Summary
Æggestokkene vævskulturer kan bruges som modeller for follikel udvikling, ægløsning og follikel atresi og angive reguleringsmekanismer af dynamiske æggestokkene processer.
Abstract
Pattedyr hunner ægløsning regelmæssigt en næsten konstant antal oocyter under hver estrus cyklus. For at opretholde sådan regelmæssighed og hyppighed, opstår forordning på hypothalamus-hypofyse-gonadale akse og på udvikling af follikler i æggestokkene. Trods aktive undersøgelser er follikel udvikling mekanismer ikke klare på grund af de flere trin involveret fra hvilende primordiale follikel aktivering til ægløsning, og forordningens kompleksitet, der er forskellig på hver follikulære fase. For at undersøge mekanismerne af follikel udvikling og dynamikken i follikler i hele estrus cyklus, udviklede vi en mus æggestokkene vævskultur model, der kan bruges til at observere follikel udvikling ved hjælp af et mikroskop. Systematisk follikel udvikling, periodiske ægløsning og follikel atresi kan alle gengives i modellen kulturperler æggestokken, og dyrkningsbetingelserne kan moduleres eksperimentelt. Her, påvise vi nytten af denne metode i studiet af de reguleringsmekanismer follikel udvikling og andre æggestokkene fænomener.
Introduction
Kvindelige mus æggestokke indeholder flere tusinde follikler1, og periodiske ægløsning modnes cirka ti oocyter på hver estrus cyklus. Follikler er inddelt i flere udviklingsstadier: primordial, primær, sekundær, antral, og Graafsk follikler, afhængig af, hvilken granulosa cellulære lag omkring hvert oocyt. De fleste primordiale follikler er i dvale, og nogle af dem er aktiveret og vokse ind i primære follikler på hver estrus cyklus2. Efter den sekundære follikulære fase, er follikel udvikling hovedsagelig reguleret af gonadotropiner, follikulært stimulerende hormon (FSH) og luteiniserende hormon (LH). Dog primordial og primære follikel udvikling er uafhængig af gonadotropin, og de regulerende mekanismer, der styrer disse stadier forbliver dårligt inderstood3,4,5. Ud over vækst faktorer og hormoner, er ur og primære hårsækken reguleret af interaktionerne mellem follikler6,7. Derfor, vi udførte analyser af follikel dynamics i mus æggestokkene væv, og undersøgt de tilknyttede reguleringsmekanismer ved hjælp af æggestokkene vævskulturer8,9,10.
Heri, introducere vi to æggestokke vævskultur model metoder. Først bruges til at analysere follikel udvikling af måling af follikulært områder, og andet bruges til at studere den regulerende mekanisme i den tidlige follikel udvikling fra ur til sekundære follikel fase med Transgene mus. For follikel udvikling analyse brugte vi hovedsageligt æggestokkene af 4 - uger gamle hunmus fordi de giver mulighed for nem visualisering af follikler. For at fremkalde periodiske ægløsning og model i vivo follikel udvikling, gengivet vi LH surge og observerede ægløsning, follikel atresi og sekretion af estradiol vævskultur betingelser. Billeder af kulturperler æggestokkene blev erobret, og udviklingsprocesser follikel blev analyseret af sporing af ændringer i området follikulært. Men i lysfelt mikroskopi analyser, sondringen mellem primordial og tidlige primære follikler var uklart. Dermed, vi udviklet en metode til at opdage små follikler, og skelne mellem primordial, primære, og sekundære follikel i kulturperler æggestokkene væv ved hjælp af Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 og R26-H2B-mCherry Transgene mus æggestokkene på dage 0 og 4 efter fødslen11. Oog1 udtryk kan spores i oocyter efter ibrugtagning meiose, og øges gradvist med follikel udvikling, giver mulighed for observation af overgangen fra primordial til primære follikler ved hjælp af time-lapse billeder af kulturperler æggestokkene væv11 ,12. Selvom morfologiske metoder har været brugt til at studere faktorer, der aktiverer hvilende primordiale follikler13,14,15,16, er fysiologiske follikel udvikling i æggestokkene vanskeligt at observere, og virkningerne af forskellige faktorer forblive uncharacterized. De nuværende kultur metoder var designet til at løse denne mangel i realtid analyser af target faktorer.
I den foreliggende undersøgelse, vi sporede follikulære udvikling ved hjælp af en time-lapse billedmetoden og karakteriseret processen med udvikling af hårsækken. Vores nye metoder giver en hidtil uset værktøj for at undersøge fysiologi af æggestokkene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus har været opstaldet i en miljømæssigt kontrolleret værelse på 23 ± 1 ° C med en 12-timers lys/12 h mørke cyklus. Dyrs pleje protokoller og eksperimenter blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for dyr eksperimenter på Aichi medicinske universitet og blev godkendt af det etablerede dyrs pleje og brug udvalg.
1. forberedelse af dyrkningsmediet og retter
- For at forberede grundlæggende næringssubstrat, tilføje føtal bovint serum (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL), og penicillin-streptomycin (penicillin, 100 U/mL, streptomycin, 100 mg/mL) til minimum afgørende medium alpha (MEM-alpha) og mix i 50 mL rør.
Bemærk: Samlede diskenheder kræves kultur medier varierer mellem eksperimenter, men 1 mL af næringssubstratet er normalt tilstrækkeligt for 3,5 cm glas-bund kultur retter. - Hæld 1 mL alikvoter af blandet næringssubstratet i 3,5 cm glas-bund kultur retter og sætte sted 30 mm celle kultur skær i retter. Pre varm medier og retter i en inkubator (5% CO2 og 37 ° C).
2. forberedelse af æggestokkene væv
- Pre varm fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (−) og MEM-alpha indeholdende 5% FBS, 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin i en inkubator (5% CO2 og 37 ° C).
Bemærk: Ca. 3 mL alikvoter af PBS (−) pr. æggestokken er tilstrækkelige til brug under æggestokken dissektioner, og 1 mL alikvoter af MEM-alpha er tilstrækkeligt transient oplagring af enkelt æggestokkene i 3,5 cm retter. -
Punktafgifter æggestokke fra 4 - uger gamle hunmus ICR (opkaldt efter Institute of Cancer Research) og trim væv omkring æggestokkene ved hjælp af saks og pincet under en stereoskopisk mikroskop. Reserve fjernet æggestokkene dyrkningsmedium (Se trin 2.1) indtil brug.
- Sted enkelt æggestokkene på filtrerpapir fugtet med pre varmede PBS (−) (Se trin 2.1) og skive i 4 stykker med en mikrotom blade under en stereoskopisk mikroskop.
Bemærk: Æggestokkene af 4 - uger gamle ICR mus er omkring 2 mm i diameter. Antallet af stykker afhænger af æggestokken størrelse; men omkring 500 µm tykke stykker mulighed for ordentlig follikel observationer (i stykker tykkere end 500 mm, væv gennemsigtighed er faldet, i stykker tyndere end 500 mm, mange antral follikler er brudt og tabt). - Efter dissektion, læg skiver æggestokken prøver i pre varmede næringssubstratet i 3,5 cm retter (Se trin 2.1).
- Sted enkelt æggestokkene på filtrerpapir fugtet med pre varmede PBS (−) (Se trin 2.1) og skive i 4 stykker med en mikrotom blade under en stereoskopisk mikroskop.
3. æggestokkene væv kultur
- Drop ca 0,5 µL af næringssubstratet pr. skiver æggestokkene væv på celle kultur Indsæt hvor æggestokkene væv vil blive indstillet med en mikropipette.
- Læg hver skåret modellen i en dråbe af næringssubstratet på celle kultur skær med pincet.
- Kultur æggestokkene væv i 5% CO2 ved 37 ° C.
- Erstatte næringssubstratet med friske pre varmede medium hver 2 dage.
Bemærk: Tidsplan for mellemstore ændringer for kulturen i æggestokken sektioner fra 4 - uger gamle ICR mus er præsenteret i figur 1.- For at gengive LH surge, behandle kulturperler 4 - uger gamle ICR mus æggestokkene med medium indeholdende 100 mU/mL FSH og LH i 12 timer hver 4 dage (figur 1).
4. mikroskop billeder af kulturperler æggestokke
- Start imaging kulturperler æggestokkene efter dag 1 når væv har overholdt på celle kultur skær, og udføre Konfokal eller omvendt mikroskop analyser på 24 h intervaller til at give tilstrækkelig follikel vækst mellem tidspunkter.
Bemærk: Konfokal mikroskopi er overlegen i forhold til inverted mikroskopi for observere follikler i hele kulturperler æggestokke.
5. time-lapse billeddannelse af kulturperler æggestokke
-
Optimere time-lapse imaging betingelser, herunder laser Støtteintensiteter og eksponeringstider for billedbehandlingssystem (tabel 1).
- Vælg parret æggestokken prøver fra enkelt mus til brug som behandling og kontrol grupper. Variere laser Støtteintensiteter og eksponeringstid at opnå de bedste billeder (tabel 1).
- Sammenlign follikel vækst under hver kultur betingelse ved at måle follikel områder i billeder af kontrolprøver med 24 timers mellemrum og i time-lapse imaging prøver (Se trin 6). Samtidigt, tælle antallet af ægløsning oocyter i hver æggestok sæt og vælge de optimale time-lapse imaging betingelser.
- Fange billeder henne ved 30 min. mellemrum ved hjælp af time-lapse imaging system bestemmes betingelser (tabel 1).
6. follikel vækst analyse
-
For at analysere follikel udvikling, måle follikel områder i billederne ved hjælp af ImageJ software (http://resbweb.nih.gov/ij/).
- I første omgang, angive omfanget af billedet ved at klikke på "Angiv skala" under "Analyze" i værktøjslinjen. Indtast side længder af billedet og det tilsvarende antal pixel i de tomme felter "Kendt afstand" og "Afstanden i pixel", henholdsvis.
- Klik på "Frie hænder" i værktøjslinjen og skitsere follikler i de erobrede lysfelt billeder.
- Klik på "Foranstaltning" under "Analyze" i værktøjslinjen.
Bemærk: Hvis andre måledata er ønsket, klik på "Opret måling" under "Analyze" i værktøjslinjen, og Marker de relevante felter på listen.
7. analyse af follikel udvikling ved hjælp af Transgene mus
- Indsamle æggestokke fra postnatal dage 0 og 4 (P0 og P4) kvindelige Transgene mus indeholdende transgener Oog1pro3.9 og R26-H2B-mCherrog kultur på skær som beskrevet i trin 1.1 – 3.2, undtagen ikke skive P0 og P4 æggestokke.
- Erstatte næringssubstratet med friske, pre varmede medium i 3,5 cm retter i en inkubator indeholdende 5% CO2 ved 37 ° C hver 2 dage.
Bemærk: Koncentrationen af LH i dyrkningsmediet af P0 og P4 æggestokke kan forblive konstant, fordi LH overspænding ikke forekommer i P0 og P4 mus. - Sæt mikroskop til at visualisere kun AcGFP1-positive primære follikler i kulturperler P4 æggestokke (tabel 1).
Bemærk: Kun primordial og primære follikler er til stede i P4 kvindelige mus æggestokke. - Fange billeder af kulturperler P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry Transgene mus æggestokkene med 30 min. mellemrum ved hjælp af de indstillinger, der bruges til P4 æggestokke (Se trin 5.2).
- Spore og analysere follikel udvikling ved hjælp af AcGFP1 og H2B-mCHerry signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser protokol for ændringer i medierne i æggestokkene vævskultur. Efter dette program, 4 uger gamle ICR mus æggestokke var kulturperler og afbildet på 24-h intervaller ved hjælp af Konfokal mikroskopi (figur 2). Under kultur af æggestokkene væv i 3 uger, mest antral og sekundære follikler var degenereret af follikel atresi og nogle var ægløsning (figur 2D og tabel 2). I analysen af follikel områder ved hjælp af ImageJ (figur 3), udviklet nogle follikler i grupper under hver LH surge cyklus (figur 3B og supplerende Movie 1). Desuden indtraf ægløsning næsten samtidig i separate kulturperler æggestokke fra højre og venstre æggestokkene af enkelt mus. Paa tidspunktet for ægløsning og antal af ægløsning oocyter (tabel 2) varierede mellem mus æggestokke (data ikke vist), opstod ægløsning fra kulturperler æggestokkene overvejende inden for 48 timer af LH overspænding (figur 3, og tillægs Film 1). Dog ikke alle ovulated oocyter udgivet første polar organer efter ægløsning (figur 2E og tabel 2), og selv om ægløsning oocyter kunne blive befrugtet, udvikling ophørt på 4-celle stadium (data ikke vist). For at belyse mekanismerne som hvilende primordiale follikler er aktiveret i mus æggestokke, opdaget vi primordiale follikel aktivering i kulturperler væv fra Transgene mus transporterer Oog1pro3.9 og R26-H2B-mCherry transgener ( Figur 4, figur 5og supplerende Movie 2). Oocytter udtrykke meget lave niveauer af Oog1 -genet fra det primordiale follikel stadium, og time-lapse imaging skelnes lav AcGFP1-udtrykker primordiale follikler fra de høje AcGFP1-udtrykker primære follikler. Primordial og primære follikler er til stede samtidig i P4 mus æggestokkene, mens kun primordiale follikler er til stede i P0 æggestokke (figur 4A, B). Dermed, vi optimeret time-lapse imaging betingelser for at detektere kun primære follikler i kulturperler P4 æggestokke (fig. 4C). Efterfølgende, fangede vi billeder af kulturperler P0 æggestokke for 10 dage i de samme betingelser (figur 4D-G). AcGFP1 kan bruges som et indeks over primære follikler i disse Transgene mus og AcGFP1-positive primære follikler var påvises i kulturperler P0 æggestokkene efter 30-40 h kultur (fig. 4, figur 5A-Fog tillægs Movie 2). Primordial og primære follikler i kulturperler æggestokke var også kendetegnet ved mCherry-positive kerner af granulosa-celler (figur 5B, E). Specifikt, mCherry signaler angive former for follikler og tillade observation af follikel stadier i kulturperler æggestokke (figur 5B, E og H). Derfor, denne kultur system ved hjælp af æggestokkene fra Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry mus viste processen med tidlige follikel udvikling fra primordial sekundære follikel faser. Disse metoder vil fremme undersøgelser af reguleringsmekanismer af gonadotropin-uafhængig follikel udvikling.
Figur 1 : Tidsforløb af medium ændringer. Medium A indeholder 5% FBS, 100-mU FSH, 10-mU LH, 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin i MEM-alpha. Medium B indeholder 5% FBS, 100-mU FSH, 100-mU LH, 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin i MEM-alpha. Medium B blev brugt til at producere LH overspænding hver 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Billeder af kulturperler æggestokkene væv. Billeder blev taget til fange på 24 h intervaller ved hjælp af Konfokal mikroskopi. (A) kultur dag 1; (B) kultur dag 5; (C) kultur dag 10; (D) kultur dag 13; (E) Magnified billede af regionen anført af pladsen i (D); oocytter i D var ægløsning fra folliklerne angivet med pile i B, C og D. (F) oocyt frigive en polar kroppen efter ægløsning; Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Målinger af follikel områder i kulturperler æggestokke. (A) billede af kulturperler æggestok; stiplede linjer repræsenterer området målt ved ImageJ. (B) follikulært områder i kulturperler æggestokkene efter 3 uger; grå linjer repræsenterer perioden kultur fra tilsætning af 100-mM LH (LH surge). Linjer viser udviklingsfaser i hver follikel i kulturperler æggestokken; Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Hæmatoxylin og Eosin (H & E) farvning billeder af P0 og P4 æggestokke og time-lapse imaging. (A) H & E farvning af P0 æggestok; (B) H & E farvning af P4 æggestok; (C) Image af en P4 æggestokken fra en Oog1pro3.6 Transgene mus efter 10 h kultur. Pilen viser en AcGFP1-positive primære follikel. (D-G) Billeder af P0 æggestokke fra Transgene mus udtrykker Oog1pro3.9 og R26-H2B-mCherry; grønne og røde signaler i D og F repræsenterer AcGFP1 og mCherry, henholdsvis. Hvid-signaler i E og G repræsenterer AcGFP1 i D og F, henholdsvis. D og E er billeder af kulturperler æggestokkene efter 0,5 h kultur. F og G Vis æggestokkene efter 180 h kultur; Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: billeder af primordial, primære, og sekundære follikler i kulturperler æggestokke fra oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry mus. (En-C) Billeder af primordial follikler i kulturperler P0 æggestokke; (D-F) Billeder af primære follikler i P0 kulturperler æggestok; (G-H) Billeder af sekundære follikler i kulturperler 4 uger gamle mus æggestokke. A, D og G er flettede billeder af B og C, E og F, og H og I, henholdsvis. Grøn, AcGFP1; rød, mCherry; Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| mikroskop | mål linse | laser | eksponering (ms) | Gevinst | tidsinterval | z-stak | andre | Tal og film |
| CV1000 | X10 | 488 nm: 30, 561 nm: 20 | 488 nm: 700, 561 nm: 600 | 488 nm: 90, 561nm: 20 | 30 min | 5 mm | Figur 4C-G, film 1 og 2 | |
| BZ-X700 | X20 (med samling krave) | 40% | Auto | X4 | 30 min | 10 mm | Binning 3 x 3 | Movie 3 |
| LSM710 | X10 | 488 nm: 6%, 564 nm: 5% | kamera hastighed: 4 | 488 nm: 850, 564 nm: 850 | 24 h | 10 mm | Digital vægtøgning, 488 nm: 2, 564 nm:1 | Figur 2, 3 og 5 |
Tabel 1: Time-lapse imaging betingelser. Time-lapse imaging betingelse for Konfokal og lyse felt mikroskoper.
| Æggestokken ingen. | Antallet af samlede ægløsning oocyter | Antallet af MII oocyter |
| 1 | 7 | 2 |
| 2 | 19 | 9 |
| 3 | 14 | 6 |
| 4 | 7 | 3 |
| 5 | 12 | 4 |
| 6 | 15 | 6 |
| 7 | 25 | 11 |
| 8 | 13 | 3 |
| 9 | 11 | 7 |
| 10 | 19 | 8 |
| 11 | 18 | 4 |
| 12 | 7 | 1 |
Tabel 2: antal af ægløsning oocyter i kulturperler æggestokkene. Antal af ægløsning oocytter fra tolv kulturperler æggestokke; MII angiver antallet af ægløsning oocytter, der blev udgivet første polar organer efter ægløsning.
Supplerende Movie 1: Time-lapse film af en kulturperler æggestokken. Æggestokkene blev blev indsamlet fra 4 - uger gammel mus og skåret og kulturperler i 3 uger. Filmen strækker sig over en kultur periode af 0-200 h på 10 rammer/s. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Supplerende Movie 2: Time-lapse film af en kulturperler P0 æggestokken fra en Transgene mus. Grøn, AcGFP1; røde, mCherry. Filmen strækker sig over en kultur periode af 0-180 h på 10 rammer/s. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Supplerende Movie 3: Time-lapse film af en kulturperler æggestokken fra en 4-uger gammel mus. Grøn, AcGFP1; rød; mCherry; filmen strækker sig over en kultur periode af 9-13 kultur dage på 10 rammer/s. Pile i det første billede viser follikler i hvilke atresi opstod under kultur. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse udviklede vi to nye metoder til at studere follikel udvikling i mus æggestokke. Den første metode indebærer kultur af skiveskåret æggestokkene voksne mus væv efterfulgt af analyser af follikel udvikling, og for det andet indebærer anvendelse af time-lapse imaging for at visualisere tidlige follikel udvikling stadiet gonadotropin-uafhængig. Tidligere vi anvendte den nuværende æggestokken vævskultur metode til at vurdere effekten af leukæmi hæmmende faktor og progesteron på follikel udvikling8,9, og viste, at deres virkninger varierer med koncentrationen og follikel fase. I den foreliggende undersøgelse, skåret æggestokkene væv udstillet follikel dynamics, berettiger yderligere analyser af ovariefollikel udviklingsmekanisme ved hjælp af denne model.
Æggestokkene fra mus af mere end 5 uger gammel indeholder corpus lutea, som hindrer mikroskopiske observationer. Derfor 4 uger gamle mus æggestokkene er at foretrække for observationer af follikel udvikling og ægløsning, og efterfølgende sent primære, sekundære og antral follikler er mere let kendetegnet ved hjælp af lysfelt mikroskopi. Vores metoder giver sammenligninger af virkningerne af vækstfaktorer og narkotika i dyrkningsmedier, med mærkbare ændringer i hårsækken udvikling mellem varierende behandlede æggestokke (figur 3).
Transgene mus udtrykker Cre eller fluorescein proteiner i oocyter har været beskrevet i tidligere undersøgelser18,19,20. Follikulære fase klassificering afhænger imidlertid histologiske karakteristika, herunder granulosa celle figurer, antal granulosa cellelag, og hvorvidt theca celler er dannet. Sondringer mellem primordial og primære follikler kan således begrænset fra observationer af oocytter alene. Heri, vi bruges Transgene mus indeholdende Oog1pro3.9 og R26-H2B-mCherry transgener11,17 og visualisere tidlige follikel udvikling fra primordiale sekundære follikel faser i kulturperler æggestokke. Oog1 udtryk bliver påvises i oocyter stadiet primordiale hårsækken, og øges markant i primære follikler. Derfor AcGFP1 signal støtteintensiteter i oocyter er forbundet med follikel fase (figur 5) og blev brugt til at observere primordial-primær follikel overgange (figur 4, supplerende Movie 2). Cellekerner farves rødt i R26-H2B-mCherry Transgene mus (figur 4, supplerende film 2, og supplerende Movie 3), gør det muligt observationer af follikel faser efter antal granulosa celler ( Figur 5). Således tilsammen de nuværende metoder tillade analyser af follikel udvikling fra primordiale gennem til ægløsning ved hjælp af Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry Transgene mus. Desuden, fordi apoptotiske celle kromatin er kondenseret, mCherry signaler Atretiske follikler er stærkere end normale follikler (supplerende film 3).
Blandt metodologiske finesser er korrekte tykkelser af skiveskåret væv nødvendige for vellykket dyrkning, med øget celledød i æggestokken udsnit, der er for tykke, og tab af store antral follikler i æggestokkene udsnit, der er for tynd. Follikel vækst hastighed er langsom; Derfor er det let at spore og analysere processen for hver follikel via 24-h interval observation. Den nuværende Konfokal mikroskop indstilling, herunder laser intensitet, tidsinterval og digital gevinst, er afhængige af mikroskop-tilstand, men er kritisk at overveje når opnåelse af time-lapse billeder. Især stærk laser Støtteintensiteter og lange eksponeringstider er forpligtet til at fange klare billeder, men kan påvirke kulturperler celler. Derfor er moderation af disse indstillinger til at undgå fototoksicitet kritisk. Skiveskåret æggestokkene væv af 4 uger gamle mus kan være kulturperler for ca. 4 uger, ur og primære follikler fortsat nuværende efterfølgende, de ikke længere vokser. Derimod kan P0 og P4 æggestokkene være kulturperler i ca 10 dage, hvor primordial og primære follikler udvikle sig til primære eller sekundære follikler, henholdsvis. Dog udvikler follikler i kulturperler P0 og P4 æggestokkene ikke i antral follikler. Excision af æggestokkene er derfor påkrævet på forskellige stadier for studier af de reguleringsmekanismer, der er forbundet med hele ovarie follicle udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Naojiro Minami (Kyoto University) for at give Oog1pro3.9 mus. Denne forskning blev støttet af JSP'ER (KAKENHI # JP15H06275) og Nitto Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
- Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
- Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
- Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
- Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
- Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
- Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
- Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
- Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
- Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
- Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
- Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
- Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).
