter av PBS (−) per äggstocken är tillräcklig för användning under äggstock dissektioner och 1 mL portioner av MEM-alpha är tillräckliga för tillfällig lagring av enda äggstockarna i 3,5 cm rätter. -
Punktskatt äggstockar från 4 - vecka-gammal honmöss ICR (uppkallad efter Institute of Cancer Research) och trimma de vävnader som omger äggstocken med sax och pincett i stereoskopisk Mikroskop. Reservera bort äggstockarna i odlingsmedium (se steg 2.1) fram till användning.
- Plats som enda äggstockarna på filterpapper fuktad med pre värmde PBS (−) (se steg 2.1) och skiva i 4 bitar med hjälp av en mikrotom blad under en stereoskopisk Mikroskop.
Obs: Äggstockarna av 4 - veckor gammal ICR möss är ca 2 mm i diameter. Antalet bitar beror på äggstocken storlek; dock ca 500 µm tjocka bitar möjliggör korrekt follikeln observationer (i bitar som är tjockare än 500 mm, minskas vävnad insyn; i bitar tunnare än 500 mm, många antral folliklar bryts och förlorade). - Efter dissektion, placera skivad äggstock exemplaren i förväg värmde odlingsmedium i 3,5 cm rätter (se steg 2.1).
- Plats som enda äggstockarna på filterpapper fuktad med pre värmde PBS (−) (se steg 2.1) och skiva i 4 bitar med hjälp av en mikrotom blad under en stereoskopisk Mikroskop.
3. äggstockscancer vävnad kultur
- Släppa ungefär 0,5 µL av odlingsmedium per skivad äggstocksvävnad på cell kultur skäret där äggstocksvävnad kommer att med hjälp av en mikropipett.
- Placera varje skivad prov i en droppe av odlingsmedium på cell kultur skären med pincett.
- Kultur äggstockarna vävnader i 5% CO2 vid 37 ° C.
- Byt ut odlingssubstratet med färska pre värmde medium varannan dag.
Observera: Schemat för medelstora förändringar för kulturen i äggstocken sektioner från 4 - vecka-gammal ICR möss presenteras i figur 1.- För att återge den LH-ökningen, behandla odlade 4 - vecka-gammal ICR möss äggstockarna med mediet som innehåller 100 me/mL FSH och LH för 12 h varje 4 dagar (figur 1).
4. mikroskopbilder av odlade äggstockar
- Starta imaging odlade äggstockarna efter dag 1 när vävnaderna har klibbat på cell kultur skären och utföra confocal eller inverterade mikroskopet analyser vid 24 h intervall att tillåta tillräcklig follikeln tillväxt mellan tidpunkter.
Obs: Konfokalmikroskopi är överlägsen inverterad mikroskopi för att observera folliklar i hela odlade äggstockar.
5. time-lapse avbildning av odlade äggstockarna
-
Optimera time-lapse imaging villkoren, inklusive laser stödnivåer och exponeringstider, för imaging system (tabell 1).
- Välj ihopkopplade äggstock exemplar från enstaka möss för användning som behandlings-och kontroll. Variera laser stödnivåer och exponeringstid att uppnå de bästa bilderna (tabell 1).
- Jämföra follikeln tillväxt under varje kultur villkor genom att mäta follikeln områden i bilder av kontrollprover vid 24 h intervall och i time-lapse imaging prover (se steg 6). Samtidigt räkna antalet ägglossning oocyter i varje äggstock set och välja de optimala time-lapse imaging förhållandena.
- Fånga bilder med 30 min mellanrum använder time-lapse imaging system på fastställda villkor (tabell 1).
6. follikeln Tillväxtanalys
-
För att analysera follikeln utveckling, mäta follikeln områdena i de tagna bilderna med ImageJ programvara (http://resbweb.nih.gov/ij/).
- Inledningsvis ange omfattningen av bilden genom att klicka på ”Ange skala” under ”analysera” i verktygsfältet. Ange de side längderna den tagna bilden och det motsvarande antalet pixlar i de tomma fälten ”kända avstånd” och ”avståndet i bildpunkter”, respektive.
- Klicka på ”fri hand” i verktygsfältet och beskriva hårsäckarna i de fångade ljusa fält bilderna.
- Klicka på ”åtgärd” under ”analysera” i verktygsfältet.
Obs: Om andra mätdata önskas, klicka på ”Ange mätning” under ”analysera” i verktygsfältet, och kontrollera att rätt kryssrutor i listan.
7. analys av follikeln utveckling med hjälp av transgena möss
- Samla in äggstockar från postnatal dag 0 och 4 (P0 och P4) kvinnliga transgena möss som innehåller de transgener Oog1pro3.9 och R26-H2B-mCherroch kultur på skären som beskrivs i steg 1,1 – 3.2, utom inte skiva P0 och P4 äggstockarna.
- Byt ut odlingssubstratet med färska, pre värmde medium i 3,5 cm rätter i en inkubator som innehåller 5% CO2 vid 37 ° C varje 2 dagar.
Obs: Koncentrationen av LH i odlingsmediet av P0 och P4 äggstockarna kan vara konstant eftersom LH stegringar inte förekommer i P0 och P4 möss. - Ställ mikroskopet att visualisera endast AcGFP1-positiv primära folliklar i odlade P4 äggstockar (tabell 1).
Obs: Endast primordial och primära folliklar är närvarande i P4 kvinnliga mus äggstockarna. - Fånga bilder av odlade P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry transgena möss äggstockarna med 30 min mellanrum använda inställningarna som används för P4 äggstockarna (se steg 5.2).
- Spåra och analysera follikeln utveckling med hjälp av AcGFP1 och H2B-mCHerry signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar protokollet för förändringar i media under äggstockscancer vävnad kultur. Efter detta program, 4 veckor gamla ICR möss äggstockarna var odlade och avbildas med 24 timmars intervall med konfokalmikroskopi (figur 2). Under kultur av äggstockarna vävnader i 3 veckor, mest antral och sekundära folliklar var urartade av follikeln atresi och några var ägglossning (figur 2D och tabell 2). I analys av follikeln områden med hjälp av ImageJ (figur 3), utvecklat vissa folliklar i grupper under varje LH våg cykel (figur 3B och kompletterande film 1). Dessutom inträffade ägglossningen nästan samtidigt i separata odlade äggstockar från höger och vänster äggstockarna av enstaka möss. Bör tidpunkten för ägglossning och numrerar av ägglossning oocyter (tabell 2) skilde sig mellan mus äggstockarna (inga data anges), inträffat ägglossningen från odlade äggstockarna huvudsakligen inom 48 h av LH stegringar (figur 3och kompletterande Film 1). Dock inte alla ovulated oocyter släppt första polar organ efter ägglossningen (figur 2E och tabell 2), och även om ägglossning oocyter kunde befruktas, utveckling upphört på i 4-cellstadie (inga data anges). För att belysa mekanismer som aktiveras vilande primordial folliklar i mus äggstockar, upptäckt vi primordial follikeln aktivering i odlade vävnader från transgena möss som transporterar Oog1pro3.9 och R26-H2B-mCherry transgener ( Figur 4, figur 5och kompletterande filmen 2). Oocyter uttrycker mycket låga nivåer av Oog1 -genen från primordial follikeln scenen och time-lapse imaging distingerad låg AcGFP1-uttryckande primordial folliklar från de höga AcGFP1-uttryckande primära folliklarna. Primordial och primära folliklar är närvarande samtidigt i P4 mus äggstockar, medan endast primordial folliklar är närvarande i P0 äggstockar (figur 4A, B). Således optimerat vi time-lapse imaging villkoren att upptäcka endast primära folliklar i odlade P4 äggstockarna (figur 4C). Därefter fångade vi bilder av odlade P0 äggstockarna i 10 dagar i samma förhållanden (figur 4D – G). AcGFP1 kan användas som ett index av primära folliklar i dessa transgena möss och AcGFP1-positiv primära folliklar var detekterbart i odlade P0 äggstockarna efter 30 – 40 h kultur (figur 4, bild 5A-Foch kompletterande Film 2). Primordial och primära folliklar i odlade äggstockar var också kännetecknas av mCherry-positiva kärnor av granulosa celler (figur 5B, E). Specifikt mCherry signaler indikerar former av folliklar och möjliggöra observation av follikeln stadier i odlade äggstockar (figur 5B, E, och H). Därför denna kultur system med äggstockar från Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry möss visade tidigt follikeln utvecklingen från primordial till sekundär follikel stadier. Dessa metoder kommer att underlätta studier av regleringsmekanismer av gonadotropin-oberoende follikeln utveckling.
Figur 1 : Tidsförloppet för medelstora förändringar. Medelstora A innehåller 5% FBS, 100-mU FSH, 10-mU LH, 100 U/mL penicillin och 100 mg/mL streptomycin i MEM-alpha. Medium B innehåller 5% FBS, 100-mU FSH, 100-mU LH, 100 U/mL penicillin och 100 mg/mL streptomycin i MEM-alpha. Medium B användes för att producera LH stegringar var 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Bilder av odlade äggstockarna vävnader. Bilder fångades vid 24 h intervall med konfokalmikroskopi. (A) kulturdag 1; (B) kulturdag 5. (C) kulturdag 10; (D) kulturdag 13; (E) förstorad bild av regionen anges av torget i (D); oocyter i D var ägglossning från hårsäckarna anges med pilar i B, C och D. (F) äggcellen släppa en polar kroppen efter ägglossningen; Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Mätningar av follikeln områden i odlade äggstockarna. (A) bild av odlade äggstock; streckade linjer avser området mäts av ImageJ. (B) follikulära områden i odlade äggstock efter 3 veckor. grå linjer avser perioden kultur från tillägg av 100 mM LH (LH-ökning). Linjerna visar utvecklingsstadierna i varje follikel i odlade äggstockarna; Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Hematoxylin och Eosin (H & E) färgning bilder av P0 och P4 äggstockarna och time-lapse imaging. (A) H & E färgning av P0 äggstock; (B) H & E färgning av P4 äggstock; (C) bild av en P4 äggstock från en Oog1pro3.6 transgena möss efter 10 h kultur. Pilen visar en AcGFP1-positiv primär follikeln. (D-G) Bilder av P0 äggstockar från transgena möss att uttrycka Oog1pro3.9 och R26-H2B-mCherry; gröna och röda signaler i D och F representerar AcGFP1 och mCherry, respektive. Vita signaler i E och G representerar AcGFP1 i D och F, respektive. D och E är bilder av odlade äggstockarna efter 0,5 h kultur. F och G Visa äggstockarna efter 180 h kultur; Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: bilder av primordial, primära och sekundära folliklar i odlade äggstockar från oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry möss. (A–C) Bilder av primordial folliklar i odlade P0 äggstockarna. (D–F) Bilder av primära folliklar i P0 odlade äggstock; (G–H) Bilder av sekundära folliklar i odlade 4-vecka-gammal mus äggstockar. A, D och G är sammanslagna bilder av B och C, E och F, och H och I, respektive. Green, AcGFP1; röd, mCherry; Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| mikroskopet | objektiv | Laser | exponering (ms) | Vinst | tidsintervall | z-stack | andra | Siffror och filmer |
| CV1000 | X10 | 488 nm: 30, 561 nm: 20 | 488 nm: 700, 561 nm: 600 | 488 nm: 90, 561nm: 20 | 30 min | 5 mm | Figur 4C-G, film 1 och 2 | |
| BZ-X700 | X20 (med samling krage) | 40% | Auto | X4 | 30 min | 10 mm | Binning 3 x 3 | Film 3 |
| LSM710 | X10 | 488 nm: 6%, 564 nm: 5% | kameran hastighet: 4 | 488 nm: 850, 564 nm: 850 | 24 h | 10 mm | Digital få, 488 nm: 2, 564 nm:1 | Figur 2, 3 och 5 |
Tabell 1: Time-lapse imaging villkoren. Time-lapse imaging skick för confocal och ljusa fält Mikroskop.
| Äggstocken ingen. | Antalet totala ägglossning oocyter | Antal MII oocyter |
| 1 | 7 | 2 |
| 2 | 19 | 9 |
| 3 | 14 | 6 |
| 4 | 7 | 3 |
| 5 | 12 | 4 |
| 6 | 15 | 6 |
| 7 | 25 | 11 |
| 8 | 13 | 3 |
| 9 | 11 | 7 |
| 10 | 19 | 8 |
| 11 | 18 | 4 |
| 12 | 7 | 1 |
Tabell 2: antal ägglossning oocyter i odlade äggstockar. Numrerar av ägglossning oocyter från tolv odlade äggstockarna. MII anger antalet ägglossning oocyter som släppt första polar organ efter ägglossningen.
Kompletterande film 1: Time-lapse film av en odlade ovary. Äggstockarna var har samlats in från 4 vecka gamla möss och skivad och odlade i 3 veckor. Filmen spänner över en kultur period av 0 – 200 h på 10 ramar/s. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Kompletterande Movie 2: Time-lapse film av en odlade P0 äggstock från en transgen mus. Green, AcGFP1; röd, mCherry. Filmen spänner över en kultur period 0 – 180 h på 10 ramar/s. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Kompletterande filmen 3: Time-lapse film av en odlade äggstock från en 4 veckor gamla mus. Green, AcGFP1; röd; mCherry; filmen spänner över en kultur period 9 – 13 kultur dagar vid 10 bildrutor/s. Pilarna i den första bilden visar folliklar i vilken atresi inträffade under kultur. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie har vi utvecklat två nya metoder för att studera follikeln utveckling i mus äggstockar. Den första metoden innebär kultur av skivad cystor vuxna möss vävnader följt av analyser av follikeln utveckling, och andra innebär användning av time-lapse imaging att visualisera tidiga follikeln utveckling under gonadotropin-oberoende scenen. Tidigare vi används denna äggstock vävnadsodling metod för att bedöma effekten av leukemi hämmande faktor och progesteron på follikeln utveckling8,9, och visade att deras effekter varierar med koncentrationen och follikeln scenen. I den aktuella studien, skivad äggstockarna vävnader uppvisade follikeln dynamics, fördjupad analys av mekanismen för utveckling av äggblåsa som använder denna modell.
Äggstockarna från möss mer än 5 veckors ålder innehåller corpus lutea som hindrar mikroskopiska observationer. Därför 4-vecka-gammal mus äggstockar är rekommenderad för observationer av follikeln utveckling och ägglossning, och efterföljande sena primära, sekundära och antral folliklar är mer lätt skiljas med ljusa fält mikroskopi. Våra metoder erbjuder jämförelser av effekterna av tillväxtfaktorer och droger i kultur media, med märkbara förändringar i follikeln utveckling mellan differentially behandlade äggstockarna (figur 3).
Transgena möss uttrycker Cre eller fluorescein proteiner i oocyter har beskrivits i tidigare studier18,19,20. Follikulär scenen klassificering beror emellertid på histologiska egenskaper inklusive granulosa cell former, numrerar av granulosa cellskikt, och huruvida theca celler bildas. Distinktioner mellan ursprungliga och primära folliklar kan således vara begränsad från observationer av oocyter ensam. Häri, vi använde transgena möss som innehåller Oog1pro3.9 och R26-H2B-mCherry transgener11,17 och visualisera tidiga follikeln utveckling från primordial till sekundär follikel stadier i odlade äggstockarna. Oog1 uttryck blir detekterbart i oocyter under primordial follikeln scenen, och ökas markant i primära folliklar. Därför AcGFP1 signal stödnivåerna i oocyter är associerade med follikeln scenen (figur 5) och användes för att iaktta primordial-primära follikeln övergångar (figur 4, kompletterande Movie 2). Cellkärna färgas röd i R26-H2B-mCherry transgena möss (figur 4, kompletterande Movie 2och kompletterande Movie 3), gör observationer av follikeln stadier enligt numrerar av granulosa celler ( (Se figur 5). Således, kollektivt de nuvarande metoderna tillåter analyser av follikeln utveckling från primordial genom att ägglossning med hjälp av Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry transgena möss. Dessutom eftersom apoptotiska celler kromatin kondenseras, är mCherry signaler av atretic folliklar starkare än de normala folliklar (kompletterande Movie 3).
Bland metodologiska subtiliteter krävs rätt tjocklekar av skivad vävnader för framgångsrik odling, med ökad celldöd i äggstocken segment som är för tjock och förluster av stora antral folliklar i äggstockarna skivor som är för tunt. Follikeln tillväxt hastighet är långsam; Därför är det lätt att spåra och analysera processen för varje follikel via 24-h intervall observation. Mikroskopet närvarande confocal inställning, inklusive laser intensitet, tidsintervall och digital vinst, är beroende av mikroskopläge, men är avgörande för att överväga när få time-lapse bilder. Särskilt stark laser stödnivåer och långa exponeringstider krävs för att ta skarpa bilder, men kan påverka odlade celler. Moderering av dessa inställningar för att undvika fototoxicitet är därför kritisk. Skivad äggstockarna vävnader i 4 veckor gamla möss kan vara odlade i cirka 4 veckor, medan primordial och primära folliklar kvar därefter, de inte längre växer. Däremot kan P0 och P4 äggstockarna vara odlade i cirka 10 dagar, under vilken primordial och primära folliklar utvecklas till primära eller sekundära folliklar, respektive. Dock utvecklas folliklar i odlade P0 och P4 äggstockar inte till antral folliklar. Därför krävs excision av äggstockarna olika skeden för studier av de regleringsmekanismer som är associerad med hela äggstocken follikeln utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Naojiro Minami (Kyoto universitet) för att tillhandahålla Oog1pro3.9 möss. Denna forskning stöddes av JSPS (KAKENHI # JP15H06275) och stiftelsen Nitto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
- Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
- Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
- Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
- Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
- Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
- Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
- Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
- Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
- Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
- Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
- Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
- Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).
