Summary
Ovarian vev kulturer kan brukes som modeller av hårsekken utvikling, eggløsning og hårsekken atresia og angi regulatoriske mekanismer for dynamisk ovarian prosesser.
Abstract
Pattedyr kvinner ovulate regelmessig en nesten konstant antall oocytes under hver estrus syklus. For å opprettholde slike regularitet og periodisitet, oppstår regulering på hypothalamus-hypofyse-gonadal akse nivå og utvikle follikler i eggstokken. Til tross for aktiv studier er hårsekken utvikling mekanismer ikke klart på grunn av flere trinnene involvert av sovende primordial hårsekken aktivering til ovulation, og fordi regulering som er forskjellig for hver follikulær scene. Undersøke mekanismer av hårsekken utvikling og dynamikken i hårsekkene gjennom estrus syklusen, utviklet vi en mus ovarian vev kultur modell som kan brukes til å observere hårsekken utvikling ved hjelp av et mikroskop. Systematisk hårsekken utvikling, periodisk eggløsning og hårsekken atresia kan alle gjengis i kulturperler eggstokk modellen og kultur betingelsene kan omformes eksperimentelt. Her viser vi nytten av denne metoden i studiet av regulatoriske mekanismer av hårsekken utvikling og andre ovarian fenomener.
Introduction
Kvinnelige musen eggstokkene inneholder flere tusen follikler1og periodiske eggløsning modnes ca ti oocytes på hver estrus syklus. Hårsekker er klassifisert i flere utviklingsstadier: primordial, primær, sekundær, Boas, og Graafian follicles, avhengig av form av granulosa mobilnettet laget rundt hver oocyte. De fleste primordial hårsekker er sovende, og noen av dem er aktivert og vokse til primære follikler på hver estrus syklus2. Etter videregående follikulær scenen, er hårsekken utvikling hovedsakelig regulert av gonadotropiner, follikulær stimulerende hormone (FSH) og luteiniserende hormon (LH). Imidlertid primordial og primære hårsekken utvikling er uavhengig av gonadotropin og regulatoriske mekanismer som styrer disse stadiene være dårlig inderstood3,4,5. Vekstfaktorer og hormoner, er primordial og primære hårsekken regulert av interaksjon mellom follikler6,7. Derfor vi utført analyser av hårsekken dynamikken i musen eggstokk vev og undersøkt tilknyttede regulatoriske mekanismer bruker ovarian vev kulturer8,9,10.
Her, introdusere vi to ovarian vev kultur modell metoder. Først brukes til å analysere hårsekken utvikling ved måling av follikulær områder, og andre brukes til å studere den regulatoriske mekanismen i løpet av tidlig hårsekken utvikling fra primordial sekundære hårsekken scenen med transgene mus. For hårsekken utvikling analyse brukes vi hovedsakelig eggstokkene 4 - uke gamle kvinnelige mus fordi de tillater enkel visualisering av hårsekkene. For å indusere periodisk eggløsning og modell i vivo hårsekken utvikling, reproduseres vi LH bølge og observerte eggløsning, hårsekken atresia og sekresjon av estradiol under vev kultur forhold. Bilder av kultivert eggstokkene ble fanget og utviklingsprosesser hårsekken ble analysert av sporing endringer i follikulær området. Men i lys feltet mikroskopi analyser var forskjellen mellom opprinnelige og tidlig primære follikler uklart. Derfor utviklet vi en metode for å oppdage små follikler, og skille mellom opprinnelige, primær, og sekundære hårsekken i kulturperler ovarian vev med Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 og R26-H2B-mCherry transgene mus eggstokkene dager 0 og 4 etter fødselen11. Oog1 uttrykk er i oocytes etter inn i meiose, og øker gradvis med hårsekken utvikling, slik at observasjon av overgangen fra primordial til primære follikler time-lapse bilder av kultivert eggstokk vev11 ,12. Selv om morfologiske metoder brukes til å studere faktorer som aktiverer sovende primordial follicles13,14,15,16, er fysiologisk follicle utvikling i eggstokkene vanskelig å observere, og effekten av ulike faktorer er fortsatt uncharacterized. De nåværende kultur metodene ble utviklet for å håndtere denne mangelen i sanntid analyser mål faktorer.
Studien, vi sporet follikulær utvikling med en time-lapse bildebehandling metode og preget prosessen med hårsekken utvikling. Vår nye metoder tilbyr et enestående verktøy for å undersøke fysiologi av eggstokkene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus ble plassert i et miljømessig kontrollerte rom på 23 ±1 ° C med en 12 h lys/12 h mørke syklus. Dyr omsorg protokoller og eksperimenter ble utført i samsvar med retningslinjene for dyr eksperimentering på Aichi medisinske universitet og ble godkjent av den sittende dyr omsorg og bruk komiteen.
1. forberedelse av kultur Medium og retter
- For å forberede grunnleggende kultur medium, legge fosterets bovin serum (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL), og penicillin-streptomycin (penicillin, 100 U/mL, streptomycin, 100 mg/mL) minimum viktig middels alpha (MEM-alfa) og bland i 50 mL rør.
Merk: Total mengder nødvendige kultur medier varierer mellom eksperimenter, men 1 mL av kultur medium er vanligvis nok for 3,5 cm glass bunn kultur retter. - Hell 1 mL dele blandet kultur medium i 3,5 cm glass bunn kultur retter og sette sted 30 mm celle kultur setter retter. Forvarm media og retter i en inkubator (5% CO2 og 37 ° C).
2. forberedelse av eggstokkene vev
- Pre varme fosfat bufret saltvann (PBS) (−) og MEM-alpha inneholder 5% FBS, 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin i en inkubator (5% CO2 og 37 ° C).
Merk: Ca 3 mL dele av PBS (−) per eggstokken er tilstrekkelig for bruk under eggstokk disseksjoner 1 mL dele MEM-alfa er tilstrekkelig for midlertidig lagring av enkelt eggstokkene 3,5 cm retter. -
Avgiftsdirektoratet eggstokkene fra 4 - uke gamle kvinnelige ICR (oppkalt etter Institute for Cancer Research) mus og trim vev rundt eggstokken saks og pinsett under stereoskopisk mikroskop. Reservere fjernet eggstokkene kultur medium (se trinn 2.1) før bruk.
- Sted enkelt eggstokkene på filter papir fuktet pre varmet PBS (−) (se trinn 2.1) og skjær i 4 stykker med et mikrotomen blad under stereoskopisk mikroskop.
Merk: Eggstokkene 4 - uke gamle ICR mus er ca 2 mm i diameter. Antall stykker avhenger av eggstokk størrelsen; men om lag 500 µm tykke metallstykker tillater for riktig hårsekken observasjoner (i stykker tykkere enn 500 mm, vev åpenhet er redusert, i stykker tynnere enn 500 mm, mange Boas follikler brytes og mistet). - Etter disseksjon, plassere skiver eggstokk eksemplarer i forvarmes kultur medium i 3,5 cm retter (se trinn 2.1).
- Sted enkelt eggstokkene på filter papir fuktet pre varmet PBS (−) (se trinn 2.1) og skjær i 4 stykker med et mikrotomen blad under stereoskopisk mikroskop.
3. ovarian vev kultur
- Slipp ca 0,5 µL av kultur medium per skiver ovarian vev på celle kultur setter hvor ovarian vev blir angitt ved hjelp av brønnene.
- Plass hver skiver prøven i en dråpe kultur medium på celle kultur skivene ved hjelp av pinsett.
- Kultur eggstokk vev i 5% CO2 på 37 ° C.
- Erstatte kultur medium med fersk forvarmes medium hver 2 dager.
Merk: Tidsplanen for middels endringer for kulturen i eggstokken inndelinger fra 4 - uke gamle ICR mus vises i figur 1.- For å gjengi LH bølge, behandle kulturperler 4 - uke gamle ICR mus eggstokkene med mediet som inneholder 100 mU/mL FSH og LH 12 h hver 4 dager (figur 1).
4. mikroskop bilder av kultivert eggstokkene
- Start imaging kulturperler eggstokkene etter dag 1 når vev har overholdt på celle kultur skivene, og utføre AC confocal eller invertert mikroskop analyser på 24-timers intervaller tillate tilstrekkelig hårsekken vekst mellom tidspunkt.
Merk: AC Confocal mikroskopi er overordnet invertert mikroskopi for å observere follikler i hele kulturperler eggstokkene.
5. tidsinnstilt bildebehandling av kultivert eggstokkene
-
Optimalisere time-lapse tenkelig betingelsene, inkludert laser intensitet og eksponeringstider, for imaging system (tabell 1).
- Velg sammenkoblede eggstokk prøver fra én mus for bruk som behandling og kontroll grupper. Variere laser intensitet og eksponeringstid å oppnå de beste bildene (tabell 1).
- Sammenligne hårsekken vekst under hver kultur tilstand ved å måle hårsekken områder i bilder av kontroll prøver med 24-timers intervaller og time-lapse tenkelig prøver (se trinn 6). Samtidig, antall ovulated oocytes i hvert eggstokk og velge de optimale time-lapse imaging forholdene.
- Ta bilder med 30 min mellomrom bruker time-lapse tenkelig system under bestemt forhold (tabell 1).
6. hårsekken vekst analyse
-
Analysere hårsekken utviklingen, måle hårsekken områdene i fanget bilder bruker ImageJ programvare (http://resbweb.nih.gov/ij/).
- Først definere omfanget av bildet ved å klikke "Angi skala" under "Analysere" på verktøylinjen. Angi siden lengdene av bildet og tilsvarende antall piksler i de blanke feltene "Kjent avstand" og "Avstanden i piksler", henholdsvis.
- Klikk "Frihånd" på verktøylinjen og skissere hårsekkene i fanget lys feltet bilder.
- Klikk "Tiltak" under "Analysere" på verktøylinjen.
Merk: Hvis andre måledata er ønskelig, klikk "Sette mål" under "Analysere" på verktøylinjen, og Merk aktuelle i listen.
7. analyse av hårsekken utvikling ved hjelp av transgene mus
- Samle eggstokkene fra postnatal dager 0 og 4 (P0 og P4) kvinnelige transgene mus som inneholder effekter av transgener Oog1pro3.9 og R26-H2B-mCherr, og kultur på innsatser som beskrevet i trinn 1.1-3.2, bortsett fra ikke skive P0 og P4 eggstokkene.
- Erstatt kultur medium med friske, forvarmes medium 3,5 cm retter i en inkubator inneholder 5% CO2 på 37 ° C hver 2 dager.
Merk: Konsentrasjonen av LH i kultur medium til P0 og P4 eggstokkene kan forbli konstant fordi LH overspenning ikke forekommer i P0 og P4 mus. - Satt mikroskop for å visualisere bare AcGFP1-positive primære follikler i kulturperler P4 eggstokkene (tabell 1).
Merk: Bare primordial og primære follikler finnes i P4 kvinnelige musen eggstokkene. - Ta bilder av kultivert P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry transgene mus eggstokkene med 30 min mellomrom bruker innstillingene som brukes for P4 eggstokkene (se trinn 5.2).
- Spore og analysere hårsekken utvikling med AcGFP1 og H2B-mCHerry signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser protokollen for endringer i media i eggstokkene vev kultur. Etter dette programmet, 4-uke-gamle ICR mus eggstokkene kultivert og fotografert i 24-h intervaller med AC confocal mikroskopi (figur 2). Under kultur av eggstokk vev i 3 uker, mest Boas og sekundære follikler var degenerert av hårsekken atresia og noen var ovulated (figur 2D og tabell 2). Analyse av hårsekken områder ved hjelp av ImageJ (Figur 3), utviklet noen follikler i grupper under hver LH bølge syklus (Figur 3B og supplerende film 1). Videre skjedde eggløsningen nesten samtidig i separate kulturperler eggstokkene fra høyre og venstre eggstokkene enkelt mus. Mens, tidspunktet for eggløsning og antall ovulated oocytes (tabell 2) differansen imellom musen eggstokkene (data ikke vist), inntraff eggløsning fra kulturperler eggstokkene hovedsakelig innen 48 timer av LH støt (Figur 3og utfyllende Filmen 1). Men ikke alle ovulated oocytes utgitt første polar organer etter eggløsning (figur 2E og tabell 2), og selv om ovulated oocytes kan befruktes, utvikling sluttet på 4-cellers scenen (data ikke vist). For å belyse mekanismer som sovende primordial follicles aktiveres i musen eggstokkene, oppdaget vi primordial hårsekken aktivisering i kulturperler vev fra transgene mus med Oog1pro3.9 og R26-H2B-mCherry effekter av transgener ( Figur 4 figur 5og supplerende filmen 2). Oocytes express svært lave nivåer av Oog1 genet fra primordial hårsekken scenen og tidsinnstilt bildebehandling utmerket lav AcGFP1-uttrykke primordial follikler fra høy AcGFP1-uttrykke primære follikler. Primordial og primære follikler finnes samtidig i P4 musen eggstokkene, mens bare primordial follikler finnes i P0 eggstokkene (Figur 4A, B). Derfor optimalisert vi time-lapse imaging forhold å oppdage bare primære follikler i kulturperler P4 eggstokkene (Figur 4C). Senere tatt vi bilder av kultivert P0 eggstokkene i 10 dager i samme vilkår (Figur 4D-G). AcGFP1 kan brukes som en indeks av primære follikler i disse transgene mus og AcGFP1-positive primære follikler var i kulturperler P0 eggstokkene etter 30 – 40 h kultur (Figur 4 figur 5A-Fog utfyllende Filmen 2). Primordial og primære follikler i kulturperler eggstokkene var også preget av mCherry-positive kjerner granulosa celler (figur 5B, E). Spesielt mCherry signaler angi former for follicles og tillate observasjon av hårsekken stadier i kulturperler eggstokkene (figur 5B, E, og H). Derfor denne kultur-systemet bruker eggstokkene fra Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry mus avslørt prosessen med tidlig hårsekken utvikling fra primordial til sekundære hårsekken stadier. Disse metodene vil lette studier av regulatoriske mekanismer av gonadotropin-uavhengig hårsekken utvikling.
Figur 1 : Gang løpet av middels endringer. Middels A inneholder 5% FBS, 100-mU FSH, 10-mU LH, 100-U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin i MEM-alpha. Middels B inneholder 5% FBS, 100-mU FSH, 100-mU LH, 100-U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin i MEM-alpha. Middels B ble brukt til å produsere LH støt hver 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Bilder av kultivert ovarian vev. Bildene ble tatt på 24-timers intervaller med AC confocal mikroskopi. (A) kultur dag 1; (B) kultur dag 5; (C) kultur dag 10; (D) kultur dag 13; (E) Magnified bildet av området angitt av plassen i (D); oocytes i D var ovulated fra follikler angitt med piler i B, C og D. (F) Oocyte slippe en polar kroppen etter eggløsning; Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Målinger av hårsekken områder i kulturperler eggstokkene. (A) bilde av kultivert eggstokk; prikkete linjene representerer området målt ved ImageJ. (B) follikulær områder i kulturperler eggstokk etter 3 uker; grå linjer representerer kultur perioden fra tillegg av 100 mM LH (LH bølge). Linjene viser utviklingstrinn i hvert hårsekken i kulturperler eggstokken; Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Hematoxylin og Eosin (H & E) flekker bilder av P0 og P4 eggstokkene og tidsinnstilt bildebehandling. (A) H & E farging av P0 eggstokk; (B) H & E farging av P4 eggstokk; (C) bilde av en P4 eggstokk fra en Oog1pro3.6 transgene musen etter 10t kultur. Pilen viser en AcGFP1-positive primære hårsekken. (D-G) Bilder av P0 eggstokkene fra transgene mus uttrykke Oog1pro3.9 og R26-H2B-mCherry; grønne og røde signaler i D og F representerer AcGFP1 og mCherry, henholdsvis. Hvit signaler i E og G representerer AcGFP1 i D og F, henholdsvis. D og E er bilder av kultivert eggstokkene etter 0,5 h kultur. F og G viser eggstokkene etter 180 h kultur; Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: bilder av primordial, primære, og sekundære follicles i kulturperler eggstokkene fra oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry mus. (En-C) Bilder av primordial follicles i kulturperler P0 eggstokkene; (D-F) Bilder av primære follikler i P0 kulturperler eggstokk; (G-H) Bilder av sekundær follikler i kulturperler 4-uke-gamle musen eggstokkene. A, D og G er flettede bilder av B og C, E og F, og H og jeg, henholdsvis. Green, AcGFP1; rød, mCherry; Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| mikroskopet | linsen | laser | eksponering (ms) | Få | tidsintervall | z-stabel | andre | Figurer og filmer |
| CV1000 | X10 | 488 nm: 30, 561 nm: 20 | 488 nm: 700, 561 nm: 600 | 488 nm: 90, 561nm: 20 | 30 min | 5 mm | Figur 4C-G, film 1 og 2 | |
| BZ-X700 | X20 (med samling krage) | 40% | automatisk | X4 | 30 min | 10 mm | binning 3 x 3 | Filmen 3 |
| LSM710 | X10 | 488 nm: 6%, 564 nm: 5% | Kamerahastighet: 4 | 488 nm: 850, 564 nm: 850 | 24 h | 10 mm | Digital få, 488 nm: 2, 564 nm:1 | Figur 2, 3 og 5 |
Tabell 1: Time-lapse imaging forhold. Time-lapse tenkelig betingelse for AC confocal og lyse mikroskop.
| Eggstokken ingen. | Antall totalt ovulated oocytes | Antall MII oocytes |
| 1 | 7 | 2 |
| 2 | 19 | 9 |
| 3 | 14 | 6 |
| 4 | 7 | 3 |
| 5 | 12 | 4 |
| 6 | 15 | 6 |
| 7 | 25 | 11 |
| 8 | 13 | 3 |
| 9 | 11 | 7 |
| 10 | 19 | 8 |
| 11 | 18 | 4 |
| 12 | 7 | 1 |
Tabell 2: antall ovulated oocytes i kulturperler eggstokkene. Antall ovulated oocytes fra tolv kulturperler eggstokkene; MII angir antall ovulated oocytes som utgitt første polar organer etter eggløsning.
Supplerende film 1: Time-lapse film av en kultivert eggstokk. Eggstokkene var ble samlet fra 4 - uke gamle mus og skiver og kultivert i 3 uker. Filmen spenner over en kultur periode på 0-200 h på 10 rammer/s. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Supplerende Movie 2: Time-lapse film av en kultivert P0 eggstokk fra transgene mus. Green, AcGFP1; rød, mCherry. Filmen spenner over en kultur periode 0-180 h på 10 rammer/s. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Sekvenser komplementære filmen 3: Time-lapse film av en kultivert eggstokk fra 4 uker gamle musen. Green, AcGFP1; rød; mCherry; Filmen omhandler en kultur periode på 9-13 kultur dager på 10 rammer/s. Pilene i det første bildet viser follikler i atresia som oppstod under kultur. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien utviklet vi to nye metoder for å studere hårsekken utvikling i musen eggstokkene. Den første metoden innebærer kultur av skiver ovarian voksen mus vev etterfulgt av analyser av hårsekken utvikling, og andre innebærer bruk av time-lapse tenkelig å visualisere hårsekken utviklingen under gonadotropin-uavhengig scenen. Tidligere vi brukte stede eggstokk vev kultur metoden for å vurdere effekten av leukemi hemmende faktor og progesteron på hårsekken utvikling8,9, og viste at deres effekter varierer med konsentrasjon og hårsekken. Studien, skiver ovarian vev utstilt hårsekken dynamikk, krever ytterligere analyser av ovarian follikkelen utviklingsmekanismen bruker denne modellen.
Eggstokkene fra mus mer enn 5 uker gammel inneholder corpus lutea som hindrer mikroskopiske observasjoner. Derfor 4-uke-gamle musen eggstokkene foretrekkes for observasjoner av hårsekken utvikling og eggløsning, og påfølgende sent primær, sekundær og Boas follikler skilles lettere med lyse feltet mikroskopi. Våre metoder tilbyr sammenligninger av effekten av vekstfaktorer og narkotika i kultur medier, merkes endringer i hårsekken utvikling mellom ulikt behandlet eggstokkene (Figur 3).
Transgene mus uttrykke grobunn eller fluorescein proteiner i oocytes har blitt beskrevet i tidligere studier18,19,20. Men follikulær fase klassifisering avhenger av histologiske egenskaper, inkludert granulosa celle figurer, antall granulosa celle lag, og om theca celler er dannet. Forskjeller mellom primordial og primære follikler kan dermed være begrenset fra observasjoner av oocytes alene. Her, vi brukte transgene mus som inneholder Oog1pro3.9 og R26-H2B-mCherry effekter av transgener11,17 og visualisere tidlig hårsekken utvikling fra primordial til sekundære hårsekken stadier i kulturperler eggstokkene. Oog1 uttrykk blir i oocytes under primordial hårsekken Stadium, og er markert økt i primære follikler. Derfor AcGFP1 signal intensiteten i oocytes er knyttet til hårsekken scenen (figur 5) og ble brukt til å observere primordial-primære hårsekken overganger (Figur 4, utfyllende Movie 2). Cellen kjerner er farget rødt i R26-H2B-mCherry transgene mus (Figur 4 utfyllende Movie 2og supplerende Movie 3), slik at observasjoner av hårsekken stadier etter antall granulosa celler ( Figur 5). Dermed samlet nåværende metodene tillater analyser av hårsekken utviklingen fra primordial gjennom til eggløsning bruker Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry transgene mus. Videre, fordi apoptotisk celle chromatin er kondensert, mCherry signaler atretic follikler er sterkere enn vanlig follikler (supplerende Movie 3).
Blant metodologiske nyanser er riktig tykkelser skiver vev nødvendig for vellykket dyrking, med økt celledød i eggstokken skiver som er for tykk, og tap av store Boas follicles i eggstokken skiver som er for tynn. Hårsekken vekst arbeidstempoet er langsom; Derfor er det enkelt å spore og analysere prosessen med hver follicle via 24-h intervall observasjon. Nåværende AC confocal mikroskopet innstilling, inkludert laser intensitet, intervalltiden og digital fortjene, er avhengige av mikroskop modus, men er kritisk å vurdere når skaffe time-lapse bilder. Spesielt sterk laser intensitet og lange eksponeringstider må fange klare bilder, men kan påvirke kulturperler celler. Derfor er moderasjon disse innstillingene å unngå Phototoksisitet kritiske. Skiver ovarian vev av 4-uke-gamle mus kan kultivert for ca 4 uker, mens primordial og primære follikler forbli der senere, de ikke lenger vokser. Derimot kan P0 og P4 eggstokkene kultivert i ca 10 dager, der primordial og primære follikler utvikle seg til primær eller sekundær follicles, henholdsvis. Imidlertid utvikle follikler i kulturperler P0 og P4 eggstokkene ikke i Boas follikler. Derfor er excision av eggstokkene nødvendig på ulike stadier for studier av regulatoriske mekanismer knyttet til hel eggstokk hårsekken utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Naojiro Minami (Kyoto University) for å gi Oog1pro3.9 mus. Denne forskningen ble støttet av JSP (KAKENHI # JP15H06275) og Nitto Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
- Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
- Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
- Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
- Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
- Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
- Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
- Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
- Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
- Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
- Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
- Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
- Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).
