Summary
Med formålet at forstå adfærd af forskellige bakterielle konjugering DNA elementer under forskellige forhold, vi beskriver en protokol til påvisning af forskelle i konjugation frekvens, med høj opløsning, til at vurdere, hvor effektivt donor bakterie initierer konjugering.
Abstract
Bakteriel konjugering er et vigtigt skridt i horisontal overførsel af antibiotikaresistensgener via en konjugering DNA element. Dybdegående sammenligninger af konjugation hyppighed under forskellige betingelser er forpligtet til at forstå, hvordan elementet konjugering spredes i naturen. Men konventionelle metoder til at sammenligne konjugation frekvens er ikke passende for dybdegående sammenligninger på grund af den høje baggrund forårsaget af forekomst af yderligere konjugation begivenheder på den udvalgte plade. Vi reduceret med succes baggrunden ved at indføre en mest sandsynlige tal (MPN) metode og en højere koncentration af antibiotika for at forhindre yderligere konjugation i selektiv flydende medium. Derudover udviklede vi en protokol til estimering af sandsynligheden for, hvordan ofte donor celler indlede konjugation af sortering enkeltdonor celler i modtagerens puljer af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS). Bruger to plasmider, kunne pBP136 og pCAR1, forskelle i konjugation frekvens i Pseudomonas putida celler påvises i flydende substrat til forskellige omrøring priser. Hyppigheden af konjugation indledningen var højere for pBP136 end for pCAR1. Ved hjælp af disse resultater, kan vi bedre forstå konjugation egenskaber i disse to plasmider.
Introduction
Bakteriel konjugation af mobile genetiske elementer, konjugering plasmider og Integrativ og konjugering elementer (ICEs) er vigtigt for den horisontale spredning af genetisk information. Det kan fremme hurtig bakteriel evolution og tilpasning og overføre multidrug resistance gener1,2. Konjugation frekvens kan blive påvirket af proteiner kodet på konjugering elementer til mobilisering af DNA (MOB) og parring par dannelse (MPF), herunder sex pili, der er klassificeret efter MOB og MPF type3,4, 5. Det kan også blive påvirket af donor og recipient par6 og celler7,8,9,10,11,12 (vækstbetingelser vækstrate, celle tæthed, fast overflade eller flydende medium, temperatur, næringsstoftilgængelighed og tilstedeværelsen af kationer). For at forstå hvordan de konjugering elementer spredt blandt bakterier, er det nødvendigt at sammenligne konjugation frekvens i detaljer.
Konjugation frekvens mellem donor og recipient par efter parring er normalt anslået af konventionelle metoder som følger. a først, tælles antallet af donor og recipient kolonier; (ii) derefter, modtageren kolonierne, som modtog de konjugering elementer (= transconjugants) tælles; (iii) og endelig konjugation hyppighed beregnes ved at dividere de kolonidannende enheder (CFU) af transconjugants af dem, donor og/eller modtageren13. Men når du bruger denne metode, baggrunden er høj på grund af yderligere konjugation begivenheder, der kan også opstå på de selektive plader anvendes til at opnå transconjugants, når celle tæthed er høj10. Derfor er det vanskeligt at opdage små forskelle i frekvens (under en 10-fold forskel). Vi har for nylig indført en mest sandsynlige tal (MPN) metode ved hjælp af flydende medium, der indeholder en højere koncentration af antibiotika. Denne metode reduceret baggrunden ved at hæmme yderligere konjugation i selektivt medie; således kan konjugation hyppigheden anslås med højere opløsning.
Konjugation kan opdeles i tre trin: (1) fastgørelse af donor-modtager par (2) indledning af konjugering overførsel, og (3) dissociation af par14. Under trin (1) og (3) er der fysisk interaktion mellem donor og recipient celler; således kan celle tæthed og de miljømæssige forhold påvirke disse trin, selv om funktionerne i sex-pili er også vigtige. Trin (2) er sandsynligvis reguleret ved ekspression af flere gener involveret i konjugation som svar på eksterne ændringer, som kunne påvirkes af forskellige funktioner i plasmid, donor og recipient. Selv om fysisk beslaglæggelse eller udstationering af donor-modtager par kan matematisk simuleres ved hjælp af en vurdering af celler som partikler, bør hyppigheden af trin (2) måles eksperimentelt. Der har været nogle rapporter om direkte observationer af hvordan ofte donorer kan indlede konjugation [trin (2)] ved hjælp af Fluorescens mikroskopi15,16; men disse metoder er ikke høj overførselshastighed, fordi et stort antal celler skal overvåges. Derfor, har vi udviklet en ny metode til at vurdere sandsynligheden for forekomst af trin (2) ved hjælp af fluorescens aktiveret celle sortering (FACS). Vores metode kan anvendes på enhver plasmid, uden identifikation af væsentlige gener for konjugering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af en Donor med grøn fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis)- og Kanamycin resistens gen-Tagged plasmider
- Indførelsen af markørgener i target plasmidet pBP136
Bemærk: Målet med denne protokol er at generere pBP136::normal god landbrugspraksis. Bakterielle stammer og plasmider anvendes i denne undersøgelse er angivet i tabel 1.- Vokse kulturer af Escherichia coli DH10B husly pBP13617 i 5 mL sterilt Luria bouillon (LB) og E. coli S17-1λpir18 husly pJBA2819 [indeholdende en kanamycin (Km)-resistens gen og normal god landbrugspraksis mut3 * gen med dens promotoren og i en mini-Tn5] i 5 mL sterilt LB indeholdende 50 μg/mL Km ved 37 ° C natten over (O/N, 16-24 h) med rysten på 200 omdrejninger pr. minut (rpm).
- Høst og vask
- Høste 1 mL af hver kultur, læg det i en 2 mL microtube, og der centrifugeres (10.000 × g, stuetemperatur, 2 min). Derefter supernatanten og resuspenderes celle i 2 mL sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Centrifuge igen (10.000 × g, stuetemperatur, 2 min), og resuspend i 500 μl sterilt PBS.
- Filtrer parring
- Forberede sterile LB plader (med 1,6% agar), og placere en steril 0,22 μm pore størrelse membranfilter på den. Mix 500 μL af E. coli S17-1λpir husly pJBA28 med E. coli DH10B husly pBP136 og stedet blandingen på filter på LB-tallerkenen. Inkuber plade O/N på 30 ° C. Fjern filter fra LB-tallerkenen og læg det i en steril 50 mL plastikrør tilsættes 1 mL steril PBS.
Bemærk: pJBA28 kan replikere i overværelse af Π protein, kodet af pir gen18, og kan overføres fra S17-1λpir til DH10B. pBP136 bærer ingen markør gen17 og kan overføres fra DH10B til S17-1λpir. Derfor kunne vi ikke skelne S17-1λpir husly pBP136 og pJBA28 fra DH10B husly pBP136 og mini-Tn5 (omsat til kromosom eller pBP136) på nuværende tidspunkt. Derefter, vi brugte blandinger af dem som donorer i efterfølgende trin (1.1.4.–1.1.5.).
- Forberede sterile LB plader (med 1,6% agar), og placere en steril 0,22 μm pore størrelse membranfilter på den. Mix 500 μL af E. coli S17-1λpir husly pJBA28 med E. coli DH10B husly pBP136 og stedet blandingen på filter på LB-tallerkenen. Inkuber plade O/N på 30 ° C. Fjern filter fra LB-tallerkenen og læg det i en steril 50 mL plastikrør tilsættes 1 mL steril PBS.
- Vokse en O/N kultur af ovennævnte parring blanding i sterile LB indeholdende 50 μg/mL Km ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm og en kultur af Pseudomonas putida KT2440 [Km-følsomme (Kms), rifampicin-følsomme (Rifs), gentamicin-følsomme (Gms) og tetracyklin resistente (Tcr)] i medium indeholdende 12,5 μg/mL Tc ved 30 ° C under omrystning på 200 rpm.
- Efter høst og vask celler som trin 1.1.2, skal du bruge dem (den parring blandingen og KT2440) til filter parring (O/N, 30 ° C) som i trin 1.1.3.
- Forberede sterile LB plader der indeholder 50 μg/mL Km og 12,5 μg/mL Tc (LB + Km + Tc plader).
- Fortynd den resuspenderede blanding på membranfilter med steril PBS (101– 105-fold), og derefter spredes hver fortynding på LB + Km + Tc plader og inkuberes plader ved 30 ° C i 2-3 d.
- Pick kolonier fra pladerne, vokse en O/N kultur i steril LB indeholdende Km samt Tc og Pedersen. resinovorans CA10dm4RG (RifRasmussen og Gmr)6 i sterile LB indeholdende Rif (25 μg/mL) og Gm (30 μg/mL) ved 30 ° C og 200 rpm.
Bemærk: Som beskrevet i den tidligere note, kolonier på LB + Km + Tc plader (fra 1.1.7.) kan være KT2440 husly pBP136 bærer en mini-Tn5 og KT2440 med en mini-Tn5, fordi pJBA28 kan overføres direkte fra S17-1λpir husly pBP136 og pJBA28 til KT2440. Det er derfor en anden parring med P. resinovorans CA10RG er nødvendig for at opnå målet pBP136 med en mini-Tn5 i følgende trin. - Efter høst og vask celler som trin 1.1.2, skal du bruge dem til filter parring (O/N, 30 ° C) som i trin 1.1.3.
- Forberede sterile LB plader der indeholder Rif, Gm og Km (LB + Rif + Km + Gm plader).
- Resuspend blandingen på filteret og derefter fortynde det 101– 105-fold, sprede det på LB + Rif + Km + Gm plader og inkuberes plader til 2 – 3 d ved 30 ° C.
- Vælge kolonierne og kontrollere, hvis de havnen pBP136 af PCR ved hjælp af specifikke primere for plasmidet.
- Indførelsen af en selektiv markørgen i target plasmidet pCAR1
Bemærk: Målet med denne protokol er at generere pCAR1::normal god landbrugspraksis- Vokse en O/N kultur af P. putida KT2440 husly pCAR1 (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 på 200 rpm og 30 ° C og E. coli S17-1λpir18 husly pJBA28 i 5 mL sterilt LB der indeholder 50 μg/mL Km på 200 rpm og 37 ° C.
- Efter høst og vask celler som trin 1.1.2, skal du bruge dem til filter parring (O/N, 30 ° C) som i trin 1.1.3.
- Fjern filter fra LB-tallerkenen og læg det i en steril 50 mL plastikrør tilsættes 1 mL steril PBS.
- Fortynd den resuspenderede blanding med steril PBS (101– 105-fold), og sprede den fortyndede blanding på sterile selektiv LB + Tc + Km plader.
Bemærk: pCAR1 ikke replikerer i E. coli; således, P. putida KT2440 husly pCAR1 med en mini-Tn5 kan vælges på LB + Tc + Km plader. - Vælge en koloni fra pladen, og vokse en O/N kultur i steril LB indeholdende Km og Tc og en kultur med P. resinovorans CA10dm4RG i sterilt LB indeholdende Rif og Gm (200 rpm, 30 ° C).
- Efter høst og vask som i trin 1.1.2, skal du bruge cellerne for filter parring (O/N, 30 ° C) som i trin 1.1.3.
- Resuspend blandingen på filteret og derefter fortynde det, spredes på LB + Rif + Km + Gm plader og inkuberes plader til 2 – 3 d ved 30 ° C.
- Vælge kolonierne og kontrollere, hvis de havnen pCAR1 af PCR med specifikke primere for plasmidet.
- Bekræfte overførsel af markeret plasmider og forberede de næste skridt donorerne
Bemærk: Målet med denne protokol er at bekræfte overførslen af de ovenfor beregnede plasmider og forberede de næste skridt donorerne.- Vokse en O/N kultur af P. resinovorans CA10dm4RG husly pBP136::normal god landbrugspraksis eller pCAR1::normal god landbrugspraksis i sterile LB indeholdende Km og en kultur af P. putida SMDBS [KmsGms, RifRasmussen, Tcr, Lund q, i hvilken PA1/O4/O3-gfpmut3* udtrykkes ikke på grund af den kromosomale lacIq gen]21 i 3 mL af LB indeholdende Tc (200 rpm, 30 ° C).
- Efter høst og vask celler som trin 1.1.2, skal du bruge dem til filter parring (O/N, 30 ° C) som i trin 1.1.3.
- Placer filteret i en steril 50 mL plastikrør, og pelleten med 1 mL steril PBS. Fortynd den resuspenderede blanding med steril PBS (101– 105-fold), sprede den fortyndede blanding på sterile selektiv LB + Tc + Km plader.
- Vælge kolonierne og kontrollere, hvis de havnen hver af plasmider ved PCR med specifikke primere.
Bemærk: Bekræftelse af positionen indsættelse af mini-Tn5 af direkte sekventering efter plasmid ekstraktion er valgfri, at bekræfte indsættelse ikke påvirker Overførselsfunktionen af plasmider.
2. beregning af konjugation hyppigheden af MPN-metoden
- Forberede sterile LB + Km og LB + Gm plader.
- Vokse en O/N kultur af P. putida SMDBS husly pBP136::normal god landbrugspraksis eller pCAR1::normal god landbrugspraksis i 3 mL sterilt LB indeholdende Km og en kultur af P. putida KT2440RGD (GmRasmussen, RifRasmussen) i 3 mL af LB indeholdende Gm (140 rpm, 30 ° C).
- Efter høst og vask celler som trin 1.1.2, skal du bruge dem til filter parring ved 30 ° C i 45 min som i trin 1.1.3.
- Seriefremstillede fortyndet ovenstående donor og recipient kultur (10.1 – 10-7) og sprede det på LB + Km (donor) eller LB + Gm (modtageren) plader (hver i tre eksemplarer) for at tælle kolonidannende enheder (CFU). Inkuber plader ved 30 ° C i 2 d.
- Resuspend blandingen på filteret i sterile LB indeholdende Km og Gm, og seriefremstillede fortyndes (fra 21 til 224– 107.2) ved hjælp af en 96-brønd celle kultur plade (i fire eksemplarer).
- Inkuber 96-brønd pladen i et passende tidspunkt (2 d ved 30 ° C).
- Tælle CFU af donor og recipient på plader (trin 2.4.) og tælle antallet af brønde, hvor transconjugants vokse.
- Beregne MPN og sin afvigelse ved hjælp af MPN beregningsprogram udviklet af Jarvis mfl. 22, som er tilgængelig på http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls.
- Angiv navnet på eksperiment (ex., 'test'), datoen for eksperimentet (ex., 2018/4/9), antallet af test-serien og max. Nej. af fortyndinger (Indtast '24') i række #7 i programmet' ark til Excel-fil ('MPN_ver5.xls').
- Angiv ' 2-1 (= 0,5) til 2-24 (= 5.96 × 10-8)' i kolonnen 'fortynding faktor d''0,01' i 'volumen i ml eller g w'kolonne, og ' 4' i ' nr. af rør n' i tabellerne automatisk produceret af "input data".
- Angiv antallet af brønde, hvor transconjugants vokse på hver prøveopløsning (0-4).
- Tryk på øverste højre 'Beregne resultater' knappen, og derefter få resultater (i MPN/μL) og deres 95% sikkerhedsgrænser (øvre og nedre).
- Beregne konjugation hyppigheden af plasmider ved at dividere antallet af transconjugants (MPN/mL) af antallet af donor og recipient celler (CFU/mL).
3. forberedelse til estimering af sandsynligheden for Donor-initierede konjugation
- Vokse en O/N kultur af P. putida SMDBS husly pBP136::normal god landbrugspraksis eller pCAR1::normal god landbrugspraksis i 3 mL sterilt LB indeholdende Km og en kultur af P. putida KT2440RGD (GmRasmussen, RifRasmussen) i 3 mL sterilt LB indeholdende Gm med 300 mL kolberne (140 rpm, 30 ° C) som precultures.
- Overføre 200 μl af preculture til 200 mL frisk sterile LB indeholdende Km eller Gm i 500 mL målekolber og inkuberes ved 30 ° C under omrystning på 140 rpm.
- Måling af turbiditet på 600 nm (OD600) ved hjælp af en UV-VIS Spektrofotometer og spot-kulturen kultur, fortyndet i LB (101– 108-fold fortyndinger), på en LB plade der indeholder Km eller Gm. Incubate disse LB plader ved 30 ° C i 1-2 d , og bestemme CFU.
- Plot OD600 værdier og CFU med vækst tid til at generere vækstkurver af donor og recipient.
- Vokse kulturer af donor og recipient stammen til midten log fase, baseret på vækstkurven.
- Efter høst og vaske cellerne, forberede 101– 103 CFU af donor i 10 μL af LB og 105– 107 CFU af modtageren i 100 μL af LB.
- Mix 10 μL af donoren og 100 μL af de modtagende kulturer på forskellige tætheder i 96-brønd plader (i tre eksemplarer). For eksempel mix 101 CFU af donoren og 105 CFU af modtageren og tilføje det til hver af de 96 brønde, og mix 101 CFU donors og 106 CFU af modtageren i en anden 96-brønd plade, og så videre.
- Inkuber blanding ved 30 ° C i 45 min, og derefter tilføje høje koncentrationer af antibiotika (100 μg/mL Km og 60 μg/mL Gm) til hver brønd til at hæmme yderligere konjugering.
- Inkuber plade ved 30 ° C i 2 d.
- Tæl antallet af brønde, hvor transconjugants vokser.
- Vælg den modtagende tæthed, der er relevant for vurdering af sandsynligheden for donor-initierede konjugation baseret på ovennævnte data (transconjugants skulle findes i mindst 1 godt af en 96-brønd plade).
Bemærk: Transconjugants vil vokse i alle brønde når tætheder af donor og recipient celler er høje og mere end én konjugation opstår i en brønd. Derimod vil ingen transconjugants blive fundet i nogen wells når celle tæthed er for lavt. I det følgende afsnit, er en enkelt donor celle sorteret i en brønd. Den modtagende tæthed bør derfor maximalt.
4. vurdering af sandsynligheden for Donor-initierede konjugation
- Forberede 200 mL af en mid log fase kultur af donor P. putida SMDBS husly pBP136::normal god landbrugspraksis eller pCAR1::normal god landbrugspraksis , og at modtageren P. putida KT2440RGD, som beskrevet i 3.6-3.7.
- Sted 106 CFU af modtageren i 100 μL af LB i hvert hul i en 96-brønd plade.
- Oprette FACS-system (flow flowcytometri og celle sorteringsanlæg med en robot arm, en 488 nm argon laser og en 70 μm dyse blænde). Indstillet til forward scatter (FSC), med en 1% grænseværdi som udløseren erhvervelse. Tune H gevinst og en gevinst på FSC og side scatter (SSC) ved maksimal følsomhed, der kan udelukke falsk positive signaler, ved hjælp af PBS som en negativ kontrol. Sæt slags gate baseret på FSC og SSC og 0,5 drop form tilstand for maksimal form renhed.
- Sortere en enkelt donor celle af FACS på en LB plade (384 forskellige steder), Ruger plade ved 30 ° C i 2 d, og derefter tælle hvor mange kolonier vises på pladen fra de sorterede celler.
Bemærk: Denne procedure er for validering af den angivne port. Hvis der er 384 kolonier på pladen, betyder det, at 100% af de sorterede celler kunne danne kolonier. Den gennemsnitlige gyldigheden af sortering er altid 90-95%. - Sortere en enkelt donor celle af FACS i hvert hul i en 96-brønd plade med modtageren (4.2).
- Inkuber plade i 45 min. ved 30 ° C, og derefter tilføje høje koncentrationer af antibiotika (100 μg/mL Km og 60 μg/mL Gm) til hver brønd til at forhindre yderligere konjugering.
- Inkuber plade ved 30 ° C i 2 d.
- Tæl antallet af brønde, hvor transconjugants voksede som bestemt ved visuel inspektion med det blotte øje.
- Beregn sandsynligheden for donor-initierede konjugation ved at dividere antallet af brønde med transconjugants af det samlede antal brønde, donoren var sorteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammenligning af konjugation hyppigheden af MPN-metoden
I vores tidligere rapport, vi sammenlignede konjugation frekvenser af pBP136::normal god landbrugspraksis og pCAR1::normal god landbrugspraksis i tredobbelt fortyndet LB (1/3 LB) flydende medium med forskellige omrøring satser efter en 45 min parring ved hjælp af 125 mL spinner kolber10. Vi sammenlignede konjugation frekvenser af pBP136::normal god landbrugspraksis og pCAR1::normal god landbrugspraksis med 106 CFU/mL af donor og recipient stammer under forskellige omrøring betingelser (0-600 omdr. / min.). Konjugation hyppigheden af begge plasmider steg til højere omrøring priser, og den maksimale forskel konjugation frekvensen var < 10-fold for pBP136::normal god landbrugspraksis (mellem 0 og 400 omdr. / min.), mens pCAR1::normal god landbrugspraksis var ~ 25-fold (mellem 0 og 200 rpm; Fig. 1).
Estimering af sandsynligheden for donor-initierede konjugation
Den tidligere anslåede sandsynlighed for donor-initierede konjugering er vist i tabel 2. Bestem tætheden af modtagerens celler skal sammenligne sandsynligheden for konjugering, parring assays blev udført med forskellige tætheder af donor og recipient. Som vist i tabel 2, pBP136::normal god landbrugspraksis transconjugants blev opdaget i 100% (96/96) af brønde, der indeholder 103 CFU donor og 105-107 CFU af modtageren, og dem med 102 CFU donor og 106-107 CFU af modtageren, der angiver, at celle tæthed var for høj. Parring assays med 101 CFU donor og 106 eller 105 CFU af modtageren resulterede i et nedsat antal transconjugant-positive wells (66 pct. og 2,1 pct., henholdsvis, tabel 2). Således > 105 CFU af modtageren var forudsagt forlanges for parring med en enkelt donor celle. Ligeledes, vi udførte de parring assays med pCAR1::normal god landbrugspraksis på forskellige tætheder af donor og recipient stammer. Procenter af transconjugant-positive wells var meget lavere end de af pBP136::normal god landbrugspraksis (tabel 2). At antage, de donor- og recipientorganisme celler kan knytte til hinanden på samme måde, var sandsynligheden for konjugation indledning til donor-pCAR1 lavere end for pBP136 donor. Baseret på disse resultater, vi har besluttet, at 107 CFU af modtageren var nødvendig for en enkelt donor celle sorteret efter FACS.
Derefter, antallet af transconjugant-positive wells var talt op. Procentdelen af transconjugant-positive brønde til pBP136::normal god landbrugspraksis var større (1,9%) end for pCAR1::normal god landbrugspraksis (< 0.052%; Tabel 2). Således var der mere end en 36-fold forskel i sandsynligheden for donor-initierede konjugation mellem disse to plasmider.
Figur 1. Sammenligning af konjugation frekvenser af pBP136::normal god landbrugspraksis og pCAR1::normal god landbrugspraksis med 106 koloni danner enheder (CFU) mL-1 fra donor (Pseudomonas putida SMDBS) og modtageren (P. putida KT2440RGD) på forskellige omrøring satser (0-600 omdr. / min.). Fejllinjer blev beregnet baseret på 95% sikkerhedsgrænser af MPN-metoden og standardafvigelsen af CFU af donor og recipient. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Bakteriestammer | Genotype og relevante fænotype | Reference eller kilde |
| Escherichia coli DH10B | F-, mcrA, Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ (ara leu) 7697, galU, galK , Λ-, rpsL, endA1, nupG | Thermo |
| E. coli S17-1(λpir) | TMRasmussen, Smr, recA, thi, pro, hsdR-M+, RP4: 2-Tc: Mu: Km Tn7 λpir | 18 |
| Pseudomoans putida KT2440 | Kms, Rifs, Gms, Tcr | 25 |
| Pseudomoans putida KT2440(pCAR1) | KT2440 husly pCAR1 | 20 |
| Pseudomoans putida KT2440RGD | Kms, RifRasmussen, GmRasmussen, TcRasmussen, miniTn7(Gm) PA1/O4/O3DsRedExpress-a er inseted i kromosom | 10 |
| Pseudomoans putida SMDBS | Afledte stamme af P. putida KT2440, dapB-slettet, Kms, Gms, RifRasmussen, Tcr, lacIq indsættes i kromosom | 21 |
| P. resinovorans CA10RG | Kms, RifRasmussen, GmRasmussen, TcSørensen | 6 |
| Plasmider | ||
| pBP136 | IncP-1, MOBPedersen, MPFT plasmid | 17 |
| pBP136::normal god landbrugspraksis | pBP136 transporterer KmRasmussen og PA1/04/03-normal god landbrugspraksis kassette i parA (26,137 nt) | 21 |
| pCAR1 | IncP-7, MOBH, MPFF, carbazol degradative plasmid | 26, 27 |
| pCAR1::normal god landbrugspraksis | pCAR1 transporterer KmRasmussen og PA1/04/03-normal god landbrugspraksis kassette i ORF171 (182,625 nt) | 21 |
| pJBA28 | APr, KmRasmussen, levering plasmid for mini-Tn5-Km-PA1/04/03- RBSII-NGLmut3*-T0-T1 | 18 |
Tabel 1. Bakterielle stammer og plasmider.
| Plasmid | en Donor | en Modtageren | Antallet af brønde med transconjugants per 96 brønde | Procentdel |
| [CFUs eller celle] | [CFUs] | [%] | ||
| pBP136::normal god landbrugspraksis | 103 | 107 | 96/96 | 100 |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 96/96 | 100 | ||
| 102 | 107 | 96/96 | 100 | |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 54/96 | 56 | ||
| 101 | 107 | 71/96 | 74 | |
| 106 | 63/96 | 66 | ||
| 105 | 2/96 | 2.1 | ||
| 1 | 107 | 23/1212 | 1.9 | |
| pCAR1::normal god landbrugspraksis | 103 | 107 | 6/96 | 6.3 |
| 106 | 6/96 | 6.3 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 102 | 107 | 1/96 | 1 | |
| 106 | 1/96 | 1 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 101 | 107 | 0/96 | 0 | |
| 106 | 0/96 | 0 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 1 | 107 | 1/1920 | < 0.052 |
Tabel 2. Antallet af brønde, med forskellige tætheder, der indeholder transconjugants for at sammenligne sandsynligheden for donor-initierede konjugation mellem pBP136::normal god landbrugspraksis og pCAR1::normal god landbrugspraksis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer her, en høj opløsning protokol til påvisning af forskelle i konjugation hyppighed under forskellige betingelser, ved hjælp af en MPN metode til at anslå antallet af transconjugants. Et vigtigt skridt i protokollen fortynding blanding af donor og recipient efter parring indtil ingen transconjugants vokse. Et andet skridt er at tilføje høje koncentrationer af antibiotika til selektiv flydende medium til at forhindre yderligere konjugering. Disse procedurer kan reducere baggrunden forårsaget af yderligere konjugation i den selektivt medie. Vi kunne med held opdage forskelle, selv efter en parring kortvarige mellem donor og recipient. Konjugering hyppighed beregnes af denne protokol kan ændres af små forskelle i donor og recipient stammer vækstbetingelser. Således, disse betingelser bør udformes omhyggeligt.
Derudover præsenterer vi en protokol til estimering af det andet trin af konjugation ved hjælp af FACS for enkelt donor celle sortering. Det vigtigste skridt i denne protokol er at fastlægge den passende tæthed af modtagerens celler for en sorteret enkeltdonor celle. Når antallet af modtagerens celler omkring en enkelt donor celle er stort nok, fysisk kontakt mellem donor og recipient er visse. Derefter, konjugation frekvens kan påvirkes, ikke af sandsynligheden for, hvor ofte de donor- og recipientorganisme celler kontakt med hinanden, men sandsynligheden for donor-initierede konjugering. Sortering af en enkelt donor celle af FACS er ikke svært; 96 brønde er imidlertid ikke altid tilstrækkelige til at vurdere sandsynligheden. Derfor bør være indstillet på 10-100 plader. En af der i protokollen er, at det ikke er passende til at måle sandsynligheden for donor-initierede konjugation af et plasmid med lav frekvens overførbarhed.
Baseret på disse metoder og deres resultater, rapporteret vi for nylig, at to plasmider viste forskellige konjugation frekvenser i flydende medier ved at ændre de omrøring satser, der kan påvirke de første og tredje trin af konjugation, vedhæftet fil og udstationering af donor-modtager par. Derudover fandt vi også forskelle i sandsynligheden for det andet trin10. Disse resultater viser, hvordan konjugation frekvens ændres under forskellige betingelser. Disse protokoller er nyttige til at sammenligne funktionerne konjugation af plasmider under forskellige forhold, herunder aerobe eller anaerobe forhold, forskellige donor-modtager par, forskellige temperatur eller pH, og i tilstedeværelse eller fravær af specifikke kemikalier, såsom kationer, næringsstoffer og antibiotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takke Dr. K. Kamachi af det nationale Institut for smitsomme sygdomme (Japan) for at give pBP136 og Prof. Dr. H. Nojiri fra University of Tokyo (Japan) for at give pCAR1. Vi er også taknemmelige til Professor Dr. Molin Sølen af Danmarks Tekniske Universitet for at give pJBA28. Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI (Grant numre 15H 05618 og 15KK0278) til MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
- Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F.
- Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
- Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
- Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
- Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
- Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
- Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).
- Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
- Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
- Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
- Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
- Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E.
- Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
- Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
- Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
- Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
- Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
- Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
- Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
- Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
- Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).
