Summary
يمكن أن تستخدم كنماذج الكبدية التنمية والاباضه جريب جريب زرع الأنسجة المبيض وتشير إلى آليات تنظيمية للعمليات الدينامية المبيض.
Abstract
أوفولاتي الإناث الثدييات دورياً على عدد يكاد يكون مستمرا من بويضات خلال كل دورة السفاد. للحفاظ على مثل هذا الانتظام وتواترها، يحدث التنظيم على مستوى محور طائي جوندال الغدة النخامية وعلى تطوير المسام في المبيض. على الرغم من الدراسات النشطة، آليات التنمية المسام ليست واضحة عدة الخطوات التي تنطوي عليها من تنشيط المسام البدائية نائمة للتبويض، وبسبب تعقيد التنظيم التي تختلف في كل مرحلة من مراحل الحبيبي. للتحقيق في آليات التنمية جريب، وديناميات المسام طوال دورة السفاد، قمنا بتطوير نموذج زراعة أنسجة المبيض ماوس التي يمكن استخدامها لمراقبة التنمية المسام باستخدام مجهر. التنمية جريب منتظمة والاباضه دورية الكبدية جريب يمكن جميع تكون مستنسخة في نموذج مثقف المبيض، ويمكن أن تكون شروط الثقافة والتضمين تجريبيا. هنا، علينا أن نبدي بفائدة هذا الأسلوب في دراسة آليات تنظيمية للتنمية المسام وغيرها من الظواهر المبيض.
Introduction
الماوس الإناث المبايض تحتوي على عدة آلاف من المسام1، ونضوج التبويض الدورية حوالي عشر بويضات في كل دورة السفاد. المسام وتصنف إلى عدة مراحل النمو: البدائي، والابتدائي والثانوي، أنترال، وجراب جرافيان، اعتماداً على شكل طبقة الخلايا granulosa المحيطة بكل البويضات. معظم المسام البدائية نائمة، وبعضهم يتم تفعيلها وتنمو لتصبح المسام الأولية في كل دورة السفاد2. بعد المرحلة الثانوية جرابي، تنظمه التنمية جريب أساسا gonadotropins، جرابي تحفيز هرمون (FSH) والهرمون (LH). بيد أن التنمية جريب البدائية والأولية بشكل مستقل تروج والآليات التنظيمية التي تحكم هذه المراحل تظل سيئة إينديرستود3،،من45. بالإضافة إلى عوامل النمو والهرمونات، ينظم التفاعلات بين المسام6،7المسام البدائية والأولية. ولذلك، بإجراء تحليلات لديناميات جريب في أنسجة المبيض الماوس، والتحقيق في الآليات التنظيمية المرتبطة باستخدام زرع الأنسجة المبيض8،،من910.
هنا، نحن نقدم طريقتين نموذج زراعة أنسجة المبيض. الأولى تستخدم لتحليل التنمية جريب بقياس مناطق جرابي، ويستخدم الثاني لدراسة الآلية التنظيمية أثناء المبكرة جريب من البدائية إلى المرحلة الثانوية المسام مع الفئران المعدلة وراثيا. لتحليل التنمية جريب، استخدمنا أساسا المبايض فئران الإناث 4-الأسبوع القديمة لأنها تسمح للتصور سهلة للمسام. للحث على الإباضة الدورية ونموذج التنمية في فيفو جريب، نحن استنسخت طفرة LH والاباضه الملاحظة، والكبدية المسام وإفراز الاستراديول تحت ظروف زراعة الأنسجة. تم القبض على الصور لاستزراع المبيض، وتم تحليل عمليات التنمية جريب بتتبع التغييرات في منطقة جرابي. ومع ذلك، في الحقل مشرق تحليلات مجهرية، التمييز بين المسام الأولية البدائية وأوائل الواضح. وبالتالي، قمنا بتطوير أسلوب للكشف عن المسام الصغيرة، والتمييز بين البدائي، الابتدائي، ومثقف جريب الثانوية في أنسجة المبيض باستخدام Oogenesin1 pro3 (Oog1)- 9 والمبايض R26-H2B-مشري الفئران المعدلة وراثيا في الأيام 0 و 4 بعد الولادة11. التعبير Oog1 قابلاً للاكتشاف في بويضات بعد الدخول إلى الانقسام، ويزيد تدريجيا مع التنمية المسام، مما يتيح رصد الانتقال من البدائي للمسام الأولية باستخدام الصور الوقت الفاصل بين أنسجة المبيض مثقف11 ،12. على الرغم من أن قد استخدمت الطرق المورفولوجية لدراسة العوامل التي تنشيط المسام البدائية نائمة13،14،،من1516، التنمية جريب الفسيولوجية في المبيضين صعوبة في مراقبة، ولا تزال آثار العوامل المختلفة أونتشاراكتيريزيد. وصممت أساليب الثقافة الحالية لمعالجة هذه الندرة في الوقت الحقيقي تحليلات عوامل الهدف.
في هذه الدراسة، ونحن تتبع التنمية الحبيبي باستخدام طريقة تصوير الوقت الفاصل بين وتتميز عملية التنمية جريب. لدينا أساليب مبتكرة توفر أداة غير مسبوقة للتحقيق فسيولوجيا المبايض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إيواء الفئران في غرفة التحكم بيئياً في 23 ± 1 درجة مئوية مع ح 12 ضوء/12 ح دورة الظلام. بروتوكولات الرعاية الحيوانية وتجارب أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية "التجارب الحيوانية" في جامعة الطب إيشي ووافقت عليها واجب رعاية الحيوانات واستخدام اللجنة.
1-إعداد الثقافة المتوسطة وأطباق
- إعداد الأساسية الثقافة المتوسطة، إضافة المصل الجنيني البقري (FBS، 5% v/v)، FSH (100 mIU/mL)، LH (10 mU/mL)، والبنسلين-ستربتوميسين (البنسلين، يو/مليلتر 100؛ ستربتوميسين، 100 مغ/مل) إلى الحد الأدنى الأساسية المتوسطة ألفا (MEM-ألفا) ومزيج في أنابيب 50 مل.
ملاحظة: مجموع أحجام الوسائط الثقافة المطلوبة تختلف بين التجارب، ولكن 1 مل من الثقافة المتوسطة يكفي بوجه عام عن 3.5 سم أسفل الزجاج ثقافة الأطباق. - صب مختبرين 1 مل من مختلطة الثقافة المتوسطة في 3.5 سم أسفل الزجاج ثقافة الأطباق وتعيين مكان مم 30 خلية إدراج الثقافة في الأطباق. وسائل الإعلام قبل الحارة والاطباق في حاضنة (5% CO2 و 37 درجة مئوية).
2-إعداد أنسجة المبيض
- فوسفات الحارة قبل مخزنة المالحة (PBS) (−) والفنزويلية-ألفا التي تحتوي على 5% FBS و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 مغ/مل في حاضنة (5% CO2 و 37 درجة مئوية).
ملاحظة: حوالي 3 مل مختبرين "برنامج تلفزيوني" (−) كل المبيض تكفي للاستخدام أثناء تشريح المبيض، ومختبرين 1 مل من MEM-ألفا كافية لتخزين عابر المبايض واحد في الأطباق 3.5 سم. -
المكوس المبايض من الفئران الممثل المدني الدولي (المسماة بعد معهد أبحاث السرطان) الإناث 4-الأسبوع القديمة وقطع الأنسجة المحيطة بالمبيض باستخدام مقص وملاقط تحت مجهر مجسمة. احتياطي المبيض تمت إزالتها في الثقافة المتوسطة (راجع الخطوة 2، 1) حتى الاستخدام.
- قبل استعد مكان المبايض واحدة على ورقة تصفية مبلل مع "برنامج تلفزيوني" (−) (راجع الخطوة 2، 1) وشريحة إلى 4 قطع باستخدام شفرة مبضع تحت مجهر مجسمة.
ملاحظة: المبايض فئران الممثل المدني الدولي 4-الأسبوع القديمة حوالي 2 ملم في القطر. عدد القطع يعتمد على حجم المبيض؛ بيد أن حوالي 500 ميكرومتر سميكة قطعة تسمح للملاحظات جريب السليم (في قطع أكثر سمكا من 500 مم، انخفض الأنسجة الشفافية؛ وكسر المسام antral العديد من القطع أرق من 500 ملليمتر، وفقدت). - بعد التشريح، وضع العينات المبيض شرائح في مستنبت المعالجون مسبقاً في الأطباق 3.5 سم (راجع الخطوة 2، 1).
- قبل استعد مكان المبايض واحدة على ورقة تصفية مبلل مع "برنامج تلفزيوني" (−) (راجع الخطوة 2، 1) وشريحة إلى 4 قطع باستخدام شفرة مبضع تحت مجهر مجسمة.
3. زراعة أنسجة المبيض
- إسقاط حوالي 0.5 ميليلتر من المتوسطة الثقافة الواحدة وشرائح أنسجة المبيض على إدراج الثقافة الخلية حيث سيتم أنسجة المبيض تعيين باستخدام ميكروبيبيتي.
- ضع كل شرائح العينة إلى انخفاض المتوسط الثقافة على إدراج الثقافة الخلية باستخدام الملقط.
- الثقافة أنسجة المبيض في 5% CO2 في 37 درجة مئوية.
- استبدال المتوسطة الثقافة مع متوسط حرارة قبل جديدة كل يومين.
ملاحظة: الجدول الزمني للتغييرات متوسطة لثقافة المقاطع المبيض من الفئران الممثل المدني الدولي 4-الأسبوع القديم يرد في الشكل 1.- إنتاج طفرة LH, علاج مثقف المبايض الفئران الممثل المدني الدولي 4-الأسبوع القديمة مع المتوسط التي تحتوي على 100 مو/مل FSH و LH ح 12 كل 4 أيام (الشكل 1).
4-المجهر الصور لاستزراع المبيض
- بدء التصوير المبايض مثقف بعد يوم 1 عندما انضمت الأنسجة على إدراج الثقافة في الخلية، وإجراء تحليلات مجهر [كنفوكل] أو مقلوب في فترات ح 24 للسماح بنمو جريب كافية بين النقاط الزمنية.
ملاحظة: الفحص المجهري [كنفوكل] متفوقة على المجهر المقلوب لمراقبة المسام في المبيض كله مثقف.
5-الوقت الفاصل بين التصوير لاستزراع المبيض
-
تحسين ظروف الوقت الفاصل بين التصوير، بما في ذلك كثافة الليزر وأوقات التعرض لنظام التصوير (الجدول 1).
- تحديد العينات المزدوجة المبيض من الفئران واحدة للاستخدام كمجموعات العلاج والتحكم. وتختلف كثافة الليزر ووقت التعرض تحقيق أفضل الصور (الجدول 1).
- مقارنة نمو جريب تحت كل شرط الثقافة عن طريق قياس المجالات جريب في صور عينات التحكم في فترات ح 24 وفي الوقت الفاصل بين العينات التصوير (راجع الخطوة 6). وفي الوقت نفسه، عد من بويضات أوفولاتيد في كل مجموعة المبيض واختيار أفضل الظروف الوقت الفاصل بين التصوير.
- التقاط الصور في فواصل 30 دقيقة باستخدام الوقت الفاصل بين نظام التصوير ظروف محددة (الجدول 1).
6-تحليل النمو جريب
-
لتحليل وضع جريب، قياس مجالات جريب في الصور التي تم التقاطها باستخدام برنامج إيماجيج (http://resbweb.nih.gov/ij/).
- في البداية، بتعيين حجم الصورة بواسطة النقر فوق "ضبط مقياس" تحت "تحليل" في شريط الأدوات. أدخل طول الجانب من الصورة التي تم التقاطها والأرقام المقابلة بكسل في الحقول الفارغة من "المسافة المعروفة باسم" و "المسافة بالبكسل"، على التوالي.
- انقر فوق "اليد الحرة" في شريط الأدوات، ومخطط المسام في الصور الميدانية مشرق الملتقطة.
- انقر فوق "إجراء" إطار "تحليل" في شريط الأدوات.
ملاحظة: إذا هي رغبت في بيانات القياس الأخرى، انقر فوق "تعيين القياس" تحت "تحليل" في شريط الأدوات، والتحقق من المربعات المناسبة في القائمة.
7-تحليل التنمية المسام باستخدام الفئران المعدلة وراثيا
- جمع المبايض من شريحة يوما بعد الولادة 0 و 4 (P0 و P4) أنثى الفئران المعدلة وراثيا التي تتضمن في المتسلسلات Oog1pro3.9 و R26-H2B-مشير، والثقافة على إدراج كما هو موضح في الخطوات 1.1 – 3.2، إلا إذا لم تقم بذلك P0 والمبايض P4.
- استبدال المتوسطة الثقافة المتوسطة الطازجة، والمعالجون مسبقاً في الأطباق 3.5 سم في حاضنة الذي يحتوي على 5% CO2 في 37 درجة مئوية كل يومين.
ملاحظة: تركيز LH في الأجلين المتوسط وثقافة من المبايض P0 و P4 يمكن أن تظل ثابتة لأن لا تحدث العواصف LH في الفئران P0 و P4. - تعيين المجهر لتصور فقط إيجابية AcGFP1 المسام الأولية في المبيضين P4 المستزرعة (الجدول 1).
ملاحظة: المسام الأساسي والابتدائي فقط موجودة في المبيضين الماوس الإناث P4. - التقاط الصور من مثقف P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-مشري المبايض الفئران المحورة وراثيا على فترات 30 دقيقة باستخدام الإعدادات المستخدمة المبايض P4 (راجع الخطوة 5، 2).
- تتبع وتحليل التنمية المسام باستخدام الإشارات AcGFP1 ومشري H2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 البروتوكول المتعلق بالتغييرات في وسائل الإعلام أثناء زراعة أنسجة المبيض. وبعد هذا البرنامج، عمرها 4 الأسبوع الممثل المدني الدولي الفئران المبايض مثقف وتصويرها على فترات 24-ح استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] (الشكل 2). خلال ثقافة أنسجة المبيض لمدة 3 أسابيع، كانت تحولت معظم المسام أنترال والثانوي قبل الكبدية المسام وبعضها أوفولاتيد (الشكل 2د و الجدول 2). في تحليل المناطق المسام باستخدام إيماجيج (الشكل 3)، وضعت بعض المسام في مجموعات خلال كل دورة من دورات الطفرة LH (الشكل 3ب والتكميليه فيلم 1). وعلاوة على ذلك، حدثت الإباضة في وقت متزامن تقريبا في المبايض مثقف منفصلة من المبيضين الأيمن والأيسر من الفئران واحدة. بينما توقيت الإباضة وأرقام من بويضات أوفولاتيد (الجدول 2) تختلف بين المبيضين الماوس (البيانات لا تظهر)، التبويض من المبيضين مثقف حدث غالباً ضمن ح 48 من العواصف LH(الشكل 3، و تكميلية فيلم 1). بيد أن ليست جميع بويضات أوفولاتيد صدر أول القطبي الهيئات بعد الإباضة (الشكل 2ه و الجدول 2) وعلى الرغم من أن يمكن إخصاب بويضات أوفولاتيد، توقفت التنمية في المرحلة 4 خلايا (البيانات لا تظهر). توضيح الآليات التي يتم تنشيط المسام البدائية نائمة في المبيضين الماوس، اكتشفنا تنشيط المسام البدائية في الأنسجة المستزرعة من الفئران المحورة وراثيا تحمل Oog1pro3.9 و R26-H2B-مشري (المتسلسلات الرقم 4و الشكل 5، و فيلم تكميلي 2). بويضات التعبير عن مستويات منخفضة جداً من الجينات Oog1 من مرحلة جريب البدائية، والوقت الفاصل بين التصوير تميز المسام أساسية منخفضة إذ تعرب عن AcGFP1 عن المسام الأولية عالية إذ تعرب عن AcGFP1. المسام البدائية والأولية موجودة في نفس الوقت في المبايض الماوس P4، بينما فقط البدائية المسام موجودة في المبيضين P0 (الشكل 4أ، ب). وهكذا، نحن الأمثل الوقت الفاصل بين ظروف التصوير للكشف عن المسام الابتدائي فقط في المبيضين P4 المستزرعة (الشكل 4ج). وفي وقت لاحق، ألقينا القبض على الصور من مثقف P0 المبايض لمدة 10 أيام في نفس الظروف (الشكل 4د – ز). AcGFP1 يمكن أن تستخدم كمؤشر المسام الأولية في هذه الفئران المحورة وراثيا والمسام AcGFP1 الإيجابية الأولية كانت قابلة للكشف في مثقف P0 المبايض بعد ثقافة ح 30-40 (الشكل 4و الشكل 5واو، و التكميلية فيلم 2). المسام البدائية والأولية في المبيضين مثقف تتميز أيضا بإيجابية مشري نويات الخلايا granulosa (الشكل 5ب من ه). على وجه التحديد، إشارات مشري تشير إلى أشكال المسام وتسمح بالمراقبة لمراحل جريب في المبايض المستزرعة (الشكل 5ب، ه، و H). ولذلك، هذا النظام ثقافة استخدام المبيض من Oog1pro3.9/R26-H2B-مشري الفئران كشفت عملية التنمية جريب المبكر من البدائي للمراحل الثانوية جريب. وستيسر هذه الأساليب دراسات الآليات التنظيمية للتنمية المستقلة تروج جريب.
الشكل 1 : الوقت بالطبع من التغييرات متوسطة. المتوسط A يحتوي على 5% FBS، 100 مو FSH، LH مو 10 و 100-U/mL البنسلين والستربتوميسين 100 مغ/مل في MEM-ألفا. يتضمن المتوسطة ب 5% FBS، 100 مو FSH، LH مو 100 و 100-U/mL البنسلين والستربتوميسين 100 مغ/مل في MEM-ألفا. المتوسطة ب استخدمت لإنتاج طفرات LH كل 4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : صور أنسجة المبيض مثقف. تم القبض على الصور في فواصل 24 ساعة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. (أ) الثقافة يوم 1؛ (ب) يوم الثقافة 5؛ (ج) الثقافة اليوم 10؛ (د) الثقافة يوم 13؛ (ﻫ) صورة ماجنيفيد من منطقة أشارت إلى جانب المربع (d)؛ وقد أوفولاتيد بويضات في د من المسام هو مبين بالأسهم في باء وجيم، ودال-البويضيه (و) الإفراج عن هيئة القطبية بعد الإباضة؛ شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : قياسات جريب المناطق المستزرعة المبايض. (أ) صورة المبيض مثقف؛ وتمثل الخطوط المنقطة منطقة يقاس إيماجيج. (ب) المناطق الحبيبي في استزراع المبيض بعد 3 أسابيع؛ وتمثل الخطوط الرمادية فترة الثقافة من إضافة 100 ملم LH (LH الطفرة). إظهار خطوط مراحل التنمية في كل جريب في المبيض مثقف؛ شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : الصور المصبوغة (H & E) الهيماتوكسيلين وويوزين المبايض P0 و P4 والوقت الفاصل بين التصوير. (أ) ح & ه تلطيخ من P0 المبيض؛ (ب) ح & ه تلطيخ من P4 المبيض؛ (ج) صورة المبيض P4 من ماوس المحورة وراثيا Oog1pro3.6 بعد ثقافة ح 10. يظهر السهم جريب AcGFP1 إيجابية الأولية. (د – ز) صور المبايض P0 من الفئران المحورة وراثيا الإعراب عن Oog1pro3.9 و R26-H2B-متشيري؛ وتمثل الإشارات الخضراء والحمراء في د وو AcGFP1 ومشري، على التوالي. الأبيض إشارات في ه وز تمثل AcGFP1 في د وو، على التوالي. D و E صور المبايض مثقف بعد ثقافة ح 0.5. F و G تظهر المبايض بعد ح 180 الثقافة؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: صور تجاويف الأساسي والابتدائي، والثانوي في المبيضين مثقف من oog1pro3.9/متشيري/R26-H2B الفئران. (أ–ج) صور جراب البدائية في مثقف P0 المبايض؛ (د–و) صور جراب الابتدائية في المبيض P0 مثقف؛ (حمنغ–) صور جراب الثانوية في المبيضين مثقف عمرها 4 الأسبوع الماوس. أ ود وز بالصور المدمجة من ب وج وهاء وواو، وحاء وطاء، على التوالي. الأخضر، AcGFP1؛ مشري أحمر،؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| مجهر | عدسة الهدف | ليزر | التعرض (مللي ثانية) | الحصول على | الفاصل الزمني | ض-المكدس | الآخرين | الأرقام والأفلام |
| CV1000 | X10 | 488 نانومتر: 30، 561 شمال البحر الأبيض المتوسط: 20 | 488 نانومتر: 700، 561 شمال البحر الأبيض المتوسط: 600 | 488 نانومتر: 90، 561nm: 20 | 30 دقيقة | 5 مم | الشكل 4 ج-ز، فيلم 1 و 2 | |
| BZ-X700 | X20 (مع جمع ذوي الياقات البيضاء) | 40% | تلقائي | X4 | 30 دقيقة | 10 ملم | binning 3 × 3 | فيلم 3 |
| LSM710 | X10 | 488 نانومتر: 6 في المائة، و 564 نانومتر: 5% | سرعة الكاميرا: 4 | 488 نانومتر: 850، 564 نانومتر: 850 | ح 24 | 10 ملم | الحصول على رقمي، 488 نانومتر: 2، 564 nm:1 | الشكل 2، 3 و 5 |
الجدول 1: الوقت الفاصل بين التصوير الظروف. الوقت الفاصل بين التصوير شرط المجاهر الحقل [كنفوكل] ومشرق.
| المبيض لا. | عدد إجمالي من بويضات أوفولاتيد | عدد بويضات صناعة المعلومات |
| 1 | 7 | 2 |
| 2 | 19 | 9 |
| 3 | 14 | 6 |
| 4 | 7 | 3 |
| 5 | 12 | 4 |
| 6 | 15 | 6 |
| 7 | 25 | 11 |
| 8 | 13 | 3 |
| 9 | 11 | 7 |
| 10 | 19 | 8 |
| 11 | 18 | 4 |
| 12 | 7 | 1 |
الجدول 2: أرقام بويضات أوفولاتيد في المبيضين مثقف. أرقام بويضات أوفولاتيد من المبايض مثقف اثنا عشر؛ صناعة المعلومات يشير إلى عدد بويضات أوفولاتيد التي تم إصدارها أول القطبي الهيئات بعد الإباضة.
التكميلية الفيلم 1: الوقت الفاصل بين الفيلم من المبيض مثقف. جمعت من الفئران 4-الأسبوع القديمة المبايض وكانت شرائح ومثقف لمدة 3 أسابيع. الفيلم يمتد لفترة ثقافة من 0-200 ح في إطارات 10/ س. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
التكميلية الفيلم 2: فيلم الوقت الفاصل بين من المبيض P0 مثقف من ماوس المعدلة وراثيا- الأخضر، AcGFP1؛ أحمر، مشري. الفيلم يمتد لفترة ثقافة من 0-180 ح في إطارات 10/ س. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
فيلم التكميلية 3: الوقت الفاصل بين الفيلم من المبيض مثقف من ماوس 4 أسبوع من العمر. الأخضر، AcGFP1؛ الأحمر؛ مشري؛ الفيلم يمتد لفترة ثقافة أيام الثقافة 9 – 13 10 الإطارات في الثانية. وتشير الأسهم في الصورة الأولى إلى المسام الكبدية التي وقعت خلال الثقافة. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، قمنا بتطوير أسلوبي جديد لدراسة التنمية جريب في المبيضين الماوس. الأسلوب الأول ينطوي على ثقافة الفئران الكبار المبيض شرائح الأنسجة متبوعاً بتحليلات للتنمية جريب، والثاني ينطوي على استخدام الوقت الفاصل بين التصوير لتصور التنمية جريب المبكرة مرحلة مستقلة تروج. سابقا، استخدام أسلوب زراعة أنسجة المبيض الحالي لتقييم أثر العوامل المثبطة اللوكيميا والبروجسترون على جريب التنمية8،9، وتبين أن آثارها تختلف مع مرحلة التركيز والمسام. في هذه الدراسة، شرائح أنسجة المبيض معارضها جريب الديناميات، التي تتطلب مزيدا من التحليلات لآلية التنمية جريب المبيض باستخدام هذا النموذج.
تحتوي المبايض من الفئران لأكثر من 5 أسابيع عمر صفراء الإحضار التي تعيق الملاحظات المجهرية. ومن ثم، المبايض الماوس عمرها 4 الأسبوع المفضل للملاحظات للتنمية المسام والاباضه، وتتميز اللاحقة المسام أواخر الابتدائي والثانوي، وأنترال بسهولة أكبر باستخدام مجهر الحقل مشرق. أساليب عملنا ونقدم مقارنات لآثار عوامل النمو والمخدرات في ثقافة وسائل الإعلام، مع تغيرات ملحوظة في التنمية المسام بين المبيضين الأثران المعالجة (الشكل 3).
وقد وصف الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات العرقية أو فلوريسسين في بويضات في الدراسات السابقة18،،من1920. ومع ذلك، تصنيف المرحلة جرابي يتوقف على غذائها الخصائص بما في ذلك granulosa الخلية الأشكال، الأرقام من طبقات الخلايا granulosa، وما إذا كان يتم تشكيل خلايا القراب. وهكذا، قد تكون الفروق بين المسام البدائية والأولية محدودة من ملاحظات بويضات وحدها. هنا، نحن استخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تحتوي على Oog1pro3.9 و R26-H2B-مشري المتسلسلات11،17 وتصور المبكرة جريب من البدائية إلى مراحل جريب ثانوي في المبيضين مثقف. التعبير Oog1 تصبح قابلة للكشف في بويضات المرحلة البدائية جريب، وهو زيادة ملحوظة في المسام الأولية. ومن ثم، كثافة إشارة AcGFP1 في بويضات مقترنة بمرحلة جريب (الشكل 5) واستخدمت لمراقبة التحولات جريب البدائي-الابتدائية (الشكل 4، 2 فيلم التكميلية). نواة الخلية هي الملون الأحمر في R26-H2B-مشري الفئران المحورة وراثيا (الشكل 4، التكميلية الفيلم 2و 3 فيلم التكميلية)، يسمح الملاحظات من مراحل جريب وفقا لأرقام (الخلايا granulosa الشكل 5). وهكذا، مجتمعة تسمح الأساليب الحالية تحليلات للتنمية جريب من البدائية من خلال الإباضة باستخدام Oog1pro3.9/R26-H2B-مشري الفئران المعدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك، لأنه هو مكثف apoptotic خلية الكروماتين، إشارات مشري من المسام أتريتيك أقوى من تلك المسام العادي (3 فيلم التكميلية).
بين الدقيقة المنهجية، سمك الصحيح من شرائح الأنسجة المطلوبة لاستزراع الناجحة، مع موت الخلايا زيادة في الشرائح المبيض التي تكون سميكة جداً، والخسائر في المسام أنترال كبير في شرائح المبيض التي رقيقة جداً. سرعة نمو جريب بطيء؛ ومن ثم، فمن السهل لتتبع وتحليل عملية كل المسام عن طريق الملاحظة 24-ح الفاصل الزمني. المجهر [كنفوكل] هذا الإعداد، بما في ذلك كثافة الليزر والفاصل الزمني للوقت، وكسب الرقمية، اعتماداً على وضع مجهر، ولكن ذات الأهمية الحاسمة لأخذها في الاعتبار عند الحصول على الوقت الفاصل بين الصور. على وجه الخصوص، كثافة الليزر القوية والتعرض لأوقات طويلة المطلوبة لالتقاط صور واضحة، ولكن يمكن أن يؤثر على الخلايا المزروعة. ومن ثم فإن الاعتدال من هذه الإعدادات لتجنب الضيائية أمر بالغ الأهمية. يمكن أن تكون مثقف شرائح أنسجة المبيض فئران عمرها 4 في الأسبوع لمدة 4 أسابيع تقريبا، بينما تظل المسام البدائية والأولية موجودة في وقت لاحق، أنها لم تعد تنمو. وفي المقابل، يمكن مثقف المبايض P0 و P4 لحوالي 10 أيام, خلالها تطوير المسام البدائية والأولية إلى المسام الابتدائي أو الثانوي، على التوالي. ومع ذلك، لا تتطور المسام في المبيضين P0 و P4 مثقف في المسام antral. ولذلك، مطلوب استئصال المبايض في المراحل المختلفة للدراسات المتعلقة بالآليات التنظيمية المرتبطة بالتنمية جريب المبيض كله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور مينامي ناوجيرو (جامعة كيوتو) لتوفير الفئران Oog1pro3.9 . أيد هذا البحث JSPS (كاكينهي # JP15H06275) ومؤسسة نيتو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
- Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
- Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
- Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
- Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
- Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
- Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
- Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
- Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
- Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
- Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
- Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
- Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).
