Summary
بهدف فهم السلوكيات عناصر الحمض النووي كونجوجاتيفي البكتيرية المختلفة تحت ظروف مختلفة، يمكننا وصف بروتوكول للكشف عن الاختلافات في تكرار الاقتران، بدقة عالية، لتقدير مدى فعالية هذه البكتيريا المانحين يبدأ الاقتران.
Abstract
تصريف الجرثومي خطوة هامة في نقل جينات مقاومة المضادات الحيوية أفقياً عبر عنصر الحمض النووي كونجوجاتيفي. مقارنات معمقة للتردد التصريف تحت ظروف مختلفة مطلوبة لفهم كيف ينتشر العنصر كونجوجاتيفي في الطبيعة. ومع ذلك، الأساليب التقليدية لمقارنة تواتر الاقتران غير مناسبة لمقارنات معمقة بسبب الخلفية العالية الناجمة عن وقوع أحداث اقتران إضافية على لوحة انتقائية. خفضنا الخلفية بنجاح بإدخال أسلوب (MPN) عدد الأكثر احتمالاً وتركيز أعلى من المضادات الحيوية لمنع المزيد من التصريف في المتوسط السائل انتقائية. وبالإضافة إلى ذلك، علينا وضع بروتوكول لتقدير احتمال كيف غالباً ما المانحة الخلايا الشروع الاقتران بفرز الخلايا مانح واحد ضمن تجمعات المستلم بالأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية). استخدام البلازميدات اثنين، pBP136 و pCAR1، الاختلافات في تكرار الاقتران في الخلايا Pseudomonas putida يمكن اكتشاف في المتوسطة السائل بنسب مختلفة من إثارة. ترددات الشروع في تصريف كانت أعلى بالنسبة pBP136 من أجل pCAR1. باستخدام هذه النتائج، يمكننا أن نفهم أفضل الميزات التصريف في هذه البلازميدات اثنين.
Introduction
تصريف البكتيرية من عناصر وراثية متحركة، البلازميدات كونجوجاتيفي، والعناصر التكاملية وكونجوجاتيفي (ICEs) مهم للانتشار الأفقي للمعلومات الوراثية. ويمكن تعزيز التطور الجرثومي السريع والتكيف ويحيل مقاومة عصيات الجينات1،2. يمكن أن تتأثر تكرار الاقتران بالبروتينات المشفرة في العناصر كونجوجاتيفي لتعبئة "الحمض النووي" (الغوغاء) وتكوين زوج التزاوج (MPF)، بما في ذلك الجنس بيلي، التي تصنف وفقا للغوغاء و MPF نوع3،4، 5. يمكن أن يتأثر أيضا بالجهات المانحة والمتلقية زوج6 وظروف النمو7،الخلايا8،10،9،،من11(12 معدل النمو وكثافة الخلية، سطح صلب أو سائل المتوسطة، درجة الحرارة، توافر المغذيات ووجود الاتصالات). لفهم كيفية انتشار عناصر كونجوجاتيفي بين البكتيريا، من الضروري مقارنة تواتر الاقتران بالتفصيل.
تكرار الاقتران بين البلدان المانحة والمتلقية من أزواج بعد التزاوج تقدر عادة بالطرق التقليدية كما يلي. (ط) أولاً، يتم احتساب عدد المستعمرات الجهات المانحة والمتلقية؛ (ثانيا)، ثم يتم عد المستعمرات المستفيدة، التي تلقت عناصر كونجوجاتيفي (= ترانسكونجوجانتس)؛ (ثالثا) وأخيراً، يحسب تكرار الاقتران بتقسيم مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) ترانسكونجوجانتس تلك الجهات المانحة و/أو مستلم13. ومع ذلك، عند استخدام هذا الأسلوب، الخلفية مرتفعة بسبب اقتران إضافية الأحداث التي يمكن أن تحدث أيضا على لوحات انتقائية تستخدم للحصول على ترانسكونجوجانتس عند كثافة الخلية هو ارتفاع10. ولذلك، من الصعب الكشف عن الفروق الصغيرة في التردد (أقل من فارق الوقت). نحن قدم مؤخرا طريقة (MPN) رقم الأكثر احتمالاً استخدام سائل المتوسطة التي تحتوي على تركيز أعلى من المضادات الحيوية. هذا الأسلوب خفض الخلفية عن طريق تثبيط زيادة التصريف في المتوسط انتقائية؛ وهكذا يمكن تقدير تواتر الاقتران مع دقة أعلى.
التصريف يمكن تقسيمها إلى ثلاث خطوات: (1) مرفق المانح ومتلق الزوج (2) الشروع في نقل كونجوجاتيفي، و (3) الانفصال من زوج14. خلال الخطوات (1) و (3)، وهناك تفاعل المادية بين البلدان المانحة والمتلقية من الخلايا؛ وهكذا، كثافة الخلية والظروف البيئية يمكن أن تؤثر هذه الخطوات، على الرغم من أن ملامح بيلي الجنس أيضا هامة. الخطوة (2) يرجح أن ينظم عدة الجينات المشاركة في تصريف استجابة للتغيرات الخارجية، التي يمكن أن تتأثر بالعديد من الميزات بلازميد، الجهات المانحة والمتلقية. على الرغم من أن المرفق المادي أو مفرزة من أزواج بين المانحين والمتلقين يمكن حسابياً محاكاة استخدام تقدير خلايا كجسيمات، وينبغي قياس تكرار الخطوة (2) تجريبيا. كانت هناك بضعة تقارير عن الملاحظات المباشرة كيف غالباً المانحين يمكن الشروع في تصريف [الخطوة (2)] استخدام fluorescence مجهرية15،16؛ ومع ذلك، هذه الأساليب لا الفائق لأنه يجب رصد عدد كبير من الخلايا. ولذلك، قمنا بتطوير أسلوب جديد لتقدير احتمال حدوث الخطوة (2) باستخدام fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية). لدينا طريقة يمكن تطبيقها على أي بلازميد، دون تحديد الجينات الأساسية للاقتران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد إحدى الجهات المانحة مع البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)-ووالبلازميدات معلم الجينات المقاومة كاناميسين
- إدخال جينات ماركر في pBP136 بلازميد الهدف
ملاحظة: والهدف من هذا البروتوكول توليد pBP136::التجارة والنقل. وترد في الجدول 1السلالات البكتيرية ووالبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة.- تنمو الثقافات من الإشريكيّة القولونية DH10B تأوي pBP13617 في 5 مل مرق لوريا العقيمة (رطل) وألبيرS17-1λ كولاي 18 إيواء pJBA2819 [التي تتضمن كاناميسين (كم)-المقاومة الجينات و بروتينات فلورية خضراء mut3 * الجينات مع المروج والمدمر في تينيسي ميني5] في 5 مل رطل العقيمة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل كم في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (O/N، ح 16 – 24) مع الهز في 200 الثورات في الدقيقة الواحدة (لفة في الدقيقة).
- الحصاد والغسيل
- حصاد 1 مل من كل ثقافة، ووضعه في microtube 2 مل، وأجهزة الطرد المركزي (10,000 × ز، درجة حرارة الغرفة، 2 دقيقة). ثم تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل من الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS).
- الطرد المركزي مرة أخرى (10,000 × ز، درجة حرارة الغرفة، 2 دقيقة)، وريسوسبيند في 500 ميكروليتر من PBS العقيمة.
- تصفية التزاوج
- إعداد العقيمة لوحات رطل (مع أجار 1.6%)، ووضع عامل تصفية غشاء حجم مسام ميكرومتر 0.22 عقيمة على ذلك. ميكس 500 ميكروليتر كولاي S17-1λبير pJBA28 إيواء مع DH10B كولاي إيواء pBP136 وبقعة الخليط في عامل التصفية على لوحة رطل. احتضان لوحة O/N في 30 درجة مئوية. إزالة عامل تصفية من لوحة رطل ووضعه في أنبوب بلاستيك معقمة 50 مل وإضافة 1 مل PBS العقيمة.
ملاحظة: pJBA28 ويمكن تكرار حضور البروتين Π، مرمزة بواسطة الجينات بير 18، ويمكن نقلها من S17-1λبير إلى DH10B. يحمل لا علامة الجينات17 pBP136 ويمكن نقلها من DH10B إلى S17-1λبير. ولذلك، يمكن أن نميز لا S17-1λبير إيواء pBP136 و pJBA28 من DH10B pBP136 إيواء وميني-تينيسي5 (تحويل إلى كروموسوم أو pBP136) في هذه المرحلة. ثم، نحن خلائط من هذه الجهات المانحة في الخطوات اللاحقة (1.1.4.–1.1.5.).
- إعداد العقيمة لوحات رطل (مع أجار 1.6%)، ووضع عامل تصفية غشاء حجم مسام ميكرومتر 0.22 عقيمة على ذلك. ميكس 500 ميكروليتر كولاي S17-1λبير pJBA28 إيواء مع DH10B كولاي إيواء pBP136 وبقعة الخليط في عامل التصفية على لوحة رطل. احتضان لوحة O/N في 30 درجة مئوية. إزالة عامل تصفية من لوحة رطل ووضعه في أنبوب بلاستيك معقمة 50 مل وإضافة 1 مل PBS العقيمة.
- تنمو ثقافة س/ن من خليط التزاوج أعلاه في رطل العقيمة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل كم في 37 درجة مئوية مع الهز في 200 لفة في الدقيقة وثقافة KT2440 Pseudomonas putida [الحساسة كم (كمs)، والريفامبيسين الحساسة (ريفs)، الجنتاميسين الحساسة (جنرال موتورزs)، ومقاومة التتراسيكلين (حص)] في المتوسط تحتوي على 12.5 ميكروغرام/مل ح عند 30 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة.
- بعد الحصاد وغسل الخلايا كما هو الحال في الخطوة 1.1.2، استخدم لهم (التزاوج الخليط و KT2440) لتصفية التزاوج (O/N, 30 درجة مئوية) كما هو الحال في الخطوة 1-1-3.
- إعداد لوحات رطل العقيمة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل كم و 12.5 ميكروغرام/مل ح (Tc + رطل + كم لوحات).
- تمييع الخليط ريسوسبينديد على تصفية الغشاء مع PBS العقيمة (101–105-إضعاف)، وانتشار ثم كل تمييع على Tc + رطل + كم لوحات واحتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمد 2-3.
- اختيار المستعمرات من اللوحات، وتنمو ثقافة O/N في رطل العقيمة التي تحتوي على كم والتعاون التقني، فضلا عن ف. ريسينوفورانس CA10dm4RG (ريفr وغمآر)6 في رطل العقيمة التي تحتوي على الريف (25 ميكروغرام/مل) والآلية العالمية (30 ميكروغرام/مل) في 30 درجة مئوية و 200 لفة في الدقيقة.
ملاحظة: كما هو مبين في المذكرة السابقة، المستعمرات على رطل + كم + Tc لوحات (من 1.1.7.) قد KT2440 pBP136 إيواء تحمل من ميني-تينيسي5 و KT2440 مع ميني-تينيسي5، لأنه يمكن نقل pJBA28 مباشرة من S17-1λبير إيواء pBP136 و pJBA28 إلى KT2440. وهذا السبب في آخر التزاوج مع CA10RG ريسينوفورانس P. مطلوب للحصول على pBP136 المستهدفة مع ميني-تينيسي5 في الخطوات التالية. - بعد الحصاد وغسل الخلايا كما هو الحال في الخطوة 1.1.2، استخدامها لتصفية التزاوج (O/N, 30 درجة مئوية) كما هو الحال في الخطوة 1-1-3.
- إعداد لوحات رطل العقيمة التي تحتوي على الريف وجنرال موتورز، وكم (رطل الريف + كم + جنرال موتورز لوحات).
- ريسوسبيند الخليط في عامل التصفية، وتمييع ثم 101–105-إضعاف، وانتشر إلى رطل الريف + كم + جنرال موتورز اللوحات، واحتضان اللوحات لمد 2-3 في 30 درجة مئوية.
- اختيار المستعمرات والتحقق إذا أنها تأوي pBP136 طريق PCR باستخدام كبسولة تفجير محددة بلازميد.
- إدخال الجين ماركر انتقائية في pCAR1 بلازميد الهدف
ملاحظة: الهدف من هذا البروتوكول لتوليد pCAR1::بروتينات فلورية خضراء- تنمو ثقافة O/N KT2440 P. putida إيواء pCAR1 (كمs، جنرال موتورزs، ريفs، حص)20 على 200 لفة في الدقيقة و 30 درجة مئوية و S17-1λ كولاي بير18 إيواء pJBA28 في 5 مل رطل العقيمة تحتوي على 50 ميكروغرام/مل كم في 200 لفة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
- بعد الحصاد وغسل الخلايا كما هو الحال في الخطوة 1.1.2، استخدامها لتصفية التزاوج (O/N, 30 درجة مئوية) كما هو الحال في الخطوة 1-1-3.
- إزالة عامل تصفية من لوحة رطل ووضعه في أنبوب بلاستيك معقمة 50 مل وإضافة 1 مل PBS العقيمة.
- تمييع الخليط ريسوسبينديد مع PBS العقيمة (101–105-إضعاف)، وينتشر الخليط المخفف على رطل انتقائية العقيمة + ح + كم لوحات.
ملاحظة: pCAR1 لا النسخ المتماثل في كولاي؛ وهكذا، P. putida KT2440 pCAR1 إيواء مع ميني-تينيسي5 يمكن تحديدها على رطل + ح + كم لوحات. - اختيار مستعمرة من اللوحة، وتنمو ثقافة O/N في رطل العقيمة التي تحتوي على كم والتعاون التقني وثقافة ف. ريسينوفورانس CA10dm4RG في رطل العقيمة التي تحتوي على الريف وجنرال موتورز (200 لفة في الدقيقة، 30 درجة مئوية).
- بعد الحصاد والغسل كما في الخطوة 1.1.2، استخدام الخلايا لتصفية التزاوج (O/N, 30 درجة مئوية) كما هو الحال في الخطوة 1-1-3.
- ريسوسبيند الخليط في عامل التصفية ثم تمييع، تنتشر على رطل الريف + كم + جنرال موتورز لوحات، واحتضان اللوحات لمد 2-3 في 30 درجة مئوية.
- اختيار المستعمرات والتحقق إذا أنها تأوي pCAR1 طريق PCR مع الإشعال محددة بلازميد.
- التأكد من إمكانية تحويل والبلازميدات معلم وإعداد الجهات المانحة للخطوات المقبلة
ملاحظة: الهدف من هذا البروتوكول هو للتأكد من إمكانية تحويل والبلازميدات شيدت أعلاه وإعداد الجهات المانحة للخطوات المقبلة.- تنمو ثقافة O/N CA10dm4RG ريسينوفورانس P. إيواء pBP136::التجارة والنقل أو pCAR1::التجارة والنقل في رطل العقيمة التي تحتوي على كم وثقافة P. putida الموصولة [كمs، جنرال موتورزs، ريفص، حص، ﻻسي ، سفي أي فA1/O4/O3-gfpmut3* لا أعرب عن سبب الجينات الصبغية ﻻسيq ]21 في 3 مل رطل المحتوية على Tc (200 لفة في الدقيقة، 30 درجة مئوية).
- بعد الحصاد وغسل الخلايا كما هو الحال في الخطوة 1.1.2، استخدامها لتصفية التزاوج (O/N, 30 درجة مئوية) كما هو الحال في الخطوة 1-1-3.
- وضع عامل التصفية في أنبوب بلاستيك معقمة 50 مل، وريسوسبيند مع 1 مل PBS العقيمة. تمييع الخليط ريسوسبينديد مع PBS العقيمة (101–105-إضعاف)، ينتشر الخليط المخفف على رطل انتقائية العقيمة + ح + كم لوحات.
- اختيار المستعمرات وتحقق إذا كانت تأوي كل من البلازميدات ببكر مع الإشعال محددة.
ملاحظة: تأكيد موقف ميني-تينيسي5 حسب التسلسل مباشرة بعد استخراج بلازميد اختيارية، للتأكد من أن الإدراج لا يؤثر على وظيفة نقل البلازميدات الإدراج.
2-حساب التردد الاقتران بطريقة MPN
- إعداد العقيمة رطل + كم ورطل + جنرال موتورز لوحات.
- تنمو ثقافة الموصولة P. putida إيواء pBP136 O/N::التجارة والنقل أو pCAR1::التجارة والنقل في 3 مل رطل العقيمة التي تحتوي على كم وثقافة KT2440RGD P. putida (Gmr، ريفr) في 3 مل رطل تتضمن الآلية العالمية (140 لفة في الدقيقة، 30 درجة مئوية).
- بعد الحصاد وغسل الخلايا كما هو الحال في الخطوة 1.1.2، استخدامها لتصفية التزاوج عند 30 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة كما هو الحال في الخطوة 1-1-3.
- تمييع التسلسل أعلاه البلدان المانحة والمتلقية الثقافة (101 –107) وانتشر إلى رطل + كم (المانحين) أو رطل + جنرال موتورز (المتلقي) لوحات (كل منهما في ثلاث نسخ) لعد مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي). احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمد 2.
- ريسوسبيند الخليط على عامل التصفية في رطل العقيمة التي تحتوي على كم وجنرال موتورز، وتمييع متسلسل (من 21 إلى 224–107.2) باستخدام لوحة ثقافة خلية 96-جيدا (في البيلوروسية).
- احتضان لوحة 96-جيدا للوقت المناسب (د 2 في 30 درجة مئوية).
- عد زيمبابوي للبلدان المانحة والمتلقية على اللوحات (الخطوة 2.4.) وحساب عدد الآبار التي تنمو ترانسكونجوجانتس.
- حساب في MPN وانحرافها باستخدام برنامج حساب MPN وضعتها جارفيس وآخرون. 22، ومتاح على http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls.
- أدخل الاسم لهذه التجربة (خروج، 'اختبار')، تاريخ التجربة (خروج، 2018/4/9)، والعدد من سلسلة التجارب، والحد الأقصى. لا. لتخفيف (أدخل '24') في الصف #7 'البرنامج' ورقة Excel الملف ('MPN_ver5.xls').
- أدخل '2-1 (= 0.5) إلى 2-24 (= 5.96 × 10-8)' في العمود 'تمييع عامل د'، '0.01' في العمود 'وحدة التخزين في مل أو ز ث'، و 4 'في' رقم ن الأنابيب 'في الجداول تلقائياً المنتجة من' إدخال البيانات '.
- أدخل عدد الآبار التي تنمو ترانسكونجوجانتس في كل تمييع عينة (0 – 4).
- تضغط على الزر '"حساب النتائج"' الأيمن العلوي، ومن ثم الحصول على النتائج (في MPN/ميكروليتر) وعلى حدود الثقة 95% (السفلي والعلوي).
- حساب تواتر والبلازميدات الاقتران بقسمة عدد ترانسكونجوجانتس (MPN/mL) بالعدد من البلدان المانحة والمتلقية الخلايا (زيمبابوي/mL).
3-التحضير لتقدير الاحتمال لتصريف بدأت الجهات المانحة
- تنمو ثقافة الموصولة P. putida إيواء pBP136 O/N::بروتينات فلورية خضراء أو pCAR1::التجارة والنقل في 3 مل رطل العقيمة التي تحتوي على كم وثقافة KT2440RGD P. putida (Gmr، ريفr) في 3 مل رطل العقيمة التي تتضمن الآلية العالمية باستخدام 300 مل قوارير (140 لفة في الدقيقة، 30 درجة مئوية) بريكولتوريس.
- نقل 200 ميكروليتر من بريكولتوري إلى 200 مل رطل العقيمة الطازجة التي تحتوي على كم أو جنرال موتورز في قوارير 500 مل واحتضان عند 30 درجة مئوية مع الهز 140 لفة في الدقيقة.
- قياس التعكر في 600 نانومتر (OD600) للثقافة باستخدام جهاز المطياف الضوئي تجاه الأشعة فوق البنفسجية وبقعة الثقافة، وتضعف في رطل (101–108-إضعاف تخفيف)، على صفيحة رطل يحتوي على كم أو لوحات Gm. إينكوباتي هذه رطل عند 30 درجة مئوية عن د 1-2 ، وتحديد في زيمبابوي.
- رسم القيم600 OD وزيمبابوي مع الوقت النمو لإنشاء منحنيات النمو للبلدان المانحة والمتلقية.
- تنمو ثقافات سلالة الجهات المانحة والمتلقية لسجل منتصف المرحلة، استناداً إلى منحنى النمو.
- وبعد الحصاد وغسل الخلايا، إعداد 101–103 زيمبابوي للجهات المانحة في ميكروليتر 10 رطل و 105–107 زيمبابوي للمستلم في 100 ميكروليتر من رطل.
- ميكس 10 ميكروليتر من الجهة المانحة و 100 ميكروليتر من الثقافات المتلقية في كثافات مختلفة في لوحات 96-جيدا (في ثلاث نسخ). على سبيل المثال، مزيج 101 زيمبابوي من الجهة المانحة و 105 زيمبابوي للمستلم وإضافته إلى كل من الآبار 96، ومزيج 101 زيمبابوي للجهات المانحة و 106 زيمبابوي للمستلم في آخر لوحة 96-جيدا، وهلم جرا.
- احتضان هذا الخليط عند 30 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، ثم قم بإضافة تركيزات عالية من المضادات الحيوية (100 ميكروغرام/مل كم و 60 ميكروغرام/مل جنرال موتورز) لكل بئر لمنع المزيد من الاقتران.
- احتضان لوحة عند 30 درجة مئوية لمد 2.
- حساب عدد الآبار التي تنمو فيها ترانسكونجوجانتس.
- اختر كثافة المستلم المناسب لتقدير الاحتمال لتصريف بدأت الجهات المانحة على أساس البيانات أعلاه (ترانسكونجوجانتس ينبغي العثور على مالا يقل عن 1 جيدا من صفيحة 96-جيدا).
ملاحظة: ترانسكونجوجانتس سوف تنمو في جميع الآبار عندما ترتفع كثافة الخلايا المتبرع والمتلقي ويحدث اقتران واحد أو أكثر في بئر. على النقيض من ذلك، سيتم العثور على لا ترانسكونجوجانتس في أي الآبار عند كثافة الخلية منخفض جداً. في المقطع التالي، يتم فرز خلية مانح في بئر. ولذلك ينبغي أن تكون كثافة المتلقية كحد أقصى.
4-تقدير الاحتمال لتصريف بدأت الجهات المانحة
- إعداد 200 مل ثقافة سجل منتصف المرحلة للمانحين الموصولة P. putida إيواء pBP136::التجارة والنقل أو pCAR1::التجارة والنقل ، وأن المتلقي KT2440RGD P. putida ، كما هو موضح في 3.6-3.7.
- 10 مكان6 زيمبابوي للمستلم في 100 ميكروليتر من رطل في كل من لوحة 96-جيدا جيدا.
- قم بإعداد هذا النظام نظام مراقبة الأصول الميدانية (التدفق الخلوي والخلية فارز مع ذراع روبوتية وليزر أرجون 488 نانومتر من فوهة فوهة 70 ميكرومتر). تعيين إلى الأمام مبعثر (FSC)، مع عتبة 1% كالزناد اقتناء. لحن المكسب ح ومكسب لمنتدى التعاون الأمني والجانب مبعثر (SSC) في الحساسية القصوى التي يمكن استبعاد الإشارات الإيجابية الكاذبة، باستخدام برنامج تلفزيوني كعنصر سلبي. تعيين بوابة الفرز استناداً إلى منتدى التعاون الأمني والتعاون بين بلدان الجنوب ووضع قطره 0.5 الفرز لفرز القصوى النقاء.
- نوع خلية مانح واحد بنظام مراقبة الأصول الميدانية على صفيحة رطل (384 بقع مختلفة)، احتضان لوحة عند 30 درجة مئوية لمد 2، ومن ثم عد المستعمرات كم تظهر على اللوحة من الخلايا تم فرزها.
ملاحظة: ويتم هذا الإجراء للتحقق من صحة مجموعة من البوابة. إذا كان هناك مستعمرات 384 على اللوحة، فهذا يعني أن 100% من فرز الخلايا يمكن أن تشكل المستعمرات. متوسط صحة الفرز هو دائماً 90 – 95%. - فرز خلية مانح واحد بنظام مراقبة الأصول الميدانية في كل من لوحة 96-جيدا جيدا مع المستلم (4.2).
- احتضان لوحة لمدة 45 دقيقة في 30 درجة مئوية، ثم قم بإضافة تركيزات عالية من المضادات الحيوية (100 ميكروغرام/مل كم و 60 ميكروغرام/مل جنرال موتورز) لكل بئر لمنع المزيد من الاقتران.
- احتضان لوحة عند 30 درجة مئوية لمد 2.
- إحصاء عدد الآبار التي نمت ترانسكونجوجانتس كما يحدده الفحص البصري بالعين المجردة.
- حساب الاحتمال لتصريف بدأت الجهات المانحة بقسمة العدد الآبار مع ترانسكونجوجانتس بإجمالي عدد الآبار التي تم فرز الجهة المانحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مقارنة تواتر الاقتران بطريقة MPN
في تقريرنا السابق، يمكننا مقارنة الترددات الاقتران pBP136::التجارة والنقل و pCAR1::التجارة والنقل في الثلاثي المخفف رطل (1/3 رطل) المتوسطة السائل بمعدلات مختلفة لإثارة بعد التزاوج 45 دقيقة استخدام قوارير غزل 125 مل10. نحن مقارنة الترددات الاقتران pBP136::التجارة والنقل و pCAR1::التجارة والنقل مع 106 زيمبابوي/مل سلالات الجهات المانحة والمتلقية تحت ظروف مختلفة إثارة (0-600 لفة في الدقيقة). تكرار الاقتران كلا والبلازميدات زاد معدل أعلى من إثارة، وكان الحد الأقصى للفرق في وتيرة التصريف < إذ ل pBP136::التجارة والنقل (بين 0 و 400 لفة في الدقيقة)، في حين أن من pCAR1::التجارة والنقل وكان ~ 25-fold (بين 0 و 200 دورة في الدقيقة؛ الشكل 1).
تقدير الاحتمال لتصريف بدأت الجهات المانحة
احتمال المقدرة سابقا لتصريف بدأت الجهات المانحة يرد في الجدول 2. لتحديد كثافة الخلايا المتلقية المطلوبة لمقارنة احتمال الاقتران، التزاوج فحوصات أجريت بكثافات مختلفة من الجهات المانحة والمتلقية. كما هو مبين في الجدول 2، pBP136:: ترانسكونجوجانتسالتجارة والنقل ، تم الكشف عن 100 ٪ (96/96) من الآبار التي تحتوي على 103 زيمبابوي من المانحين و 105-107 زيمبابوي للمستلم، وتلك مع 102 زيمبابوي من المانحين و 106-107 زيمبابوي للمتلقي، مشيراً إلى أن كثافة خلية مرتفع جداً. التزاوج من فحوصات مع 101 زيمبابوي من المانحين و 106 أو 105 زيمبابوي للمستلم أدت إلى انخفاض عدد من آبار ترانسكونجوجانت-إيجابية (66 في المائة و 2.1 في المائة، على التوالي، الجدول 2). وهكذا، > 105 زيمبابوي للمتلقي كان من المتوقع أن تكون مطلوبة من أجل التزاوج مع خلية مانح واحد. وبالمثل، يمكننا إجراء فحوصات التزاوج مع pCAR1::التجارة والنقل في كثافات مختلفة من سلالات الجهات المانحة والمتلقية. النسب المئوية لآبار ترانسكونجوجانت-الإيجابية كانت أقل بكثير من تلك التي pBP136::التجارة والنقل (الجدول 2). وعلى افتراض أنه يمكن إرفاق الخلايا المتبرع والمتلقي ببعضها البعض وبالمثل، كان احتمال بدء التصريف للجهة المانحة pCAR1 أقل من ذلك للجهة المانحة pBP136. وبناء على هذه النتائج، قررنا أن 107 زيمبابوي للمستلم لازم لخلية واحدة من الجهات مانحة حسب الأصول.
ثم، أحصى عدد آبار ترانسكونجوجانت-إيجابية. النسبة المئوية لآبار ترانسكونجوجانت-إيجابية ل pBP136::التجارة والنقل وكان أكبر (1.9 في المائة) عن pCAR1::التجارة والنقل (< 0.052%؛ الجدول 2). وهكذا، كان هناك أكثر من اختلاف 36-fold في احتمال المانحة بدأت الاقتران بين هذه البلازميدات اثنين.
رقم 1. مقارنة الترددات الاقتران من pBP136::التجارة والنقل و pCAR1::التجارة والنقل مع 106 مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) مل-1 من الجهات المانحة (Pseudomonas putida الموصولة) والمتلقي (KT2440RGDP. putida ) في مختلف إثارة معدلات (0-600 لفة في الدقيقة)- أشرطة الخطأ حسبت على أساس حدود الثقة 95% بطريقة MPN والانحراف المعياري لزيمبابوى من الجهات المانحة والمتلقية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| السلالات البكتيرية | النمط الظاهري الوراثي وذات الصلة | مرجع أو مصدر |
| الإشريكيّة القولونية DH10B | و–، مكرى، Δ (احتياطي تخفيض معدل الوفيات-هسدرمس-مكربك)، Φ80d ΔM15لاكز، ΔlacX74، و دير، recA1، araD139، Δ (ارا لوي) 7697، جالو، جالك ، λ–، ربسل، endA1، نوبج | الحرارية |
| كولاي S17-1(λpir) | Tmr، خص، recA، ثي، برو، هسدر–م+، RP4: 2-Tc: Mu:7 كم Tn λpir | 18 |
| Putida بسيودوموانس KT2440 | كمs، جنرال موتورزsTcr ، ريفs | 25 |
| Putida بسيودوموانس KT2440(pCAR1) | PCAR1 إيواء KT2440 | 20 |
| Putida بسيودوموانس KT2440RGD | كمs، ريفr، جنرال موتورزr، Tcr، مينيتن7(جنرال موتورز) PA1/O4/o3 للدسريديكسبريس، إينسيتيد في كروموسوم | 10 |
| Putida بسيودوموانس الموصولة | السلالة مشتقة من KT2440 P. putida ، دابب-حذف، كمs، والآلية العالميةs، ريفr، Tcr، يتم إدراج ﻻسيq في كروموسوم | 21 |
| CA10RG ريسينوفورانس ص | كمs، غمآرحق ، ريفr | 6 |
| البلازميدات | ||
| pBP136 | يبلورون-1،فمن الغوغاء، MPFتي بلازميد | 17 |
| pBP136::بروتينات فلورية خضراء | pBP136 تحمل كمr و PA1/04/03-كاسيتبروتينات فلورية خضراء في الفقرة (26,137 nt) | 21 |
| pCAR1 | يبلورون-7،حمن الغوغاء، MPFو، كاربازولي بوليمرات بلازميد | 26، 27 |
| pCAR1::بروتينات فلورية خضراء | pCAR1 تحمل كمr و PA1/04/03-كاسيتبروتينات فلورية خضراء في ORF171 (182,625 nt) | 21 |
| pJBA28 | أ فبr، كمr، بلازميد التسليم ميني-تينيسي5كم-PA1/04/03-ربسيي-mut3التجارة والنقل*-T0-تي1 | 18 |
الجدول 1. السلالات البكتيرية ووالبلازميدات.
| بلازميد | أ الجهات المانحة | أ المستلم | عدد الآبار مع ترانسكونجوجانتس كل الآبار 96 | النسبة المئوية |
| [كفوس أو الخلية] | [كفوس] | [%] | ||
| pBP136::بروتينات فلورية خضراء | 103 | 107 | 96/96 | 100 |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 96/96 | 100 | ||
| 102 | 107 | 96/96 | 100 | |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 54/96 | 56 | ||
| 101 | 107 | 71/96 | 74 | |
| 106 | 63/96 | 66 | ||
| 105 | 2/96 | 2.1 | ||
| 1 | 107 | 23/1212 | 1.9 | |
| pCAR1::بروتينات فلورية خضراء | 103 | 107 | 6/96 | 6.3 |
| 106 | 6/96 | 6.3 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 102 | 107 | 1/96 | 1 | |
| 106 | 1/96 | 1 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 101 | 107 | 0/96 | 0 | |
| 106 | 0/96 | 0 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 1 | 107 | 1/1920 | < 0.052 |
الجدول 2. العدد الآبار، مع كثافة الخلية المختلفة، التي تحتوي على ترانسكونجوجانتس لمقارنة احتمال المانحة بدأت الاقتران بين pBP136::التجارة والنقل و pCAR1::التجارة والنقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن نقدم بروتوكول عالية الدقة للكشف عن الاختلافات في وتيرة التصريف تحت ظروف مختلفة، باستخدام أسلوب MPN لتقدير عدد ترانسكونجوجانتس. إحدى الخطوات الهامة في البروتوكول هو إضعاف الخليط من الجهات المانحة والمتلقية بعد التزاوج حتى لا ترانسكونجوجانتس تنمو. يتم إضافة خطوة أخرى تركيزات عالية من المضادات الحيوية إلى المتوسطة السائل الانتقائي لمنع المزيد من الاقتران. هذه الإجراءات يمكن أن تقلل من الخلفية الناجم عن تصريف المزيد في الأجلين المتوسط وانتقائية. ونحن يمكن بنجاح الكشف عن الاختلافات، حتى بعد مدة قصيرة التزاوج بين الجهات المانحة والمتلقية. يمكن تغيير تواتر كونجوجاتيفي المحسوبة بموجب هذا البروتوكول بالاختلافات الصغيرة في ظروف نمو سلالات الجهات المانحة والمتلقية. وهكذا، ينبغي أن تصمم هذه الشروط بعناية.
وباﻹضافة إلى ذلك، فإننا نقدم بروتوكولا لتقدير الخطوة الثانية من الاقتران باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لمانح الخلية الفرز. أن أهم خطوة في هذا البروتوكول هو تحديد كثافة مناسبة للخلايا المتلقية لخلية مانح واحد تم فرزها. عندما يكون عدد الخلايا المتلقية المحيطة بخلية مانح واحد اتصال كبيرة بما يكفي، والمادية بين البلدان المانحة والمتلقية من المؤكد. ثم تكرار الاقتران يمكن أن يتأثر، لا باحتمال كم الخلايا المتبرع والمتلقي الاتصال ببعضها البعض، بل باحتمال تصريف بدأت الجهات المانحة. فرز خلية مانح واحد بنظام مراقبة الأصول الميدانية ليست صعبة؛ ومع ذلك، الآبار 96 ليست دائماً كافية لتقدير الاحتمال. ولذلك، ينبغي إعداد لوحات 10-100. أحد الحدود للبروتوكول أنه من غير المناسب لقياس احتمال تصريف بلازميد بدأت الجهات المانحة بواسطتها التردد المنخفض.
ونحن استناداً إلى هذه الأساليب ونتائجها، ذكرت مؤخرا أن أظهر والبلازميدات اثنين ترددات مختلفة الاقتران في سائل الإعلام بتغيير معدلات التحريك، التي يمكن أن تؤثر على الخطوات الأولى والثالثة للتصريف والمرفقات ومفرزة من أزواج بين المانح والمتلقي. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أيضا الاختلافات في احتمال الخطوة الثانية10. وتبين هذه النتائج كيف يتغير تواتر التصريف تحت ظروف مختلفة. هذه البروتوكولات مفيدة لمقارنة ميزات اقتران والبلازميدات تحت ظروف مختلفة، بما في ذلك الظروف الهوائية أو اللاهوائية، مختلفة بين المانح والمتلقي أزواج، ودرجات الحرارة المختلفة أو درجة الحموضة، وفي وجود أو غياب محددة المواد الكيميائية، مثل الاتصالات، والمواد الغذائية، والمضادات الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور ك. كاماتشي من "المعهد الوطني للأمراض المعدية" (اليابان) لتوفير pBP136 والأستاذ الدكتور H. نجيري من جامعة طوكيو (اليابان) لتوفير pCAR1. ونحن ممتنون أيضا للأستاذ الدكتور مولين Sølen من "جامعة الدنمارك التقنية" لتقديم pJBA28. أيد هذا العمل كاكينهي JSPS (أرقام المنح 15 ح 05618 و 15KK0278) لمرض التصلب العصبي المتعدد (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/، https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
- Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F.
- Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
- Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
- Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
- Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
- Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
- Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).
- Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
- Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
- Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
- Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
- Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E.
- Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
- Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
- Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
- Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
- Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
- Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
- Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
- Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
- Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).
