Summary
Colture del tessuto ovarici possono essere utilizzati come modelli di atresia di sviluppo, l'ovulazione e follicolo pilifero e indicare i meccanismi regolatori dei processi dinamici ovarici.
Abstract
Le femmine dei mammiferi ovulano periodicamente un numero quasi costante degli ovociti durante ogni ciclo di estro. Per sostenere tale regolarità e periodicità, la regolazione avviene a livello ipotalamico-pituitario-gonadico e sullo sviluppo di follicoli nell'ovaio. Nonostante studi attiva, meccanismi per lo sviluppo del follicolo non sono chiari a causa dei diversi passaggi coinvolti dall'attivazione dormienti follicolo primordiale all'ovulazione e a causa della complessità del regolamento che è diverso in ogni fase follicolare. Per studiare i meccanismi di sviluppo del follicolo e le dinamiche dei follicoli durante tutto il ciclo di estro, abbiamo sviluppato un modello di coltura del tessuto ovarico del mouse che può essere usato per osservare lo sviluppo del follicolo tramite un microscopio. Sviluppo sistematico del follicolo, l'ovulazione periodica ed atresia del follicolo può essere riprodotto nel modello dell'ovaia coltivate, e le condizioni della coltura possono essere modulate sperimentalmente. Qui, noi dimostrare l'utilità di questo metodo nello studio dei meccanismi di regolazione dello sviluppo del follicolo e altri fenomeni ovarici.
Introduction
Mouse femminile ovaie contengono parecchie migliaia di follicoli1, e l'ovulazione periodica matura circa dieci ovociti ad ogni ciclo di estro. Follicoli sono classificati in diversi stadi di sviluppo: primordial, primaria, secondaria, antral e follicoli di Graaf, a seconda della forma dello strato cellulare granulosa che circondano ogni ovocita. Maggior parte dei follicoli primordiali sono dormienti, e alcuni di essi sono attivati e crescere in follicoli primari a ogni ciclo di estro2. Dopo la fase follicolare secondaria, sviluppo del follicolo è regolato principalmente da gonadotropine, follicolare di stimolazione dell'ormone (FSH) e luteinizzante (LH). Tuttavia, lo sviluppo del follicolo primordiale e primario è indipendente della gonadotropina e i meccanismi regolatori che governano queste fasi rimangono scarsamente inderstood3,4,5. Oltre ai fattori di crescita e ormoni, il follicolo primordiale e primario è regolato dalle interazioni tra follicoli6,7. Pertanto, abbiamo eseguito le analisi delle dinamiche del follicolo in tessuti di topo dell'ovaia e studiato i meccanismi normativi associati utilizzando colture del tessuto ovarico8,9,10.
Qui, presentiamo due metodi di modello di coltura del tessuto ovarico. Il primo viene utilizzato per analizzare lo sviluppo del follicolo tramite la misura delle aree follicolare, e il secondo è usato per studiare il meccanismo regolatore durante lo sviluppo iniziale di follicolo da primordiale alla fase del follicolo secondario con topi transgenici. Per l'analisi di sviluppo del follicolo, abbiamo usato soprattutto le ovaie di topi femminili 4 - settimana-vecchi perché consentono per una visualizzazione semplice dei follicoli. Per indurre l'ovulazione periodica e modello in vivo lo sviluppo del follicolo, abbiamo riprodotto il picco di LH e osservato l'ovulazione, l'atresia del follicolo e secrezione dell'estradiolo in condizioni di coltura del tessuto. Immagini delle ovaie coltivate furono catturati, e i processi di sviluppo del follicolo sono stati analizzati dai cambiamenti di tracciatura in zona follicolare. Tuttavia, nelle analisi di microscopia del campo luminoso, la distinzione tra follicoli primari primordiale e all'inizio era poco chiara. Così, abbiamo sviluppato un metodo per rilevare piccoli follicoli e distinguere tra la primordiale, primaria, e follicolo secondario in coltivate ovarici tessuti utilizzando Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 e ovaie di topi transgenici R26-H2B-mCherry ai giorni 0 e 4 dopo nascita11. Oog1 espressione è rilevabile negli ovociti dopo l'entrata in meiosi e aumenta gradualmente con lo sviluppo del follicolo, permettendo l'osservazione della transizione da primordial follicoli primari utilizzando immagini time-lapse del tessuto ovario coltivate11 ,12. Anche se i metodi morfologici sono stati utilizzati per studiare i fattori che attivano i follicoli primordiali dormente13,14,15,16, lo sviluppo fisiologico del follicolo nelle ovaie è difficile da osservare, e gli effetti di vari fattori rimangono atipici. Gli attuali metodi di coltura sono stati progettati per affrontare questa scarsità in tempo reale analisi dei fattori di destinazione.
Nello studio presente, abbiamo rintracciato lo sviluppo follicolare, utilizzando un metodo di imaging time-lapse e caratterizzato il processo di sviluppo del follicolo. I nostri metodi innovativi offrono uno strumento senza precedenti per studiare la fisiologia delle ovaie.
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Protocol
Topi sono stati alloggiati in una stanza in ambiente controllata a 23 ± 1 ° C con un ciclo di 12 h luce/12 h scuro. Protocolli di cura degli animali e gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida per la sperimentazione animale all'Università di Aichi Medical e sono stati approvati dal comitato di uso e Animal Care incombente.
1. preparazione del terreno di coltura e piatti
- Per preparare il terreno di coltura di base, aggiungere siero bovino fetale (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL) e la penicillina-streptomicina (penicillina, 100 U/mL; streptomicina, 100 mg/mL) al minimo essenziale medio (MEM-alfa) e mix in provette da 50 mL.
Nota: Volumi totali di terreni di coltura richiesto variano fra gli esperimenti, ma 1 mL di terreno di coltura è generalmente sufficiente per piastre di coltura di 3,5 cm con fondo di vetro. - Versare le aliquote di 1 mL di terreno di coltura mista in piastre di coltura di 3,5 cm con fondo di vetro e set posto 30 mm cella cultura inserti in piatti. Preriscaldare la media e piatti in un'incubatrice (5% CO2 e 37 ° C).
2. preparazione del tessuto ovarico
- Pre-riscaldare tampone salino (PBS) (−) e MEM-alfa contenente 5% FBS, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 100 mg/mL in un incubatore (5% CO2 e 37 ° C).
Nota: 3 mL circa aliquote di PBS (−) per ovaia sono sufficienti per l'utilizzo durante le dissezioni dell'ovaia, e le aliquote di 1ml di MEM-alfa sono sufficienti per l'archiviazione temporanea delle ovaie singole in piatti di 3,5 cm. -
Asportare le ovaie da topi ICR (denominata dopo l'Istituto di ricerca sul cancro) femmina 4 - settimana-vecchi e per tagliare i tessuti che circondano l'ovario con delle forbici, pinzette sotto un microscopio stereoscopico. Riserviamo le ovaie rimosse nel terreno di coltura (Vedi punto 2.1) fino all'utilizzo.
- Posto singole ovaie su carta da filtro inumidite con pre-riscaldati PBS (−) (Vedi punto 2.1) e tagliare in 4 pezzi usando una lama del microtomo sotto un microscopio stereoscopico.
Nota: Ovaie di topi ICR 4 - settimana-vecchi sono circa 2 mm di diametro. Il numero di pezzi dipende dalle dimensioni dell'ovaio; Tuttavia, circa 500 µm spessore pezzi consentono per le osservazioni del follicolo corretta (in pezzi di spessore superiore a 500 mm, trasparenza del tessuto è diminuito; in pezzi più sottile di 500mm, molti follicoli antrali sono rotti e caduti). - Dopo la dissezione, collocare gli esemplari di affettato ovaio in terreno di coltura pre-riscaldato a piatti di 3,5 cm (Vedi punto 2.1).
- Posto singole ovaie su carta da filtro inumidite con pre-riscaldati PBS (−) (Vedi punto 2.1) e tagliare in 4 pezzi usando una lama del microtomo sotto un microscopio stereoscopico.
3. ovarico coltura tissutale
- Goccia circa 0,5 µ l di terreno di coltura per affettato tessuto ovarico sull'inserto di cultura cellulare dove il tessuto ovarico sarà impostato utilizzando una micropipetta.
- Posizionare ogni provino a fette in una goccia di terreno di coltura sugli inserti di cultura cellulare usando la pinzetta.
- Cultura dei tessuti dell'ovaia in 5% CO2 a 37 ° C.
- Sostituire il terreno di coltura con medium fresco pre-riscaldato ogni 2 giorni.
Nota: La pianificazione per i cambiamenti medi per la cultura delle sezioni dell'ovaia da 4 - settimana-vecchi topi ICR è presentata nella Figura 1.- Per riprodurre l'impulso del LH, trattare coltivate le ovaie di topi ICR 4 - settimana-vecchie con il mezzo contenente 100 mU/mL FSH e LH per 12 h ogni 4 giorni (Figura 1).
4. microscopio immagini delle ovaie coltivate
- Avviare le ovaie colte di imaging dopo 1 giorni quando i tessuti hanno aderito sugli inserti di cultura cellulare ed eseguire analisi microscopio confocale o invertito a intervalli di 24 ore per consentire la crescita del follicolo sufficiente tra i punti di tempo.
Nota: La microscopia confocale è superiore alla microscopia invertita per osservare follicoli nelle ovaie tutto coltivate.
5. Time-lapse Imaging delle ovaie coltivate
-
Ottimizzare le condizioni di imaging time-lapse, tra cui laser intensità e tempi di esposizione, per il sistema di imaging (tabella 1).
- Selezionare gli esemplari accoppiati ovaia da topi singolo per uso come gruppi di controllo e di trattamento. Variare l'intensità del laser e tempo di esposizione per ottenere le migliori immagini (tabella 1).
- Confrontare la crescita del follicolo in ciascuna condizione di cultura misurando aree follicolo in immagini di campioni di controllo a intervalli di 24 h e in time-lapse campioni imaging (Vedi punto 6). Contemporaneamente, contare il numero di ovociti ovulati in ogni set di ovaio e scegliere le condizioni ottimali di imaging time-lapse.
- Acquisizione di immagini ad intervalli di 30 min con il sistema di imaging time-lapse sotto determinate condizioni (tabella 1).
6. analisi di crescita del follicolo
-
Per analizzare lo sviluppo del follicolo, misurare le aree di follicolo in immagini catturate utilizzando software ImageJ (http://resbweb.nih.gov/ij/).
- Inizialmente, è possibile impostare la scala dell'immagine facendo clic su "Imposta scala" sotto "Analizza" nella barra degli strumenti. Immettere le lunghezze laterali dell'immagine catturata e i corrispondenti numeri di pixel nei campi vuoti di "Distanza di noto" e "Distanza in pixel", rispettivamente.
- Fare clic su "Mano libera" nella barra degli strumenti e delineare i follicoli nelle immagini catturate campo luminoso.
- Nella barra degli strumenti, fare clic su "Misura" sotto "Analizza".
Nota: Se altri dati di misura sono desiderati, fare clic su "Set misura" sotto "Analizza" nella barra degli strumenti e seleziona le caselle appropriate nell'elenco.
7. analisi dello sviluppo del follicolo utilizzando topi transgenici
- Raccogliere le ovaie da giorni postnatali 0 e 4 (P0 e P4) femmina topi transgenici contenenti i transgeni Oog1pro3.9 e R26-H2B-mCherre cultura su inserti come descritto passaggi 1.1 – 3.2, tranne non fetta P0 e ovaie P4.
- Sostituire il terreno di coltura con medium fresco, pre-riscaldato in piatti di 3,5 cm in un'incubatrice che contiene 5% CO2 a 37 ° C ogni 2 giorni.
Nota: La concentrazione di LH nel terreno di coltura delle ovaie P0 e P4 può rimanere costante perché picchi di LH non si verificano nei topi P0 e P4. - Impostare il microscopio per visualizzare solo follicoli primari di AcGFP1-positivi in coltura P4 ovaie (tabella 1).
Nota: Solo primordiale e primari follicoli sono presenti nelle ovaie femminili del mouse P4. - Catturare immagini di colta P0 Oog1pro3.9/ ovaie di topi transgeniciR26-H2B-mCherry ad intervalli di 30 min utilizzando le impostazioni utilizzate per P4 ovaie (Vedi punto 5.2).
- Tracciare e analizzare lo sviluppo del follicolo utilizzando segnali AcGFP1 e H2B-mCHerry.
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Representative Results
La figura 1 Mostra il protocollo per i cambiamenti nei mezzi di comunicazione durante la coltura del tessuto ovarico. Seguendo questo programma, le ovaie di topi ICR 4-settimana-vecchio erano coltivate e ripreso a intervalli di 24-h usando la microscopia confocale (Figura 2). Durante la coltura dei tessuti dell'ovaia per 3 settimane, più follicoli antrali e secondari sono stati degenerati da atresia del follicolo e alcuni erano ovulato (Figura 2D e tabella 2). Nell'analisi delle aree di follicolo usando ImageJ (Figura 3), alcuni follicoli sviluppati nei gruppi durante ogni ciclo di aumento di LH (Figura 3B e complementare Movie 1). Inoltre, l'ovulazione avvenuta quasi contemporaneamente nelle ovaie colte separate dalle ovaie destra e sinistra di topi singolo. Considerando che i tempi di ovulazione e numeri di ovociti ovulati (tabella 2) differivano tra ovaie del mouse (dati non mostrati), prevalentemente avvenuta l'ovulazione dalle ovaie coltivate all'interno di 48 h di picchi di LH (Figura 3e integrativa Film 1). Tuttavia, non tutti gli ovociti ovulated rilasciato primi corpi polari dopo l'ovulazione (Figura 2E e tabella 2), e anche se potrebbero essere fecondati ovulati ovociti, sviluppo cessò presso la stadio di 4 cellule (dati non mostrati). Per delucidare i meccanismi da cui i follicoli primordiali dormienti sono attivati nelle ovaie del mouse, abbiamo rilevato l'attivazione follicolo primordiale in tessuti coltivati da topi transgenici Oog1pro3.9 e R26-H2B-mCherry (transgeni Figura 4, Figura 5e film supplementare 2). Ovociti esprimono livelli molto bassi del gene di Oog1 dalla fase del follicolo primordiale, e time-lapse imaging distingue i follicoli primordiali che esprimono AcGFP1 bassi dai follicoli primari che esprimono AcGFP1 alti. Follicoli primordiali e primari sono presenti contemporaneamente in P4 ovaie del mouse, mentre solo i follicoli primordiali sono presenti nelle ovaie P0 (Figura 4A, B). Così, abbiamo ottimizzato il time-lapse condizioni di formazione immagine per rilevare solo i follicoli primari in coltivate P4 ovaie (Figura 4C). Successivamente, abbiamo catturato immagini di colta P0 ovaie per 10 giorni nelle stesse condizioni (Figura 4D-G). AcGFP1 può essere utilizzato come indice di follicoli primari in questi topi transgenici e follicoli primari AcGFP1-positivi erano rilevabili in coltivate P0 ovaie dopo coltura di 30 – 40 h (Figura 4, Figura 5A-Fe integrativa Film 2). Primordiale e primari follicoli nelle ovaie coltivate si distinguevano anche per mCherry-positivi i nuclei delle cellule della granulosa (Figura 5B, E). In particolare, mCherry segnali indicano forme di follicoli e permettono l'osservazione delle fasi del follicolo nelle ovaie coltivate (Figura 5B, E e H). Di conseguenza, questo sistema di coltura utilizzando ovaie da Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry topi hanno rivelato il processo di sviluppo precoce del follicolo da primordiale alle fasi del follicolo secondario. Questi metodi faciliterà gli studi dei meccanismi di regolazione dello sviluppo del follicolo gonadotropina-indipendente.
Figura 1 : Corso di tempo dei cambiamenti medi. A medio contiene 5% FBS, 100-mU FSH, LH di 10-mU, penicillina 100 U/mL e 100 mg/mL di streptomicina in MEM-alfa. Medium B contiene 5% FBS, 100-mU FSH, LH di 100-mU, penicillina 100 U/mL e 100 mg/mL di streptomicina in MEM-alfa. Mezzo B è stato usato per produrre picchi di LH ogni 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Immagini dei tessuti ovarici colte. Immagini sono state catturate a intervalli di 24 h usando la microscopia confocal. (A) giornata della cultura 1; (B) giornata della cultura 5; (C) giornata della cultura 10; (D) giornata della cultura 13; (E) Magnified immagine della regione indicata dal quadrato in (D); ovociti in D erano ovulati dai follicoli indicati dalle frecce in B, C e d. (F) ovocita, rilasciando un corpo polare dopo l'ovulazione; Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Misurazioni di aree del follicolo nelle ovaie colte. (A) immagine dell'ovaia coltivata; linee tratteggiate rappresentano l'area misurata di ImageJ. (B) zone follicolare nell'ovaia coltivata dopo 3 settimane; linee grigie rappresentano il periodo di coltura dall'aggiunta di 100 mM LH (picco di LH). Linee mostrano le fasi di sviluppo in ogni follicolo nell'ovaia coltivata; Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Ematossilina ed eosina (H & E) colorazione immagini di ovaie P0 e P4 e time-lapse imaging. (A) H & E macchiatura dell'ovaia P0; (B) H & E macchiatura dell'ovaia P4; (C) immagine di ovaio P4 da un topo transgenico Oog1pro3.6 dopo coltura 10 h. La freccia indica un follicolo primario AcGFP1-positivi. (D-G) Immagini di P0 ovaie da topi transgenici esprimenti Oog1pro3.9 e R26-H2B-mCherry; segnali verdi e rossi in D, F rappresentano AcGFP1 e mCherry, rispettivamente. Bianco segnali in E e G rappresentano AcGFP1 in D, F, rispettivamente. D ed E sono immagini delle ovaie coltivate dopo coltura 0,5 h. F e G Visualizza ovaie dopo coltura h 180; Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immagini dei follicoli primordiali, primarie e secondarie nelle ovaie colte da oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry topi. (A–C) Immagini di follicoli primordiali in coltivate P0 ovaie; (D–F) Immagini di follicoli primari nell'ovaia colta di P0; (G–H) Immagini di follicoli secondari nelle ovaie coltivati del topo 4-settimana-vecchio. A, D e G sono immagini unite di B e C, E e F e H e I, rispettivamente. Verde, AcGFP1; rosso, mCherry; Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| microscopio | lente obiettiva | laser | esposizione (ms) | Guadagno | intervallo di tempo | z-stack | gli altri | Figure e film |
| CV1000 | X10 | 488 nm: 30, 561 nm: 20 | 488 nm: 700, 561 nm: 600 | 488 nm: 90, 561nm: 20 | 30 min | 5 mm | Figura 4C-G, film 1 e 2 | |
| BZ-X700 | X20 (con collare di raccolta) | 40% | Automatico | X4 | 30 min | 10 mm | Binning 3x3 | Film 3 |
| LSM710 | X10 | 488 nm: 6%, 564 nm: 5% | velocità della macchina fotografica: 4 | 488 nm: 850, 564 nm: 850 | 24 h | 10 mm | guadagno di Digital, 488 nm: 2, nm:1 564 | Figura 2, 3 e 5 |
Tabella 1: Time-lapse imaging condizioni. Time-lapse condizione imaging per microscopio confocale e luminose del campo.
| Ovaia non. | Numero di ovociti ovulati totali | Numero di ovociti MII |
| 1 | 7 | 2 |
| 2 | 19 | 9 |
| 3 | 14 | 6 |
| 4 | 7 | 3 |
| 5 | 12 | 4 |
| 6 | 15 | 6 |
| 7 | 25 | 11 |
| 8 | 13 | 3 |
| 9 | 11 | 7 |
| 10 | 19 | 8 |
| 11 | 18 | 4 |
| 12 | 7 | 1 |
Tabella 2: numeri di ovulato ovociti nelle ovaie colte. Numeri di ovulato ovociti dalle ovaie coltivate dodici; MII indica il numero di ovociti ovulati rilasciati primi corpi polari dopo l'ovulazione.
Complementare Movie 1: filmato time-lapse di un'ovaia colta. Le ovaie sono stati raccolte da 4 - settimana-vecchi topi affettate e coltivate per 3 settimane. Il film si estende su un periodo di cultura di 0 – 200 h a 10 fotogrammi/s. per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Complementare Movie 2: filmato time-lapse di ovaio P0 colto da un topo transgenico. Verde, AcGFP1; rosso, mCherry. Il film si estende su un periodo di cultura di 0 – 180 h a 10 fotogrammi/s. per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Complementare Movie 3: Time-lapse movie di un'ovaia colta da un mouse 4 settimane di età. Verde, AcGFP1; rosso; mCherry; il film si estende su un periodo di cultura di 9 – 13 giorni di cultura a 10 fotogrammi/s. Le frecce nella prima immagine indicano follicoli in cui l'atresia si è verificato durante la coltura. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
In questo studio, abbiamo sviluppato due nuovi metodi per studiare lo sviluppo del follicolo nelle ovaie del mouse. Il primo metodo comporta la cultura dei tessuti di topi adulti ovarico affettato seguita da analisi dello sviluppo del follicolo, e il secondo prevede l'utilizzo di time-lapse imaging per visualizzare lo sviluppo iniziale del follicolo durante la fase di gonadotropina-indipendente. In precedenza, abbiamo usato il presente metodo di coltura del tessuto ovario per valutare l'effetto di fattore inibitorio di leucemia e di progesterone follicolo sviluppo8,9e ha mostrato che i loro effetti variano con la fase del follicolo e di concentrazione. Nello studio presente, affettato dinamiche di follicolo ovarico tessuti esposti, che giustificano ulteriori analisi del meccanismo di sviluppo del follicolo ovarico utilizzando questo modello.
Ovaie di topi di più di 5 settimane di età contengono lutea del corpus che ostacola le osservazioni al microscopio. Quindi, 4-settimana-vecchio mouse ovaie sono comodo per le osservazioni di sviluppo follicolare e dell'ovulazione e successive fine primari, secondari e antral follicoli si distinguono più facilmente utilizzando la microscopia a campo chiaro. I nostri metodi di offrire sempre confronti degli effetti dei fattori di crescita e droghe in terreni di coltura, con discernable cambiamenti nello sviluppo del follicolo tra ovaie differenzialmente trattate (Figura 3).
Topi transgenici che esprimono le proteine Cre o della fluorescina in ovociti sono stati descritti in precedenti studi18,19,20. Tuttavia, classificazione di fase follicolare dipende dalle caratteristiche istologiche incluse le forme delle cellule di granulosa, numeri di strati di cellule della granulosa, e se si formano le cellule della teca. Quindi, distinzioni tra follicoli primordiali e primari possono essere limitati dalle osservazioni degli ovociti da solo. Qui, abbiamo usato i topi transgenici contenenti la Oog1pro3.9 e la R26-H2B-mCherry transgeni11,17 e visualizzare precoce sviluppo del follicolo da primordiale alle fasi di follicolo secondario nelle ovaie coltivate. Oog1 espressione diventa rilevabile negli ovociti durante la fase del follicolo primordiale e contrassegnato è aumentato in follicoli primari. Quindi, l'intensità del segnale di AcGFP1 negli ovociti sono associati con la fase del follicolo (Figura 5) e venivano utilizzati per osservare le transizioni di follicolo primordiale-primaria (Figura 4, complementare Movie 2). Nuclei delle cellule sono macchiati di rosso in R26-H2B-mCherry topi transgenici (Figura 4 supplementari Movie 2osservazioni e complementare Movie 3), permette di fasi del follicolo in base ai numeri di (cellule della granulosa Figura 5). Così, collettivamente i metodi presenti consentono analisi dello sviluppo del follicolo da primordiale attraverso all'ovulazione utilizzando Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry topi transgenici. Inoltre, perché la cromatina delle cellule apoptotiche è condensata, mCherry segnali di atretic follicoli sono più forti di quelli dei normali follicoli (complementare Movie 3).
Tra metodologici sottigliezze, corrette spessori dei tessuti affettati sono necessari per la coltura di successo, con la morte aumentata delle cellule in fette di ovaia che sono troppo spessi e le perdite di grandi follicoli antrali a fette dell'ovaia che sono troppo sottili. La velocità di crescita del follicolo è lenta; quindi, è facile da tracciare e analizzare il processo di ogni follicolo tramite osservazione intervallo 24-h. Il microscopio confocale presente impostazione, tra cui l'intensità del laser, intervallo di tempo e guadagno digitale, dipende la modalità di microscopio, ma sono fondamentale da considerare quando si ottengono immagini time-lapse. In particolare, laser forte intensità e tempi di esposizione lunghi necessari per catturare immagini nitide, ma possono influenzare le cellule coltivate. Quindi, moderazione di queste impostazioni per evitare fototossicità è critico. Tessuti affettati ovariche di 4-settimana-vecchi topi possono essere coltivate per circa 4 settimane, considerando che i follicoli primordiali e primarie rimangono presenti successivamente, non crescono. Al contrario, ovaie P0 e P4 possono essere coltivate per circa 10 giorni, durante i quali follicoli primordiali e primari sviluppano nei follicoli primari o secondari, rispettivamente. Tuttavia, i follicoli nelle ovaie colte di P0 e P4 non sviluppano in follicoli antrali. Pertanto, l'asportazione delle ovaie è necessaria nelle varie fasi per gli studi dei meccanismi normativi connessi con lo sviluppo del follicolo ovario intero.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Naojiro Minami (Kyoto University) per fornire i topi Oog1pro3.9 . Questa ricerca è stata sostenuta da JSP (KAKENHI # JP15H06275) e la Fondazione di Nitto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
- Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
- Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
- Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
- Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
- Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
- Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
- Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
- Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
- Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
- Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
- Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
- Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).
