Summary
Met een doel te begrijpen van het gedrag van verschillende bacteriële conjugative DNA elementen onder verschillende omstandigheden, beschrijven we een protocol voor de detectie van verschillen in de frequentie van de conjugatie, met een hoge resolutie te schatten hoe efficiënt de donor-bacterie met deze opdracht start Woordherkomst en-opbouw.
Abstract
Bacteriële conjugatie is een belangrijke stap in de horizontale overdracht van antibiotica-resistentiegenen via een conjugative DNA-element. Diepgaande vergelijkingen van geconjugeerde frequentie onder verschillende omstandigheden moeten begrijpen hoe verspreidt het conjugative element in de natuur. Conventionele methodes voor het vergelijken van geconjugeerde frequentie zijn echter niet geschikt voor diepgaande vergelijkingen vanwege de hoge achtergrond veroorzaakt door extra vervoeging gebeurtenissen op de selectieve plaat. We verlaagd met succes de achtergrond door de invoering van een meest waarschijnlijke aantal (MPN) methode en een hogere concentratie van antibiotica ter voorkoming van verdere vervoeging in selectieve vloeistof. Daarnaast ontwikkelden we een protocol voor het inschatten van de kans op hoe vaak donor cellen starten vervoeging gesorteerd enkele donor cellen in ontvangende zwembaden door fluorescentie-activated cell sorting (FACS). Met behulp van twee plasmiden, kon pBP136 en pCAR1, de verschillen in de frequentie van de vervoeging in Pseudomonas putida cellen worden opgespoord in vloeistof tegen verschillende opzwepende tarieven. De frequenties van geconjugeerde Inleiding waren hoger voor pBP136 dan voor pCAR1. Met deze resultaten, kunnen we beter de functies van de vervoeging in deze twee plasmiden begrijpen.
Introduction
Bacteriële vervoeging van mobiele genetische elementen, conjugative plasmiden en integratieve en conjugative elementen (ICEs) is belangrijk voor de horizontale verspreiding van genetische informatie. Het kan bevorderen snelle bacteriële evolutie en aanpassing en overbrengen van multidrug resistentie genen1,2. De vervoeging frequentie kan worden beïnvloed door eiwitten gecodeerd op de conjugative elementen voor mobilisatie van DNA (MOB) en de paring paar vorming (MPF), met inbegrip van geslacht pili, die zijn ingedeeld volgens MOB en MPF type3,,4, 5. Het kan ook worden beïnvloed door de donor en ontvanger paar6 en de voorwaarden van de groei van de cellen7,8,9,10,11,12 ( groeitempo op jaarbasis, celdichtheid, stevige ondergrond of opgietvloeistof, temperatuur, beschikbaarheid van nutriënten en de aanwezigheid van kationen). Om te begrijpen hoe de conjugative elementen verspreid onder bacteriën, is het noodzakelijk om te vergelijken vervoeging frequentie in detail.
De vervoeging frequentie tussen donor en ontvanger paren na de paring worden meestal als volgt geschat door conventionele methoden. (i) ten eerste, het aantal kolonies van donor en ontvanger worden geteld; (ii) dan worden de ontvangende kolonies, waaraan de conjugative elementen (= transconjugants) geteld; (iii) en ten slotte de vervoeging frequentie wordt berekend door de kolonievormende eenheden (kve) van de transconjugants door die van de donor en/of ontvanger13. Wanneer u deze methode gebruikt, is de achtergrond echter hoog als gevolg van extra vervoeging gebeurtenissen die ook op de selectieve platen gebruikt plaatsvinden kunnen voor het verkrijgen van transconjugants wanneer de celdichtheid hoge10is. Het is daarom moeilijk te detecteren van kleine verschillen in frequentie (onder een 10-fold verschil). We introduceerde onlangs een meest waarschijnlijke aantal (MPN) methode met behulp van vloeibaar medium met een hogere concentratie van antibiotica. Hierdoor verminderd de achtergrond door remming van verdere vervoeging in het selectieve medium; Dus, de vervoeging frequentie kan worden geraamd met een hogere resolutie.
Vervoeging kan worden onderverdeeld in drie stappen: (1) bevestiging van de donor-ontvanger paar (2) opening van conjugative overdracht, en (3) dissociatie van het paar14. Tijdens stap (1) en (3) is er fysieke interactie tussen de donor en de ontvanger cellen; Dus, celdichtheid en de milieuomstandigheden kunnen invloed op deze stappen, hoewel de kenmerken van het geslacht pili ook belangrijk zijn. Stap (2) is waarschijnlijk geregeld door de expressie van verschillende genen die betrokken zijn bij de vervoeging in reactie op externe veranderingen, die kunnen worden beïnvloed door verschillende functies van de plasmide, donor en ontvanger. Hoewel de fysieke bijlage of detachement van donor en ontvanger paren kan worden wiskundig gesimuleerd met behulp van een schatting van cellen als deeltjes, worden de frequentie van de stap (2) experimenteel gemeten. Er zijn een paar verslagen over directe waarnemingen van hoe vaak donoren kunnen dit leiden tot vervoeging [stap (2)] met behulp van fluorescentie microscopie15,16; deze methoden zijn echter niet high-throughput omdat een groot aantal cellen moet worden gecontroleerd. Dus, wij een nieuwe methode ontwikkeld om schatting van de waarschijnlijkheid van het optreden van de stap (2) met behulp van fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS). Onze methode kan worden toegepast op elke plasmide, zonder identificatie van de essentiële genen voor Woordherkomst en-opbouw.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van een Donor met groen fluorescente proteïne (GFP)- en kanamycine resistentie gen-gelabeld plasmiden
- Binnenbrengen van de pBP136 van de plasmide doel van markers
Opmerking: Het doel van dit protocol is het genereren van pBP136::gfp. De bacteriestammen en plasmiden gebruikt in dit onderzoek zijn vermeld in tabel 1.- Culturen van Escherichia coli DH10B pBP13617 in 5 mL steriele Luria Bouillon (LB) en E. coli S17-1λpir18 herbergen pJBA2819 herbergen groeien [met een kanamycine (Km)-resistentie gen en gfp mut3 * gen met haar promotor en terminator in een mini-Tn5] in 5 mL steriele LB met 50 μg/mL Km bij 37 ° C's nachts (O/N, 16-24 h) met schudden 200 omwentelingen per minuut (rpm).
- Oogsten en wassen
- Oogst 1 mL van elke cultuur, plaats deze in een 2 mL microtube en centrifuge (10.000 × g, kamertemperatuur, 2 min). Vervolgens Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 2 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Centrifuge opnieuw (10.000 × g, kamertemperatuur, 2 min) en resuspendeer in 500 μL van steriele PBS.
- Filteren paring
- Steriele LB platen (met 1,6% agar) voor te bereiden, en plaats een steriele 0,22 μm porie grootte membraanfilter op het. Mix 500 μL van E. coli S17-1λpir herbergen pJBA28 met E. coli DH10B pBP136 en spot het mengsel op het filter op de plaat LB herbergen. Incubeer de plaat O/N bij 30 ° C. Verwijder het filter uit de LB-plaat, plaats deze in een plastic buis van steriele 50 mL en voeg 1 mL steriele PBS.
Opmerking: pJBA28 kan repliceren in aanwezigheid van Π eiwit, gecodeerd door de pir gene18, en kan worden overgedragen van S17-1λpir aan DH10B. pBP136 draagt geen marker gene17 en van DH10B kan worden overgedragen aan S17-1λpir. Daarom kunnen wij geen onderscheid S17-1λpir herbergen van pBP136 en pJBA28 van de DH10B herbergen pBP136 en de mini-Tn5 (omgezet in het chromosoom of pBP136) in dit stadium. We gebruikten dan mengsels van hen als donoren in opeenvolgende stappen (1.1.4.–1.1.5.).
- Steriele LB platen (met 1,6% agar) voor te bereiden, en plaats een steriele 0,22 μm porie grootte membraanfilter op het. Mix 500 μL van E. coli S17-1λpir herbergen pJBA28 met E. coli DH10B pBP136 en spot het mengsel op het filter op de plaat LB herbergen. Incubeer de plaat O/N bij 30 ° C. Verwijder het filter uit de LB-plaat, plaats deze in een plastic buis van steriele 50 mL en voeg 1 mL steriele PBS.
- Een O/N cultuur van het bovenstaande paring mengsel in steriele LB met 50 μg/mL Km bij 37 ° C met schudden bij 200 rpm en een cultuur van Pseudomonas putida KT2440 groeien [Km-gevoelige (Kms), rifampicine-gevoelige (Rifs), Gentamicine-gevoelige (Gm-s), en tetracycline resistente (Tcr)] in medium met 12,5 μg/mL Tc bij 30 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
- Na het oogsten en wassen van de cellen zoals in stap 1.1.2, ze (de paring mengsel en KT2440) te gebruiken voor filter paring (O/N, 30 ° C) zoals in stap 1.1.3.
- Bereiden van steriele LB platen met 50 μg/mL Km en 12,5 μg/mL Tc (LB Km + Tc platen).
- Verdun de geresuspendeerde mengsel op het membraanfilter met steriel PBS (101–105-vouwen), en vervolgens verspreiding elke verdunning op LB Km + Tc platen en Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2-3-d.
- Kies kolonies van de platen, groeien een O/N cultuur in steriele LB met Km, evenals Tc en P. resinovorans CA10dm4RG (Rifr en Gmr)6 in steriele LB met Rif (25 μg/mL) en Gm (30 μg/mL) bij 30 ° C en 200 rpm.
Opmerking: Zoals beschreven in de vorige opmerking, de kolonies op de LB + Km + Tc platen (van 1.1.7.) kan worden KT2440 herbergen pBP136 die een mini-Tn5 en KT2440 met een mini-Tn5, omdat pJBA28 kunnen direct worden overgebracht van S17-1λpir pBP136 en pJBA28 om KT2440 te herbergen. Dit is de reden waarom een andere paring met P. resinovorans CA10RG is vereist voor het verkrijgen van de target pBP136 met een mini-Tn-5 in de volgende stappen. - Na het oogsten en wassen van de cellen zoals in stap 1.1.2, ze gebruiken voor filter paring (O/N, 30 ° C) zoals in stap 1.1.3.
- Bereiden van steriele LB platen met Rif, Gm en Km (LB Rif + Km + Gm platen).
- Resuspendeer het mengsel op het filter en vervolgens verdund het 101–105-vouw, verspreid het naar LB Rif + Km + Gm platen en Incubeer de platen voor 2 – 3 d bij 30 ° C.
- Kies de kolonies en controleren als zij pBP136 door PCR met behulp van specifieke primers voor het plasmide haven.
- Invoering van een selectieve marker-gen in de target plasmide pCAR1
Opmerking: Het doel van dit protocol is het genereren van pCAR1::gfp- Groeien van een cultuur van de O/N van P. putida KT2440 pCAR1 herbergen (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 200 rpm en 30 ° C en E. coli S17-1λpir18 herbergen pJBA28 in 5 mL steriele LB bevattende 50 μg/mL Km op 200 rpm en 37 ° C.
- Na het oogsten en wassen van de cellen zoals in stap 1.1.2, ze gebruiken voor filter paring (O/N, 30 ° C) zoals in stap 1.1.3.
- Verwijder het filter uit de LB-plaat, plaats deze in een plastic buis van steriele 50 mL en voeg 1 mL steriele PBS.
- Verdun de geresuspendeerde mengsel met steriel PBS (101–105-vouwen), en verspreid het verdunde mengsel op steriele selectieve LB + Tc + Km platen.
Opmerking: pCAR1 niet gerepliceerd in E. coli; Dus, P. putida KT2440 herbergen pCAR1 met een mini-Tn5 kunnen worden geselecteerd op LB + Tc + Km platen. - Kies een kolonie van de plaat, en groeien van een cultuur van de O/N in steriele LB met Km en Tc en een cultuur van P. resinovorans CA10dm4RG in steriele LB met Rif en Gm (200 rpm, 30 ° C).
- Na het oogsten en wassen zoals in stap 1.1.2, de cellen gebruiken voor de filter paring (O/N, 30 ° C) zoals in stap 1.1.3.
- Resuspendeer het mengsel op het filter en vervolgens verdund het, verspreid op LB Rif + Km + Gm platen en Incubeer de platen voor 2 – 3 d bij 30 ° C.
- Kies de kolonies en controleren als zij pCAR1 door PCR met specifieke primers voor het plasmide haven.
- Bevestigen van de overdraagbaarheid van de tagged-plasmiden en de donoren voor te bereiden voor de volgende stappen
Opmerking: Het doel van dit protocol is te bevestigen de overdraagbaarheid van de bovenstaande gebouwd plasmiden en de donoren voor te bereiden voor de volgende stappen.- Groeien van een cultuur van de O/N van P. resinovorans CA10dm4RG herbergen pBP136::gfp of pCAR1::gfp in steriele LB met Km en een cultuur van P. putida SMDBS [KmsGms, Rifr, Tcr, lacI q, in welk PA1/O4/O3-gfpmut3* niet vanwege haar chromosomale lacIq gen wordt uitgedrukt]21 in 3 mL LB met Tc (200 rpm, 30 ° C).
- Na het oogsten en wassen van de cellen zoals in stap 1.1.2, ze gebruiken voor filter paring (O/N, 30 ° C) zoals in stap 1.1.3.
- Plaats de filter in een steriele 50 mL kunststof buis en resuspendeer met 1 mL steriele PBS. Verdun de geresuspendeerde mengsel met steriel PBS (101–105-vouw), verspreid het verdunde mengsel op steriele selectieve LB + Tc + Km platen.
- Kies de kolonies en controleren als zij elk van de plasmiden door PCR met specifieke primers haven.
Opmerking: Bevestiging van het standpunt van de invoeging van de mini-Tn5 door directe het rangschikken na extractie van het plasmide is optioneel, om te bevestigen dat de invoegpositie niet aan de overdrachtsfunctie van de plasmiden afdoet.
2. berekening van de vervoeging frequentie door de MPN-methode
- Bereiden van steriele LB Km en LB + Gm platen.
- Een O/N cultuur van P. putida SMDBS herbergen pBP136 groeien::gfp of pCAR1::gfp in 3 mL steriele LB met Km en een cultuur van P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) in 3 mL LB met Gm (140 rpm, 30 ° C).
- Na het oogsten en wassen van de cellen zoals in stap 1.1.2, ze te gebruiken voor filter paring bij 30 ° C gedurende 45 minuten zoals in stap 1.1.3.
- Serieel verdunde de bovenstaande donor en ontvanger cultuur (101 –107) en verspreid het op LB + Km (donor) of LB + Gm (ontvanger) platen (alle in drievoud) om te tellen de kolonievormende eenheden (kve). Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2 d.
- Resuspendeer het mengsel op het filter in steriele LB met Km en Gm, en serieel Verdun (van 21 224–107.2) met behulp van een 96-Wells cel cultuur plaat (in viervoud).
- Incubeer de 96-wells-plaat voor het juiste moment (2 d bij 30 ° C).
- De CFU van de donor en de ontvanger op de platen (stap 2.4.) tellen en tellen van het aantal putten waarin de transconjugants groeien.
- Bereken de MPN en haar afwijking met behulp van het MPN berekeningsprogramma ontwikkeld door Jarvis et al. 22, die beschikbaar op http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls is.
- Voer de naam van het experiment (ex., 'testen'), de datum van het experiment (ex., 2018/4/9), het aantal testreeks en de max. Nee. verdunningen (Voer '24') in rij #7 van het 'programma' blad van het Excel-bestand ('MPN_ver5.xls').
- ' 2-1 (= 0,5) naar 2-24 (= 5.96 × 10-8)' in de kolom 'verdunning factor d'invoeren '0,01' in de kolom 'volume in ml of g w'en ' 4' in ' nr. van buizen n' in het automatisch geproduceerde gegevenstabellen ' invoer '.
- Voer het aantal putten waarin de transconjugants op elke monsterverdunning (0-4 groeien).
- Druk op de bovenste rechts 'Resultaten berekenen' knop, en vervolgens de resultaten (in MPN/μl) en hun 95%-betrouwbaarheidsgrenzen (boven- en ondergrenzen) krijgen.
- Bereken de frequentie van de vervoeging van de plasmiden, door het aantal transconjugants (MPN/mL) te delen door de nummers van donor en ontvanger cellen (CFU/mL).
3. voorbereiding van de schatting van de waarschijnlijkheid van Donor aangestuurde Woordherkomst en-opbouw
- Een O/N cultuur van P. putida SMDBS herbergen pBP136 groeien::gfp of pCAR1::gfp in 3 mL steriele LB met Km en een cultuur van P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) in 3 mL steriele LB met Gm met behulp van 300 mL kolven (140 rpm, 30 ° C) als precultures.
- Breng 200 μL van de preculture in 200 mL verse steriele LB bevattende Km of Gm maatkolven van 500 mL en Incubeer bij 30 ° C met schudden bij 140 omwentelingen per minuut.
- Meten van de troebelheid op 600 nm (OD600) van de cultuur met behulp van een UV-VIS spectrofotometer en spot de cultuur, verdund in LB (101–108-vouwen verdunningen), op een LB-plaat met Km of Gm. Incubate deze LB platen bij 30 ° C gedurende 1-2 d , en het bepalen van de CFU.
- Plot de600 OD-waarden en de CFU met groei tijd voor het genereren van de groeicurven van de donor en de ontvanger.
- Culturen van de donor en ontvanger stam groeien tot halverwege log fase, op basis van de groeicurve.
- Na het oogsten en wassen van de cellen, 101–103 CFU van de donor in 10 μL van LB en 105–107 CFU van de ontvanger in 100 μl van LB te bereiden.
- Mix 10 μL van de donor en 100 μl van de ontvangende culturen op verschillende dichtheden in 96-wells-platen (in drievoud). Bijvoorbeeld, meng 101 CFU van de donor en 105 CFU van de ontvanger en toevoegen aan elk van de 96-wells, en meng 101 CFU van de donor en 106 CFU van de ontvanger in een andere 96-wells-plaat, en zo verder.
- Incubeer het mengsel bij 30 ° C voor 45 min, en voegt u hoge concentraties van antibiotica (100 μg/mL Km en 60 μg/mL Gm) aan elk putje te remmen verder Woordherkomst en-opbouw.
- Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 2 d.
- Het aantal putten waarin de transconjugants groeien.
- Kies de ontvangende dichtheid die geschikt is voor de schatting van de waarschijnlijkheid van donor aangestuurde geconjugeerde op basis van de bovenstaande gegevens (transconjugants moet worden gevonden in ten minste 1 goed van een 96-wells-plaat).
Opmerking: Transconjugants zal groeien in alle putjes als de dichtheid van de cellen van donor en ontvanger hoog zijn en meer dan één vervoeging treedt op in een put. Daarentegen zal geen transconjugants worden gevonden in elke putten wanneer de celdichtheid te laag is. In de volgende sectie, wordt de cel van een enkele donor gesorteerd in een put. Daarom moet de ontvangende dichtheid op maximum.
4. de schatting van de waarschijnlijkheid van Donor aangestuurde Woordherkomst en-opbouw
- Bereiden van 200 mL van de cultuur van een mid log fase van donor P. putida SMDBS herbergen pBP136::gfp of pCAR1::gfp en die van de ontvanger P. putida KT2440RGD, zoals beschreven in 3.6 – 3.7.
- Plaats 106 CFU van de ontvanger in 100 μl van LB in ieder putje van een 96-wells-plaat.
- Opzetten van het systeem van FACS (stroom cytometry en cel sorter met een robotachtig wapen, een 488 nm argon laser en een opening van de sproeier 70 μm). Ingesteld op vooruit (FSC), spreidingsdiagrammen met gegevenspunten verbonden een drempel van 1% als de trigger van de overname. Afstemmen van de H-winst en een winst van de FSC en kant scatter (SSC) op maximale gevoeligheid, die valse positieve signalen, met behulp van PBS als een negatieve controle kunt uitsluiten. Stel de poort van de sorteren op basis van FSC en WS en 0.5 drop sorteren modus voor maximale sorteren zuiverheid.
- Sorteren van een enkele donor-cel met de FACS op een LB-plaat (384 verschillende plekken), Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 2 d en dan tellen hoeveel kolonies op de plaat uit de gesorteerde cellen verschijnen.
Opmerking: Deze procedure is voor de validatie van de ingestelde poort. Als er 384 kolonies op de plaat zijn, betekent dit dat 100% van de gesorteerde cellen kolonies kunnen vormen. De gemiddelde geldigheidsduur van het sorteren is altijd 90-95%. - Sorteren van een enkele donor-cel met de FACS in ieder putje van een 96-wells-plaat met de ontvanger (4.2).
- Incubeer de plaat gedurende 45 minuten bij 30 ° C, en voegt u hoge concentraties van antibiotica (100 μg/mL Km en 60 μg/mL Gm) aan elk putje om te voorkomen dat verdere Woordherkomst en-opbouw.
- Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 2 d.
- Tel het aantal putten in die transconjugants als groeide bepaald door visueel onderzoek met het blote oog.
- De waarschijnlijkheid van donor aangestuurde geconjugeerde berekenen door het aantal putten met transconjugants door het totale aantal putten waarin de donor was gesorteerd te delen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vergelijking van geconjugeerde frequentie door de MPN-methode
In ons vorige verslag, vergeleken we de frequenties van de vervoeging van pBP136::gfp en pCAR1::gfp in drievoudige verdunde LB (1/3 LB) vloeistof met verschillende opzwepende tarieven na een 45 min paring met 125 mL spinner kolven10. We vergeleken de frequenties van de vervoeging van pBP136::gfp en pCAR1::gfp met 106 CFU/mL van donor en ontvanger stammen onder verschillende opzwepende omstandigheden (0-600 rpm). De frequentie van de vervoeging van beide plasmiden verhoogd tot een hoger niveau van de roeren, en het maximale verschil in de frequentie van de vervoeging was < 10-fold voor pBP136::gfp (tussen 0 en 400 rpm), terwijl dat van pCAR1::gfp werd ~ 25-fold (tussen 0 en nog 200 rpm; Fig. 1).
Schatting van de waarschijnlijkheid van donor aangestuurde Woordherkomst en-opbouw
De eerder geschatte kans van donor aangestuurde geconjugeerde is weergegeven in tabel 2. Om te bepalen van de dichtheid van de ontvangende cellen moeten vergelijken de waarschijnlijkheid van conjugatie, paring tests werden uitgevoerd met verschillende dichtheden van donor en ontvanger. Zoals weergegeven in tabel 2, pBP136::gfp transconjugants werden ontdekt in 100% (96/96) van putten met 103 CFU van donor en 105-107 CFU van ontvanger, en degenen met 102 CFU van donor en 106-107 CFU van afnemer, die aangeeft dat de celdichtheid te hoog was. Testen met 10 paring1 CFU van donor en 106 of 105 CFU van ontvanger geleid tot een verminderde aantal transconjugant-positieve wells (66% en 2,1%, respectievelijk, tabel 2). Dus, > 105 CFU van ontvanger nodig voor de paring met een enkele donor-cel werd voorspeld. Ook hebben we de paring testen met pCAR1 uitgevoerd::gfp op verschillende dichtheden van donor en ontvanger stammen. De percentages van de transconjugant-positieve putten veel lager waren dan die van pBP136::gfp (tabel 2). Ervan uitgaande dat de cellen van donor en ontvanger op dezelfde manier aan elkaar koppelt kunnen, is de kans van geconjugeerde inleiding voor de donor pCAR1 was lager dan die voor de donor pBP136. Op basis van deze resultaten, we vastgesteld dat 107 CFU van ontvanger nodig was voor een enkele donor cel FACS gesorteerd.
Dan werden de nummers van de transconjugant-positieve wells geteld. Het percentage van de transconjugant-positieve putten voor pBP136::gfp werd groter (1,9%) dan dat voor pCAR1::gfp (< 0.052%; Tabel 2). Er was dus meer dan een 36-fold verschil in de waarschijnlijkheid van donor aangestuurde geconjugeerde tussen deze twee plasmiden.
Figuur 1. Vergelijking van de frequenties van de vervoeging van pBP136::gfp en pCAR1::gfp met 106 kolonie vormende eenheden (kve) mL-1 van donor (Pseudomonas putida SMDBS) en ontvanger (P. putida KT2440RGD) op verschillende niveaus tarieven roeren (0-600 rpm). De foutbalken werden berekend op basis van 95% betrouwbaarheidsgrenzen door de MPN-methode en de standaarddeviatie van CFU van donor en ontvanger. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Bacteriestammen | Genotype en relevant fenotype | Verwijzing of bron |
| Escherichia coli DH10B | F-, mcrA, Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80dlacZΔM15, Δ,lacX74, deoR, recA1, araD139, Δ (ara leu) 7697, galU, galK , Λ-, rpsL, endA1, nupG | Thermo |
| E. coli S17-1(λpir) | TMrSmr, recA, thi, pro, hsdR-M+, RP4: 2-Tc: Mu: Km Tn7 λpir | 18 |
| Pseudomoans putida KT2440 | KmsRifs, Gms, Tcr | 25 |
| Pseudomoans putida KT2440(pCAR1) | KT2440 herbergen pCAR1 | 20 |
| Pseudomoans putida KT2440RGD | KmsRifr, Gm,r, Tcr, miniTn7(Gm) PA1/O4/O3DsRedExpress-a is inseted in chromosoom | 10 |
| Pseudomoans putida SMDBS | Afgeleide stam van P. putida KT2440, dapB-verwijderd, KmsGms, Rifr, Tcr, lacIq wordt ingevoegd in de chromosoom | 21 |
| P. resinovorans CA10RG | KmsRifr, Gm,r, Tcs | 6 |
| Plasmiden | ||
| pBP136 | IncP-1, MOBP, MPFT plasmide | 17 |
| pBP136::gfp | pBP136 uitvoering Kmr en PA1/04/03-gfp cassette in parA (26,137 nt) | 21 |
| pCAR1 | IncP-7, MOBH, MPFF, carbazole afbraakroutes plasmide | 26, 27 |
| pCAR1::gfp | pCAR1 uitvoering Kmr en PA1/04/03-gfp cassette in ORF171 (182,625 nt) | 21 |
| pJBA28 | APr, Kmr, levering plasmide voor mini-Tn5-Km-PA1/04/03- RBSII-gfpmut3*-T0-T1 | 18 |
Tabel 1. Bacteriestammen en plasmiden.
| Plasmide | een Donor | een Ontvanger | Het aantal putjes met transconjugants per 96-wells | Percentage |
| [CFUs of cel] | [CFUs] | [%] | ||
| pBP136::gfp | 103 | 107 | 96/96 | 100 |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 96/96 | 100 | ||
| 102 | 107 | 96/96 | 100 | |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 54/96 | 56 | ||
| 101 | 107 | 71/96 | 74 | |
| 106 | 63/96 | 66 | ||
| 105 | 2/96 | 2.1 | ||
| 1 | 107 | 23/1212 | 1.9 | |
| pCAR1::gfp | 103 | 107 | 6/96 | 6.3 |
| 106 | 6/96 | 6.3 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 102 | 107 | 1/96 | 1 | |
| 106 | 1/96 | 1 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 101 | 107 | 0/96 | 0 | |
| 106 | 0/96 | 0 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 1 | 107 | 1/1920 | < 0.052 |
Tabel 2. Het aantal putten, met verschillende cel dichtheden, met transconjugants om te vergelijken van de waarschijnlijkheid van donor aangestuurde geconjugeerde tussen pBP136::gfp en pCAR1::gfp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een high-resolution protocol voor de detectie van verschillen in vervoeging frequentie onder verschillende omstandigheden, gebruik een MPN-methode voor de raming van het aantal transconjugants. Een belangrijke stap in het protocol is het verdunnen van het mengsel van donor en ontvanger na de paring tot geen transconjugants groeien. Een andere stap is het toevoegen van hoge concentraties van antibiotica aan de selectieve vloeistof om te voorkomen dat verdere Woordherkomst en-opbouw. Deze procedures kunnen verminderen de achtergrond veroorzaakt door verdere vervoeging in het selectieve medium. We kunnen met succes detecteren verschillen, zelfs na een korte duur van de paring tussen de donor en de ontvanger. De conjugative frequentie berekend door dit protocol kan worden gewijzigd door kleine verschillen in de voorwaarden van de groei van de stammen van de donor en ontvanger. Deze voorwaarden moeten dus zorgvuldig worden ontworpen.
Daarnaast presenteren we een protocol voor het inschatten van de tweede stap van conjugatie met behulp van FACS voor enkele donor cel sorteren. De belangrijkste stap in dit protocol is het bepalen van de juiste dichtheid van de ontvangende cellen voor een gesorteerde enkele donor-cel. Wanneer het aantal geadresseerden cellen rondom de cel van een enkele donor is groot genoeg, fysiek contact tussen de donor en de ontvanger is zeker. Vervolgens kan de vervoeging frequentie worden beïnvloed, niet door de kans op hoe vaak de cellen van donor en ontvanger contact met elkaar kunnen opnemen, maar door de waarschijnlijkheid van donor aangestuurde vervoeging. Sorteren van een enkele donor-cel met de FACS is niet moeilijk; 96 putten zijn echter niet altijd voldoende te schatten de kans. Daarom, 10-100 platen moeten worden voorbereid. Een van de grenzen van het protocol is dat het is niet gepast voor het meten van de waarschijnlijkheid van donor aangestuurde vervoeging van een plasmide met lagefrequentie-overdraagbaarheid.
Op basis van deze methoden en hun resultaten, we onlangs gemeld dat de twee plasmiden verschillende vervoeging frequenties in vloeibare media toonde door het veranderen van de roeren tarieven, die kunnen invloed hebben op de stappen van het eerste en derde vervoeging, bijlage of detachement van donor-ontvanger-paren. Bovendien vonden wij ook verschillen in de waarschijnlijkheid van de tweede stap10. Deze resultaten tonen aan hoe de vervoeging frequentie verandert onder verschillende omstandigheden. Deze protocollen zijn handig voor het vergelijken van de kenmerken van de vervoeging van plasmiden onder verschillende omstandigheden, met inbegrip van aerobe of anaerobe omstandigheden, verschillende paren van donor en ontvanger, verschillende temperatuur of pH, en in de aanwezigheid of de afwezigheid van specifieke chemicaliën, zoals kationen, voedingsstoffen, en antibiotica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. K. Kamachi van het National Institute of Infectious Diseases (Japan) voor het verstrekken van pBP136 en Prof. Dr. H. Nojiri van de Universiteit van Tokio (Japan) voor het verstrekken van pCAR1. Wij zijn ook dankbaar Professor Dr. Molin Sølen van de Technische Universiteit van Denemarken voor het verstrekken van pJBA28. Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI (Grant nummers 15H 05618 en 15KK0278) aan MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
- Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F.
- Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
- Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
- Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
- Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
- Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
- Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).
- Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
- Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
- Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
- Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
- Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E.
- Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
- Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
- Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
- Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
- Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
- Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
- Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
- Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
- Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).
