Summary
为了了解不同条件下各种细菌结合 dna 元素的行为, 我们描述了一种检测共轭频率差异的协议, 具有较高的分辨率, 以估计供体细菌的效率启动共轭。
Abstract
细菌结合是通过共轭 dna 元素水平转移抗生素耐药基因的重要步骤。需要对不同条件下的共轭频率进行深入的比较, 以了解共轭元素在自然界中的传播情况。然而, 传统的比较共轭频率的方法不适合进行深入的比较, 因为选择性板上出现额外的共轭事件会导致高背景。我们成功地减少了背景, 引入了最可能的数字 (mpn) 方法和更高浓度的抗生素, 以防止进一步共轭在选择性液体介质。此外, 我们还开发了一个协议, 通过荧光激活细胞分选 (facs) 将单个供体细胞分化为受体池, 估计供体细胞启动共轭的概率。利用 pbp136 和 pcar1 这两种质粒, 可以在不同搅拌速率的液体介质中检测到假单胞菌细胞的共轭频率差异。pbp136 的共轭起始频率高于 pcar1。利用这些结果, 我们可以更好地了解这两个质粒中的共轭特征。
Introduction
流动遗传元素的细菌结合、共轭质粒以及整合和共轭元素 (ice) 对于遗传信息的水平传播具有重要意义。它能促进细菌的快速进化和适应, 传递耐多药基因1,2。共轭频率可能会受到蛋白质编码的共轭元素动员 dna (mob) 和交配对形成 (mpf), 包括性别皮利, 这是根据 mob 和 mpf 类型3,4分类, 5。它也可能受到供体和受体对6以及细胞7、8、9、10、11、12 (生长速率、细胞密度、固体表面或液体介质、温度、养分供应和阳离子的存在)。为了了解共轭元素是如何在细菌中传播的, 有必要对共轭频率进行详细的比较。
交配后供体和受者对之间的共轭频率通常用常规方法估计如下。(一) 首先, 计算捐助者和受援群体的数目;(ii) 然后, 接受共轭元素的接受的殖民地 (= 跨康尼加人) 计数;(iii) 最后, 共轭频率是通过将异位形成单位 (cfu) 除以供体和/或接受者13的菌落形成单位 (cfu) 来计算的。但是, 在使用此方法时, 背景较高, 因为在细胞密度较高时, 用于获取跨共的选择性板上也可能发生额外的共轭事件。因此, 很难检测到频率上的微小差异 (低于10倍差异)。我们最近介绍了一种最可能的数字 (mpn) 方法, 使用含有较高浓度抗生素的液体介质。该方法通过抑制选择性介质中的进一步共轭来减小背景;因此, 可以用更高的分辨率来估计共轭频率。
共轭可分为三个步骤: (1) 受赠方-收件人对的附件 (2) 共轭转移的起始, (3) 对14的离解.在步骤 (1) 和 (3) 中, 供体和接收细胞之间存在物理相互作用;因此, 细胞密度和环境条件会影响这些步骤, 尽管性毛的特征也很重要。步骤 (2) 可能是由参与共轭的几个基因的表达来调节的, 这些基因可能会受到质粒、供体和受体的各种特征的影响。虽然可以使用细胞作为粒子的估计进行物理模拟, 但应该对步骤 (2) 的频率进行实验测量。有一些报告直接观察如何直接观察相比, 多久可以启动共轭 [步骤 (2)] 使用荧光显微镜15,16;但是, 这些方法不是高吞吐量, 因为必须监视大量的单元。因此, 我们开发了一种利用荧光活化细胞分选 (facs) 估计步骤 (2) 发生概率的新方法。我们的方法可以应用于任何质粒, 而无需识别共轭的基本基因。
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Protocol
1. 使用绿色荧光蛋白 (gfp) 和卡那霉素耐药基因标记质粒制备供体
- 标记基因在靶粒 pbp136 中的引入
请注意:此协议的目标是生成 pbp136::gfp。本研究中使用的细菌菌株和质粒见表 1。- 在无菌 luria 肉汤 (lb) 和大肠杆菌s17-1 pir 18 中培养含有 pbp136 17 的大肠杆菌 hbp136 17 [含有抗卡霉素 ( km) 基因和 gfp)突变 3 * 基因及其启动子和终止剂在一个迷你 tn5] 在 5 ml 的不育 lb 包含 50μgml km 在37°c 过夜 (oe-n, 16-24h) 与晃动在200转每分钟 (rpm)。
- 收获和洗涤
- 收获每种培养物的1毫升, 将其放入2毫升微管和离心机 (10, 000xg , 室温, 2分钟)。然后, 丢弃上清液, 在2毫升无菌磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中重新悬浮细胞颗粒。
- 再次离心 (10, 000xg, 室温, 2分钟), 并在500μl 无菌 pbs 中重新悬浮.
- 滤清器配合
- 准备无菌 lb 板 (琼脂 1.6%), 并在其上放置一个0.22μm 孔径膜过滤器。将5500μl 的大肠杆菌s17-1 pir 与 hba28 的大肠杆菌DH10B 混合, 并在 lb 板上的过滤器上发现混合物。在30°c 下培育 on 板。从 lb 板上取下过滤器, 将其放入无菌的50毫升塑料管中, 并加入1毫升无菌 pbs。
注: pjba28 可以在存在的 ii. 蛋白存在的情况下复制, 由pir基因18编码, 并可从 s17-1 pir 转移到 dh10b。pbp136 没有标记基因17 , 可以从 dh10b 转移到 s17-1 pir。因此, 在这一阶段, 我们无法区分隐藏 pbp136 和 pjba28 的 s17-1 pir 和 pjba28 与 hd10b 窝藏 pbp136 和迷你 tn5 (转换到染色体或 pbp136)。然后, 我们在后续步骤中使用它们的混合物作为供体 (1.1.4.-1.1.5)。
- 准备无菌 lb 板 (琼脂 1.6%), 并在其上放置一个0.22μm 孔径膜过滤器。将5500μl 的大肠杆菌s17-1 pir 与 hba28 的大肠杆菌DH10B 混合, 并在 lb 板上的过滤器上发现混合物。在30°c 下培育 on 板。从 lb 板上取下过滤器, 将其放入无菌的50毫升塑料管中, 并加入1毫升无菌 pbs。
- 在37°c 含有 50μgml km 的无菌 lb 中培养上述配种混合物的 obe 培养物, 在 200 rpm 处晃动, 并培养假单胞菌 putida kt2440 [对 km 敏感 (km), 利福平敏感 (rif s),在含有 12μgml tc的介质中, 在200转/分时晃动,对庆大霉素敏感 (gm s) 和四环素耐药 (tc r)]。
- 在1.1.2 步骤中收获和清洗细胞后, 使用它们 (配合混合物和 kt2440) 进行过滤器配合 (o n, 30°c), 1.1.3 步骤。
- 制备含有50μgml 公里和 12.5μgml tc (lb + km + tc 板) 的无菌 lb 板。
- 用无菌 pbs (10 1-105倍)稀释膜过滤器上的重新悬浮混合物, 然后将每次稀释物扩散到 lb + km + tc 板上, 并在30°c 下孵育板2-3d。
- 从板材中挑选菌落, 在含有 km 和 tc 以及p的无菌 lb 中生长一个 obe 培养物。雷西诺沃兰ca10dm4rg (rif r 和 gmr)6在无菌 lb 中含有 rif (25μgml) 和 gm (30μg/ml), 在30°c 和 200 rpm。
请注意:如上一注所述, lb + km + tc 板 (来自 1.1.7) 上的殖民地可能是 kt2440 窝藏 pbp136, 携带一个小型 tn5和 kt2440, 带有一个小型 tn 5, 因为 pBP136 可以直接从 s17-1 pir 转移拥有 pbp136 和 pBP136 至 kt2440。这就是为什么在以下步骤中需要与雷西诺瓦尔ca10rg 进行另一次交配才能获得目标 pbp136, 并执行以下步骤。 - 在1.1.2 的步骤中收获和清洗细胞后, 使用它们进行滤池交配 (on, 30°c), 1.1.3。
- 准备含有 rif、gm 和 km (lb + rif + km + gm 板) 的无菌 lb 板。
- 将混合物重新放在过滤器上, 然后将其稀释 10 1-105倍,将其铺在 lb + rif + km + gm 板上, 并在30°c 下孵育 2-3 d。
- 选择菌落, 并检查他们是否窝藏 pbp136 通过 pcr 使用特定引物的质粒。
- 在靶质粒 pcar1 中引入选择性标记基因
注意: 此协议的目标是生成 pcar1::gfp- 在 200 rpm 和30°c 和大肠杆菌 s17-1 和大肠杆菌 s17-1 pir 18 的无菌 lb l1 中生长一个o/培养物. 在200转/分和37°c 时含有50μgml 公里。
- 在1.1.2 的步骤中收获和清洗细胞后, 使用它们进行滤池交配 (on, 30°c), 1.1.3。
- 从 lb 板上取下过滤器, 将其放入无菌的50毫升塑料管中, 并加入1毫升无菌 pbs。
- 用无菌 pbs (10 1-105倍)稀释重新悬浮的混合物, 并将稀释后的混合物涂在无菌选择性 lb + tc + km 板上。
注: pcar1 不在大肠杆菌中复制;因此, p. putida kt2440 窝藏 pcar1 与迷你 tn5可以选择 lb + tc + 公里板。 - 从盘子中选择一个菌落, 在含有 km 和 tc 的无菌 lb 中生长一个 obe 培养物和p 培养。雷西诺沃兰ca10dm4rg 在不育 lb 含有 rif 和 gm (200 转/分, 30°c)。
- 在步骤1.1.2 收获和洗涤后, 使用滤池配合的细胞 (on, 30°c), 1.1.3。
- 将混合物重新用于滤清器上, 然后将其稀释, 扩散到 lb + rif + km + gm 板上, 并在30°c 下孵育 2–3 d。
- 选择菌落, 并检查他们是否窝藏 pcar1 的 pCAR1 与特定引物的质粒。
- 确认加带质粒的可转移性, 并为供体下一步做好准备
注: 本协议的目标是确认上述构造质粒的可转移性, 并为捐献者下一步做好准备。- 种植具有 pbp136 的 p. resinovorans ca10dm4rg 的 on 培养物::gfp或 pcar1: gfp 或 pcar1: 含有 km 的无菌 lb 中的 gfp [km, gm s, rif r, tc r, laci q, 其中 pa1/o4/o3-gfpmut3* 由于其染色体laciq 基因]21在含有 tc 的 lb 3 ml (200 转/分, 30°c) 中没有表达.
- 在1.1.2 的步骤中收获和清洗细胞后, 使用它们进行滤池交配 (on, 30°c), 1.1.3。
- 将过滤器放入无菌的50毫升塑料管中, 用1毫升无菌 pbs 重新悬浮。用无菌 pbs (10 1-105倍)稀释重新悬浮的混合物, 将稀释后的混合物涂在无菌选择性 lb + tc + km 板上。
- 选择菌落, 并检查它们是否通过 pcr 与特定引物的 pcr 保存每个质粒。
请注意:质粒提取后通过直接测序确认微型 tn5的插入位置是可选的, 以确认插入不会影响质粒的传递函数。
2. 用 mpn 方法计算共轭频率
- 准备无菌 lb + km 和 lb + gm 板。
- 种植具有 pbp136 的 p. putida smdbs 的 on 培养物::gfp或 pcar1:: gfp 在 3 ml 的不育 lb 包含 km 和培养 p. putida kt2440rgd (gm r, rifr) 在 3 ml 的 lb 包含 gm (140 rpm, 30°c).
- 在1.1.2 步骤中收获和清洗细胞后, 使用它们在30°c 下进行过滤交配 45分钟, 1.1.3 步骤。
- 在串行稀释上述供体和受体培养 (101-10 7), 并将其扩散到 lb + km (供体) 或 lb + gm (接收者) 板 (每片一式), 以计算菌落形成单位 (cfu)。在30°c 下将板材培育2度。
- 在含有 km 和 gm 的无菌 lb 中重新填充过滤器上的混合物, 并使用96孔细胞培养板 (四式一片) 连续稀释 (从 2 1 到 2 24–107.2)。
- 在适当的时间 (30°c 时2度) 对96孔板进行孵化。
- 计算板材上捐献者和受者的 cfu 数 (第2.4 步), 并计算出变形金刚生长的井的数量。
- 利用贾维斯等人开发的 mpn 计算程序计算 mpn 及其偏差。2 2日, 可在 http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls。
- 输入实验的名称 (例如, "测试")、实验日期 (例如, 2018/9)、测试系列的数量和最大值。大声 笑在 excel 文件 ("#7) 的" 程序 "工作表的行 MPN_ver5.xls' 中输入稀释 (输入" 24 ")。
- 在 "稀释系数 d " 列中输入 "2-1 (= 0.5) 到 2-24 (= 5.96x10-8)", 在 "体积" 中输入 "0.01" (毫升或克w '列中的 "0.01", 在 "否" 中输入 "4". 管 n ' 在自动生成的表 ' 输入数据 '。
- 输入在每次样品稀释 (0-4) 时, 变形金刚生长的井的数量。
- 按右上角的 "计算结果" 按钮, 然后获得结果 (mpnμμl) 及其95% 的置信区间 (下和上位)。
- 通过将转移体 (mpn/2) 的数量除以供体和受体细胞 (cfu/ml) 的数量来计算质粒的共轭频率。
3. 供者引发共轭概率估计的准备
- 培养 p 的奥伊文化. putida smdbs 窝藏 pbp136:: gfp 或 pcar1:: gfp中 3 毫升的不育 lb 含有 km 和p. putida kt2440rgd (gmr,rifr) 培养 3 ml 的不育 lb 含有 300 ml gl烧瓶 (140 转/分, 30°c)。
- 将预培养的200μl 转移到200毫升的新鲜无菌 lb 中, 其中包含 km 或 gm, 在500毫升的烧瓶中, 在30°c 下孵育, 在140转/分的情况下晃动。
- 使用 uv-vis 分光光度计测量培养物600纳米 (od600) 处的浊度, 并在 lb (101-108倍稀释剂) 中稀释, 将培养物插入含有 km 或 gm 的 lb 板上, 以便在30°c 下将这些 lb 板培养为 1–2 d, 并确定 cfu。
- 绘制 od600值和 cfu 的生长时间, 以生成捐献者和受赠方的生长曲线。
- 根据生长曲线, 将捐献者和受者的培养培养到日志中期阶段。
- 收获和洗涤细胞后, 在 10μl lb 和 10 5-10 7 接受者在 100μl lb 中制备捐献者的 10 1-103 cfu。
- 在96孔板板中, 以不同密度混合捐献者的10μl 和不同密度的接受培养物 100μl (一式三份)。例如, 将捐献者的 101 台 cfu和接受者的 10台5台cfu 混合在一起, 并将其添加到96口井中的每口井中, 将捐献者的 101 cfu和接受者的 10至 6 cfu混合在另一个96孔板中, 依此类推。
- 将混合物在30°c 下培养 45分钟, 然后在每口井中加入高浓度的抗生素 (100μgml km 和 60μgml gm), 以抑制进一步的共轭。
- 在30°c 下将板材培育2度。
- 数一数变形金刚生长的井的数量。
- 根据上述数据选择适合于估计供者发起的共轭概率的接收者密度 (应在96孔板的至少1井中找到跨孔物)。
请注意:当供体和受体细胞的密度较高, 并且井中发生多个共轭时, 所有井中都会有变形金刚生长。相反, 当细胞密度太低时, 任何井都不会发现转基因体。在下一节中, 将单个供体细胞分类为一口井。因此, 接收方密度应达到最大值。
4. 捐助者发起的共轭概率的估计
- 准备200毫升的中对数阶段培养的供体p. putida smdbs 窝藏 pbp136::gfp或 pcar1:: gfp和受赠方p. putida kt2440rgd, 如3.6-3.7 所述。
- 在 96孔板的每口井中, 将接受者的 10 6 cfu 放入 100μl lb 中。
- 设置流式细胞仪系统 (流式细胞仪和细胞分选器与机器人手臂, 488 纳米氩激光器, 和70μm 喷嘴孔)。设置为正向散射 (fsc), 以1% 的阈值作为采集触发器。在最大灵敏度下调整 fsc 和侧向散射 (ssc) 的 h 增益和 a 增益, 这可以排除假阳性信号, 使用 pbs 作为负控制。设置基于 fsc 和 ssc 的排序门和0.5 下降排序模式, 以实现最大排序纯度。
- 用 facs 对单个供体细胞进行 lb 板 (384个不同斑点) 的分类, 在30°c 下孵育 2 d 的细胞, 然后计算有多少菌落出现在被分类的细胞的板上。
请注意:此过程用于验证设置的门。如果盘子上有384个菌落, 这意味着100% 的分类细胞可能形成菌落。排序的平均有效性始终为90–95%。 - 用 facs 对单个供体细胞进行分类, 使其与受者 (4.2) 一起进入96孔板的每一口井。
- 在30°c 下将板材加氢 45分钟, 然后在每口井中加入高浓度的抗生素 (100μgml km 和 60μgml gm), 以防止进一步的共轭。
- 在30°c 下将板材培育2度。
- 用肉眼的目视检查确定的变形金刚生长的井的数量。
- 计算供者发起共轭的概率, 方法是将具有变形金刚的井数除以供体排序的井的总数。
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Representative Results
mpn 方法的共轭频率比较
在我们的前一份报告中, 我们比较了 pbp136 的共轭频率:: gfp和 pcar1:: gfp 在三重稀释 lb (半 lb) 液体介质中使用 125 ml 旋转器闪光灯进行45分钟的配合后, 要求10.我们比较了 pbp136 的共轭频率:: gfp和 pcar1:: gfp 与 106 cpuml供体和受赠者菌株在不同搅拌条件下 (0-600 转/分).两个质粒的共轭频率在较高的搅拌速率下增加, pbp136 的共轭频率最大差异为 lt;10 倍:: gfp (0 到 400 rpm), 而 pcar1:gfp 的共轭频率约 25倍 (在0之间 )和200转/分;图 1)。
捐助者发起的共轭概率的估计
以前估计的供者发起的共轭概率见表 2。为了确定比较共轭概率所需的受体细胞密度, 在不同的供体和受者密度下进行了交配检测。如表 2所示, pbp136: 在含有 10 3个捐献者 cfu 和 10 5-10 7受赠者 cfu 的井中检测到 100% (96/96),以及捐献者 10 2 cfu 和 10-10 7 的井 中检测到 gfp 跨异聚体。受者的 cfu, 表明细胞密度过高。对捐献者的 101 台cfu 和 10例6或 10 5 方受者 cfu 进行的配合检测导致跨孔阳性井的数量减少 (分别为66% 和 2.1%,表 2). 因此, gt;105受赠方的 cfu 预计需要与一个单一的供体细胞交配。同样, 我们与 pcar1 进行了配对检测:gfp在不同的捐献者和受者菌株的密度。跨康黄酮阳性井的百分比远远低于 pbp136:: gfp (表 2)。假设供体和受体细胞可以相似地相互附着, pcar1 供体的共轭起始概率低于 pbp136 供体的发生率。根据这些结果, 我们确定, 由外地资产管制系统排序的单个供体细胞需要 107个受者 cfu。
然后, 对跨康尼正井的数量进行了统计。pbp136 的跨康黄酮阳性井的百分比:gfp大于 pcar1 的百分比 (1.9%)::gfp (& lt;0.052%;表 2)。因此, 这两个质粒之间在供者发起的共轭概率上有超过36倍的差异。
图1。pbp136 共轭频率的比较:: gfp 和 pcar1:: gfp与 10个6个菌落形成单位 (cfu) ml-1 的捐献者 (假单胞菌 putida smdbs) 和接受者 (p. putida kt2440rgd) 在不同的搅拌速率 (0-600 转/分).误差线是基于95% 的置信度极限的 mpn 方法和供者和受者的 cfu 标准偏差计算的。请点击这里查看此图的较大版本.
| 菌株 | 基因型和相关表型 | 参考或来源 |
| 大肠杆菌dh10b | f–mcra, (mr-hdrms-mcrbc), 80d laczm15, lacx74, deor , reca1, arad139, (ara leu) 7697, galu, galU ,-, rpsl, enda1, nupg | 热 |
| 大肠杆菌S17-(pir) | tmr, smr, reca, thi, pro,hsdr-m +, rp4:2-tc/km tn7 pir | 18 |
| 假单胞菌kt2440 | 公里,ifs, gm s, tcr | 25 |
| 假单胞菌KT2440(pCAR1) | kt2440 窝藏 pcar1 | 20 |
| 假单胞菌kt2440rgd | 公里, rifr,gm r, tcr,mintn 7 (gm) p anogo-o3 DsRedExpress-a 被注入染色体 | 10 |
| 假单胞菌smdbs | 在染色体中插入 p因此tida kt2440、 dapb删除、km、gms、rifr、tc r、 laciq的衍生物菌株 | 21 |
| ca10rg | 公里,rifr,gmr,tc s | 6 |
| 质 粒 | ||
| pbp136 | 包括 1, mobp,强积金 t 质粒 | 17 |
| pbp136::gfp | pbp136 携带 km r 和 paiet003-gfp盒式磁带 (26, 137 nt) | 21 |
| pcar1 | 包括第7, mob h, 强积金f, 卡巴唑降解质粒 | 26, 27 |
| pcar1::gfp | 携带 rkm r 和 paet0403-gfp盒式磁带的 pCAR1 在 gfp (18, 625 nt) | 21 |
| pjba28 | apr, kmr, 小型 tn-Km-Patem04分/rbsii-gfp互突变体*-t 0-t 1 | 18 |
表1。细菌菌株和质粒。
| 质 粒 | a供 | a收件人 | 每96口井具有变形金刚的井的数量 | 百分比 |
| [cfu 或细胞] | [cfu] | [%] | ||
| pbp136::gfp | 103 | 107 | 96/96 | 100元 |
| 106 | 96/96 | 100元 | ||
| 105 | 96/96 | 100元 | ||
| 102 | 107 | 96/96 | 100元 | |
| 106 | 96/96 | 100元 | ||
| 105 | 54/96 | 56 | ||
| 101 | 107 | 71/96 | 74 | |
| 106 | 63/96 | 66 | ||
| 105 | (2/96) | 2。1 | ||
| 1 | 107 | 23/1212 | 1。9 | |
| pcar1::gfp | 103 | 107 | 6/96 | 6。3 |
| 106 | 6/96 | 6。3 | ||
| 105 | 上午96 | 0 | ||
| 102 | 107 | 半96 | 1 | |
| 106 | 半96 | 1 | ||
| 105 | 上午96 | 0 | ||
| 101 | 107 | 上午96 | 0 | |
| 106 | 上午96 | 0 | ||
| 105 | 上午96 | 0 | ||
| 1 | 107 | 半1920 | < 0.052 |
表2。不同细胞密度的井的数量, 包含跨康主, 以比较捐助者发起的共轭的概率之间的 pbp136:: gfp 和 pcar1:: gfp .
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Discussion
在这里, 我们提出了一个高分辨率的协议, 用于检测不同条件下的共轭频率的差异, 使用 mpn 方法来估计跨子的数量。该协议中的一个重要步骤是在交配后稀释捐献者和受赠者的混合物, 直到没有转基因生物生长。另一个步骤是在选择性液体培养基中添加高浓度的抗生素, 以防止进一步的共轭。这些程序可以减少选择性介质中进一步共轭所造成的背景。我们可以成功地检测差异, 即使在捐献者和接受者之间的交配时间很短之后也是如此。该协议计算的共轭频率可以通过供体和受者菌株生长条件的微小差异而改变。因此, 这些条件应仔细设计。
此外, 我们还提出了一种利用流式细胞仪进行单供体细胞分选的协议, 用于估计共轭的第二步。该协议中最重要的一步是确定排序的单个供体细胞的接收单元的适当密度。当单个供体细胞周围的受体细胞数量足够大时, 供体和受体细胞之间的物理接触是肯定的。然后, 共轭频率可能会受到影响, 不是因为供体和受体细胞相互接触的频率, 而是受体之间的共轭概率。通过流式细胞仪对单个供体细胞进行分类并不困难;然而, 96 口井并不总是足以估计概率。因此, 应准备10-100 个板材。该协议的局限性之一是, 它不适合测量由不能启动的具有低频透射性的质粒共轭的概率。
根据这些方法及其结果, 我们最近报道说, 两个质粒通过改变搅拌速率在液体介质中表现出不同的共轭频率, 这可能会影响共轭、附着和分离的第一和第三步。捐助方-收件人对。此外, 我们还发现了第二步10的概率差异。这些结果说明了共轭频率在不同条件下的变化。这些协议可用于比较质粒在各种条件下的共轭特征, 包括有氧或厌氧条件、不同的受赠者对、不同的温度或 ph 值, 以及在存在或不存在特定条件的情况下化学物质, 如阳离子、营养物质和抗生素。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢国家传染病研究所 (日本) 的 k. kamachi 博士提供 pbp136, 并感谢东京大学 (日本) h. nojiri 教授提供 pcar1。我们还感谢丹麦技术大学的莫林·索伦教授提供 pjba28。这项工作得到了 jps kakenhi (赠款编号15h05618 和 15H05618) 至 ms (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
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