Summary
Har som mål å forstå oppførsel av ulike bakteriell konjugerbart DNA elementer under ulike forhold, beskriver vi en protokoll for å oppdage forskjeller i Bøyning frekvens, med høy oppløsning, å anslå hvor effektivt donor bakterien starter Bøyning.
Abstract
Bakteriell Bøyning er et viktig skritt i vannrett overføring av antibiotikaresistens gener via en konjugerbart DNA-element. Grundig sammenligninger av Bøyning frekvens under ulike forhold må forstå hvordan konjugerbart elementet spres i naturen. Men er konvensjonelle metoder for å sammenligne Bøyning frekvens ikke hensiktsmessig for grundig sammenligninger på grunn av høy bakgrunnen forårsaket av forekomsten av ekstra Bøyning hendelser på selektiv tallerkenen. Vi redusert har bakgrunnen ved å innføre en mest sannsynlig (MPN) metode og en høyere konsentrasjon av antibiotika for å hindre ytterligere bøyning i selektiv flytende medium. Dessuten, utviklet vi en protokoll for å anslå sannsynligheten for hvor ofte donor cellene initiere Bøyning av sortering enkelt donor cellene i mottakerens bassenger fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). Bruker to plasmider, pBP136 og pCAR1, forskjellene i Bøyning frekvens i Pseudomonas putida celler ble oppdaget i flytende medium til forskjellige gripende priser. Frekvenser av Bøyning innvielsen var høyere for pBP136 enn for pCAR1. Med disse resultatene, kan vi bedre forstå funksjonene bøyning i disse to plasmider.
Introduction
Bakteriell Bøyning av mobile genetiske elementer, konjugerbart plasmider og integrerende og konjugerbart elementer (ICEs) er viktig for vannrett spredning av genetisk informasjon. Fremme rask bakteriell utvikling og tilpasning kan og overføre multidrug motstand gener1,2. Bøyning frekvensen kan påvirkes av proteiner kodet på konjugerbart elementer for mobilisering av DNA (MOB) og paring par dannelse (MPF), inkludert sex pili, som er klassifisert i henhold til MOB og MPF type3,4, 5. Det kan også påvirkes av giver og mottaker par6 til vekst i celler7,8,9,10,11,12 ( vekst, celle tetthet, solid overflate eller flytende medium, temperatur, næringsinnhold tilgjengelighet og tilstedeværelsen av kasjoner). For å forstå hvordan konjugerbart elementer spredt blant bakterier, er det nødvendig å sammenligne Bøyning frekvens i detalj.
Bøyning frekvensen mellom giver og mottaker par etter mating er vanligvis beregnet av konvensjonelle metoder slik. (i) først, telles antall giver og mottaker koloniene; (ii) deretter blir mottaker koloniene, som fikk konjugerbart elementene (= transconjugants) telt. (iii) og til slutt Bøyning frekvensen beregnes ved kolonien forming enheter (CFU) av transconjugants av donor og/eller mottakeren13. Men når du bruker denne metoden, er bakgrunnen høyt på grunn av ekstra Bøyning hendelser som kan også forekomme på selektiv platene brukes til å få transconjugants når cellen tetthet er høy10. Derfor er det vanskelig å oppdage små forskjeller i frekvens (under en 10 ganger forskjell). Vi har nylig introdusert en mest sannsynlig (MPN) metode ved hjelp av flytende medium som inneholder en høyere konsentrasjon av antibiotika. Denne metoden redusert bakgrunnen ved å hemme ytterligere bøyning i selektiv medium; Dermed kan Bøyning frekvensen anslås med høyere oppløsning.
Bøyning kan deles inn i tre trinn: (1) vedlegg av donor-mottaker par (2) initiering av konjugerbart overføring, og (3) dissosiasjon par14. Under trinn (1) og (3) er det fysisk interaksjon mellom giver og mottaker celler. Dermed kan celle tetthet og miljømessige forhold påvirke disse trinnene, men funksjonene i sex pili er også viktig. Trinn (2) er sannsynligvis regulert av uttrykk for flere gener involvert i Bøyning svar på eksterne endringer, som kan bli berørt av ulike funksjoner av plasmider, giver og mottaker. Selv om den fysiske vedlegg eller avdeling av donor-mottaker kan matematisk simuleres med en vurdering av celler som partikler, bør antallet trinn (2) måles eksperimentelt. Det har vært noen rapporter om direkte observasjoner av hvordan ofte givere kan starte Bøyning [trinn (2)] med fluorescens mikroskopi15,16; disse metodene er imidlertid ikke høy gjennomstrømming fordi et stort antall celler må overvåkes. Derfor har vi utviklet en ny metode for å beregne sannsynligheten for forekomsten av trinn (2) ved hjelp av fluorescens aktivert celle sortering (FACS). Vår metode kan brukes på noen plasmider, uten identifikasjon av viktige genene for Bøyning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av en Donor med grønne fluorescerende Protein (GFP)- og Kanamycin motstand Gene-merket plasmider
- Innføring av markør gener i målet plasmider pBP136
Merk: Målet med denne protokollen er å generere pBP136::gfp. Bakteriell stammer og plasmider brukt i denne studien er oppført i tabell 1.- Vokse kulturer av Escherichia coli DH10B skjuler pBP13617 i 5 mL steril Luria kjøttkraft (LB) og E. coli S17-1λpir18 skjuler pJBA2819 [som inneholder en kanamycin (Km)-motstand gene og gfp mut3 * gen arrangøren og terminator i en mini-Tn5] i 5 mL steril LB inneholder 50 μg/mL Km på 37 ° C over natten (O/N, 16-24 h) med skjelvende på 200 omdreininger per minutt (rpm).
- Høsting og vask
- Høste 1 mL i hver kultur, Legg den i en 2 mL microtube og sentrifuger (10.000 × g, romtemperatur, 2 min). Deretter forkaste nedbryting og resuspend celle pellet i 2 mL steril fosfat bufret saltoppløsning (PBS).
- Sentrifuger igjen (10.000 × g, romtemperatur, 2 min) og resuspend i 500 μL av sterile PBS.
- Filtrere mating
- Forberede sterilt LB plater (med 1,6% agar), og plassere et sterilt 0.22 μm pore størrelse membran filter på den. Mix 500 μL av E. coli S17-1λpir harboring pJBA28 med E. coli DH10B skjuler pBP136 og spot blandingen på filter på LB tallerkenen. Inkuber platen O/N på 30 ° C. Fjern filteret fra LB plate, Legg den i et sterilt 50 mL plastrør og legge 1 mL steril PBS.
Merk: pJBA28 replikeres i nærvær av Π protein, kodet av pir genet18, og kan overføres fra S17-1λpir til DH10B. pBP136 bærer ingen markør gen17 og kan overføres fra DH10B til S17-1λpir. Derfor kan vi ikke skille S17-1λpir skjuler pBP136 og pJBA28 fra DH10B harboring pBP136 og mini-Tn5 (transponert i Kromosom eller pBP136) på dette stadiet. Da brukte vi blandinger av dem som givere i de etterfølgende trinnene (1.1.4.–1.1.5.).
- Forberede sterilt LB plater (med 1,6% agar), og plassere et sterilt 0.22 μm pore størrelse membran filter på den. Mix 500 μL av E. coli S17-1λpir harboring pJBA28 med E. coli DH10B skjuler pBP136 og spot blandingen på filter på LB tallerkenen. Inkuber platen O/N på 30 ° C. Fjern filteret fra LB plate, Legg den i et sterilt 50 mL plastrør og legge 1 mL steril PBS.
- Vokse en O/N kultur over parring blandingen i sterilt LB inneholder 50 μg/mL Km på 37 ° C med skjelvende ved 200 rpm og en kultur for Pseudomonas putida KT2440 [Km-sensitive (Kms), og-sensitive (Rifs), Gentamicin-sensitive (Gms) og tetracycline resistente (Tcr)] i medium som inneholder 12.5 μg/mL Tc på 30 ° C med skjelvende på 200 rpm.
- Etter høsting og vaske cellene som i trinn 1.1.2, bruke dem (parring blanding og KT2440) for filteret mating (O/N, 30 ° C) som i trinn 1.1.3.
- Forberede sterilt LB plater som inneholder 50 μg/mL Km og 12,5 μg/mL Tc (LB + Km + Tc plater).
- Fortynn resuspended blandingen på membran filter med sterilt PBS (101– 105-brett), og deretter spre hver fortynning på LB + Km + Tc plater og Inkuber platene på 30 ° C i 2-3 d.
- Plukke kolonier fra platene, vokse en O/N kultur i sterilt LB inneholder Km og Tc samt P. resinovorans CA10dm4RG (Rifr og Gmr)6 i sterilt LB inneholder Rif (25 μg/mL) og Gm (30 μg/mL) på 30 ° C og 200 rpm.
Merk: Som beskrevet i forrige merknad, koloniene på LB + Km + Tc plater (fra 1.1.7.) kan KT2440 harboring pBP136 bære en mini-Tn5 og KT2440 med en mini-Tn5, fordi pJBA28 kan overføres direkte fra S17-1λpir skjuler pBP136 og pJBA28 til KT2440. Det er derfor en annen parring med P. resinovorans CA10RG er nødvendig å få målet pBP136 med en mini-Tn5 i fremgangsmåten. - Etter høsting og vaske cellene som i trinn 1.1.2, bruker du dem filteret mating (O/N, 30 ° C) som i trinn 1.1.3.
- Forberede sterilt LB plater inneholder Rif, Gm og Km (LB + Rif Km ++ Gm plater).
- Resuspend blandingen på filter og deretter fortynne den 101– 105-fold, spre den til LB + Rif Km ++ Gm plater og ruge platene for 2-3 d på 30 ° C.
- Velg koloniene og sjekk hvis de havn pBP136 av PCR bruker bestemte primere for plasmider.
- Innføring av et gen som selektiv markør i målet plasmider pCAR1
Merk: Målet med denne protokollen er å generere pCAR1::gfp- Vokse en O/N kultur av P. putida KT2440 skjuler pCAR1 (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 på 200 rpm og 30 ° C og E. coli S17-1λpir18 skjuler pJBA28 i 5 mL steril LB inneholder 50 μg/mL Km på 200 rpm og 37 ° C.
- Etter høsting og vaske cellene som i trinn 1.1.2, bruker du dem filteret mating (O/N, 30 ° C) som i trinn 1.1.3.
- Fjern filteret fra LB plate, Legg den i et sterilt 50 mL plastrør og legge 1 mL steril PBS.
- Fortynn resuspended blandingen med sterilt PBS (101– 105-brett), og spre utvannet blandingen på sterilt selektiv LB + Tc + Km plater.
Merk: pCAR1 replikerer ikke i E. coli; dermed P. putida KT2440 harboring pCAR1 med en mini-Tn5 kan velges på LB + Tc + Km plater. - Velg en koloni fra platen, og vokser en O/N kultur i sterilt LB som inneholder Km og Tc og en kultur av P. resinovorans CA10dm4RG i sterilt LB inneholder Rif og Gm (200 rpm, 30 ° C).
- Etter høsting og vask som i trinn 1.1.2, bruker du cellene filteret mating (O/N, 30 ° C) som i trinn 1.1.3.
- Resuspend blandingen på filter og deretter fortynne den spredt på LB + Rif Km ++ Gm plater og ruge platene for 2-3 d på 30 ° C.
- Velg koloniene og sjekk hvis de havn pCAR1 av PCR med bestemte primere for plasmider.
- Bekrefte omsetningsbegrensninger på merket-plasmider og forberede givere for de neste trinnene
Merk: Målet med denne protokollen er å bekrefte omsetningsbegrensninger på over konstruert plasmider og forberede givere for de neste trinnene.- Vokse en O/N kultur av P. resinovorans CA10dm4RG skjuler pBP136::gfp eller pCAR1::gfp i sterilt LB inneholder Km og en kultur for P. putida SMDBS [KmsGmsRifr, Tcr, lacI q, i hvilken PA1/O4/O3-gfpmut3* uttrykkes ikke på grunn av sin chromosomal lacIq genet]21 i 3 mL LB inneholder Tc (200 rpm, 30 ° C).
- Etter høsting og vaske cellene som i trinn 1.1.2, bruker du dem filteret mating (O/N, 30 ° C) som i trinn 1.1.3.
- Plasser filteret i et sterilt 50 mL plastrør, og resuspend med 1 mL steril PBS. Fortynn resuspended blandingen med sterilt PBS (101– 105-fold), spre utvannet blandingen på sterilt selektiv LB + Tc + Km plater.
- Velg koloniene og sjekk hvis de havn hver av Plasmidene PCR med bestemte primere.
Merk: Bekreftelse av innsetting plasseringen av mini-Tn5 av direkte sekvensering etter plasmider utvinning er valgfritt, bekrefte at innsettingspunktet ikke påvirker overføringsfunksjonen av plasmider.
2. beregning av Bøyning frekvens av MPN-metoden
- Forberede sterilt LB + Km og LB + Gm plater.
- Vokse en O/N kultur av P. putida SMDBS skjuler pBP136::gfp eller pCAR1::gfp i 3 mL steril LB inneholder Km og en kultur for P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) i 3 mL LB som inneholder Gm (140 rpm, 30 ° C).
- Etter høsting og vaske cellene som i trinn 1.1.2, kan du bruke dem for filteret parring på 30 ° C i 45 min i trinn 1.1.3.
- Serielt fortynne ovenfor giver og mottaker kultur (101 – 107) og spre den til LB + Km (giveren) eller LB + Gm (mottaker) plater (hver i tre eksemplarer) vil telle kolonien danner enheter (CFU). Inkuber platene på 30 ° C for 2 d.
- Resuspend blandingen på filteret i sterilt LB inneholder Km og Gm og serielt fortynne (fra 21 til 224– 107.2) med en 96-brønns celle kultur plate (i quadruplicate).
- Inkuber 96-brønns platen for riktig tidspunkt (2 d på 30 ° C).
- Telle CFU giver og mottaker på plater (trinn 2.4.) og telle antall brønner der transconjugants vokse.
- Beregne i MPN og dens avvik ved hjelp av MPN beregning programmet utviklet av Jarvis et al. 22, som er tilgjengelig på http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls.
- Angi navnet på eksperimentet (for eksempel, "test"), datoen for eksperimentet (ex., 2018/4/9) for test og maks. nei. av fortynninger (Skriv inn '24') i raden #7 i "Program" ark Excel-fil ("MPN_ver5.xls").
- Angi "2-1 (= 0,5) til 2-24 (= 5.96 × 10-8)" i kolonnen 'fortynning faktor d', '0,01' i 'volum i ml eller g w'kolonne- og ' 4' i ' nei. rør n ' i tabellene automatisk produsert av "inndata".
- Angi antall brønner som transconjugants vokse i hvert eksempel fortynning (0-4).
- Trykk på øvre høyre "Beregne resultatene"-knappen, og deretter hente resultatene (i MPN/μL) og deres 95% tillit grenser (nedre og øvre).
- Beregne Bøyning frekvensen av plasmider ved å dele antall transconjugants (MPN/mL) av antall giver og mottaker celler (CFU/mL).
3. forberedelse til estimering av sannsynligheten for Donor startet Bøyning
- Vokse en O/N kultur av P. putida SMDBS skjuler pBP136::gfp eller pCAR1::gfp i 3 mL steril LB inneholder Km og en kultur for P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) i 3 mL steril LB som inneholder Gm bruke 300 mL flasker (140 rpm, 30 ° C) som precultures.
- Overføre 200 μL av preculture til 200 mL frisk sterilt LB inneholder Km eller Gm i 500 mL flasker og ruge på 30 ° C med skjelvende på 140 rpm.
- Måle turbiditet på 600 nm (OD600) av kultur med en UV-VIS spektrofotometer og spot kultur, fortynnet i LB (101– 108-brett fortynninger), på en LB plate inneholder Km eller Gm. Incubate disse LB plater på 30 ° C i 1 – 2 d , og bestemme CFU.
- Tegn OD600 verdiene og CFU vekst tid å generere vekst kurver av giver og mottaker.
- Vokse kulturer av giver og mottaker belastningen til midten av Logg fase, basert på vekstkurve.
- Etter høsting og vaske cellene, forberede 101– 103 CFU fra donor i 10 μL LB og 105– 107 CFU mottakerens i 100 μL LB.
- Bland 10 μL sponsoren og 100 μL av mottakeren kulturer på forskjellige tettheter i 96-brønnen plater (i tre eksemplarer). For eksempel mix 101 CFU donor og 105 CFU mottakerens og legge den til hver av 96 brønner og mix 101 CFU fra donor og 106 CFU mottakeren i en annen 96-brønns plate, og så videre.
- Inkuber blandingen på 30 ° C i 45 minutter, og deretter legge høye konsentrasjoner av antibiotika (100 μg/mL Km og 60 μg/mL Gm) hver brønn å hemme ytterligere Bøyning.
- Inkuber platen på 30 ° C for 2 d.
- Telle antall brønner som transconjugants vokser.
- Velg mottakerens tetthet som passer for estimering av sannsynligheten for donor startet Bøyning basert på ovennevnte data (transconjugants bør finnes i minst 1 godt i en 96-brønns plate).
Merk: Transconjugants vil vokse i alle brønnene når tettheter giver og mottaker cellene er høy og flere Bøyning oppstår i en brønn. Derimot vil ingen transconjugants bli funnet i noen brønner når cellen tetthet er for lavt. Nedenfor sorteres en enkelt giver celle i en brønn. Derfor bør mottaker tetthet være på maksimalt.
4. estimering av sannsynligheten for Donor startet Bøyning
- Forberede 200 mL av en midt Logg fase kultur av donor P. putida SMDBS skjuler pBP136::gfp eller pCAR1::gfp og at mottakeren P. putida KT2440RGD, som beskrevet i 3.6-3.7.
- Sted 106 CFU mottakerens i 100 μL LB i hver brønn av en 96-brønns plate.
- Definere FACS-systemet (flyt cytometri og cellen sorter med en robotarm, en 488 nm argon laser og en 70 μm munnstykke munning). Angi frem xy (FSC), med en 1% terskel som oppkjøpet utløser. Justere H gevinst og en gevinst på FSC og siden scatter (SSC) på maksimal følsomhet, noe som kan utelukke falske positive signaler, med PBS som en negativ kontroll. Sett Sorter porten basert på FSC og SSC og 0,5 slipp Sorteringsmodus for maksimal Sorter renhet.
- Sorter en enkelt giver celle av FACS en LB plate (384 ulike flekker), ruge platen på 30 ° C i 2 d, og teller hvor mange koloniene vises på platen fra sorterte celler.
Merk: Denne prosedyren er for validering av Angi porten. Hvis det er 384 kolonier på tallerkenen, betyr det at 100% av sortert cellene kunne danne kolonier. Gjennomsnittlig gyldigheten av sortering er alltid 90-95%. - Sortere en enkelt giver celle av FACS i hver brønn av en 96-brønns plate med mottakeren (4.2).
- Inkuber platen i 45 min på 30 ° C, og deretter legge høye konsentrasjoner av antibiotika (100 μg/mL Km og 60 μg/mL Gm) hver brønn å hindre ytterligere Bøyning.
- Inkuber platen på 30 ° C for 2 d.
- Antall brønner som transconjugants vokste som bestemmes av visuell inspeksjon med det blotte øye.
- Beregne sannsynligheten for donor startet Bøyning ved antall brønner med transconjugants ved antall brønner som donor ble sortert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammenligning av Bøyning frekvens av MPN-metoden
I vår forrige rapport, vi sammenlignet Bøyning frekvenser av pBP136::gfp og pCAR1::gfp i tre-fold utvannet LB (1/3 LB) flytende medium med ulike gripende priser etter en 45 min mating bruker 125 mL spinner kolber10. Vi sammenlignet Bøyning frekvenser av pBP136::gfp og pCAR1::gfp med 106 CFU/mL av giver og mottaker stammer under ulike gripende forhold (0-600 rpm). Bøyning frekvensen av både plasmider økt på høyere gripende priser, og den maksimale forskjellen i Bøyning frekvensen var < 10 ganger for pBP136::gfp (mellom 0 og 400 rpm), mens det av pCAR1::gfp var ~ 25-fold (mellom 0 og 200 rpm; Fig. 1).
Estimering av sannsynligheten for donor startet Bøyning
Den tidligere estimerte sannsynligheten for donor startet Bøyning vises i tabell 2. For å bestemme tettheten av mottakeren celler må sammenligne sannsynligheten for Bøyning, mating analyser ble utført med forskjellige tettheter på giver og mottaker. Som vist i tabell 2pBP136::gfp transconjugants ble oppdaget i 100% (96/96) brønner som inneholder 103 CFU giver og 105-107 CFU mottakeren og de med 102 CFU giver og 106-107 CFU mottakeren, som angir at celle tetthet var for høy. Parring analyser med 101 CFU giver og 106 eller 105 CFU mottakeren resulterte i en redusert antall transconjugant-positive brønner (66% og 2,1%, henholdsvis tabell 2). Dermed > 105 CFU mottakeren var spådd for å bli nødvendig for mating med en enkelt giver celle. Tilsvarende vi utført parring analyser med pCAR1::gfp på forskjellige tettheter av giver og mottaker stammer. Prosentene av transconjugant-positive var mye lavere enn pBP136::gfp (tabell 2). Forutsatt at giver og mottaker cellene kan knytte til hverandre på samme måte, var sannsynligheten for Bøyning innvielse for pCAR1 donor lavere enn for pBP136 donor. Basert på disse resultatene, vi bestemte at 107 CFU mottakeren var nødvendig for en enkelt giver celle sortert etter FACS.
Deretter ble antall transconjugant-positive brønner regnet. Prosentandelen av transconjugant-positive brønner for pBP136::gfp var større (1,9%) enn for pCAR1::gfp (< 0.052%. Tabell 2). Dermed var det mer enn en 36-fold forskjell i sannsynligheten for donor startet Bøyning mellom disse to plasmider.
Figur 1. Sammenligning av Bøyning frekvenser av pBP136::gfp og pCAR1::gfp med 106 kolonien danner enheter (CFU) mL-1 av donor (Pseudomonas putida SMDBS) og mottakeren (P. putida KT2440RGD) på forskjellige røring priser (0-600 rpm). Feilfeltene ble beregnet basert på 95% tillit grenser av metoden MPN og standardavviket for CFU giver og mottaker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Bakteriell stammer | Undersøke og relevante fenotypen | Referanse eller kilde |
| Escherichia coli DH10B | F-, mcrA, Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80dlacZΔM15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ (ara leu) 7697, galU, galK , Λ-, rpsL, endA1, nupG | Thermo |
| E. coli S17-1(λpir) | TMrSmr recA, thi, pro, hsdR-M+, RP4: 2-Tc: Mu: Km Tn7 λpir | 18 |
| Pseudomoans putida KT2440 | Kms, Rifs, Gms, Tcr | 25 |
| Pseudomoans putida KT2440(pCAR1) | KT2440 harboring pCAR1 | 20 |
| Pseudomoans putida KT2440RGD | Kms, Rifr, Gmr, Tcr miniTn7(Gm) PA1/O4/O3DsRedExpress-en er inseted i kromosom | 10 |
| Pseudomoans putida SMDBS | Avledede stamme av P. putida KT2440, dapB-slettet, Kms, Gms, Rifr, Tcr, lacIq settes i kromosom | 21 |
| P. resinovorans CA10RG | Kms, Rifr, Gmr, Tcs | 6 |
| Plasmider | ||
| pBP136 | IncP-1, MOBP, MPFT plasmider | 17 |
| pBP136::gfp | pBP136 bærer Kmr og PA1/04/03-gfp kassett i parA (26,137 nt) | 21 |
| pCAR1 | IncP-7, MOBH, MPFF, carbazole degradative plasmider | 26, 27 |
| pCAR1::gfp | pCAR1 bærer Kmr og PA1/04/03-gfp kassett i ORF171 (182,625 nt) | 21 |
| pJBA28 | AprKmr, levering plasmider mini-Tn5Km-pA1/04/03- RBSII-gfpmut3*-T0-T1 | 18 |
Tabell 1. Bakteriell stammer og plasmider.
| Plasmider | en Donor | en Mottakeren | Antall brønner med transconjugants per 96 brønner | Prosent |
| [CFUs eller celle] | [CFUs] | [%] | ||
| pBP136::gfp | 103 | 107 | 96/96 | 100 |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 96/96 | 100 | ||
| 102 | 107 | 96/96 | 100 | |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 54/96 | 56 | ||
| 101 | 107 | 71/96 | 74 | |
| 106 | 63/96 | 66 | ||
| 105 | 2/96 | 2.1 | ||
| 1 | 107 | 23/1212 | 1.9 | |
| pCAR1::gfp | 103 | 107 | 6/96 | 6.3 |
| 106 | 6/96 | 6.3 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 102 | 107 | 1/96 | 1 | |
| 106 | 1/96 | 1 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 101 | 107 | 0/96 | 0 | |
| 106 | 0/96 | 0 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 1 | 107 | 1/1920 | < 0.052 |
Tabell 2. Antall brønner med ulike celle tettheter, som inneholder transconjugants for å sammenligne sannsynligheten for donor startet Bøyning mellom pBP136::gfp og pCAR1::gfp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en høyoppløselig protokoll for å oppdage forskjeller i Bøyning frekvens under ulike forhold, med en MPN-metode til å beregne antall transconjugants. En viktig del av protokollen er fortynne blanding av giver og mottaker etter parring inntil ingen transconjugants vokse. Et annet skritt er å legge høye konsentrasjoner av antibiotika til selektiv flytende medium å hindre ytterligere Bøyning. Disse prosedyrene kan redusere bakgrunnen forårsaket av ytterligere bøyning i selektiv medium. Vi kunne oppdage forskjeller, selv etter en kort parring varighet mellom giver og mottaker. Konjugerbart frekvensen beregnet av denne protokollen kan endres av små forskjeller i vekst forhold av påkjenningene giver og mottaker. Dermed bør disse forholdene være utformet.
I tillegg presenterer vi en protokoll for å estimere andre trinn i Bøyning ved hjelp av FACS enkeltmarkedet donor celle sortering. Viktigste i denne protokollen er å avgjøre riktig tettheten av mottakeren celler for en sortert enkeltmarkedet donor celle. Når antall mottaker celler rundt en enkelt giver celle er stor nok, fysisk kontakt mellom giver og mottaker er sikkert. Deretter kan Bøyning frekvensen påvirkes, ikke av sannsynligheten for hvor ofte giver og mottaker cellene kontakt med hverandre, men av sannsynligheten for donor startet Bøyning. Sortere en enkelt giver celle av FACS er ikke vanskelig; 96 brønner er imidlertid ikke alltid tilstrekkelig til å anslå sannsynligheten. Derfor bør 10-100 plater være forberedt. En av grensene for protokollen er at det ikke er riktig for å måle sannsynligheten for donor startet Bøyning av en plasmider med lavfrekvent transmissibility.
Basert på disse metodene og deres resultater, rapportert vi nylig at to plasmider viste ulike Bøyning frekvenser i flytende media ved å endre den gripende prisen, som kan påvirke de første og tredje trinnene Bøyning, vedlegg og avløsning av donor-mottaker parene. I tillegg fant vi også forskjeller i sannsynligheten for andre trinn10. Disse resultatene viser hvordan Bøyning frekvensen endres under ulike forhold. Disse protokollene er nyttige for sammenligning funksjonene Bøyning av plasmider under ulike forhold, herunder aerob / anaerob trening forhold, forskjellige donor-mottaker par, annen temperatur eller pH, og i tilstedeværelse eller fravær av kjemikalier, som kasjoner, næringsstoffer og antibiotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. K. Kamachi av National Institute av smittsomme sykdommer (Japan) for å gi pBP136 og Prof. Dr. H. Nojiri ved University of Tokyo (Japan) for å gi pCAR1. Vi er også takknemlige for Professor Dr. Molin Sølen av Danmarks tekniske universitet for å gi pJBA28. Dette arbeidet ble støttet av JSPS KAKENHI (Grant tall 15H 05618 og 15KK0278) til MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
- Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F.
- Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
- Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
- Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
- Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
- Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
- Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).
- Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
- Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
- Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
- Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
- Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E.
- Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
- Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
- Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
- Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
- Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
- Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
- Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
- Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
- Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).
