Summary
Med syfte att förstå beteenden av olika bakteriella konjugering DNA-element under olika förhållanden, beskriver vi ett protokoll för att upptäcka skillnader i konjugation frekvens, med hög upplösning, att uppskatta hur effektivt bakterien givare initierar konjugation.
Abstract
Bakteriell konjugation är ett viktigt steg i horisontell överföring av antibiotikaresistensgener via ett konjugering DNA-element. Djupgående jämförelser av konjugation frekvens under olika villkor krävs för att förstå hur elementet konjugering sprids i naturen. Konventionella metoder för att jämföra konjugation frekvens är dock inte lämplig för djupgående jämförelser på grund av den höga bakgrund som orsakas av förekomsten av ytterligare konjugation händelser på selektiv plattan. Vi har lyckats minska bakgrunden genom att införa en metod med mest troliga antal i (MPN) och en högre koncentration av antibiotika för att förhindra ytterligare konjugation i selektiva flytande medium. Dessutom utvecklade vi ett protokoll för att uppskatta sannolikheten för hur ofta givare celler initiera konjugation genom att sortera enda donatorcellerna i mottagarens pooler av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS). Använder två plasmider, kunde pBP136 och pCAR1, skillnaderna i konjugation frekvens i Pseudomonas putida celler detekteras i flytande medium på olika omrörning priser. Frekvenserna av konjugation inledande var högre för pBP136 än för pCAR1. Med hjälp av dessa resultat, kan vi bättre förstå de konjugation funktionerna i dessa två plasmider.
Introduction
Bakteriell Konjugation av mobila genetiska element, konjugering plasmider och integrativ och konjugering element (ICEs) är viktigt för horisontell spridning av genetisk information. Det kan främja snabb bakteriell evolution och anpassning och överföra multidrug resistance gener1,2. Konjugation frekvensen kan påverkas av proteiner som kodas på konjugering element för mobilisering av DNA (MOB) och parning par bildandet (MPF), inklusive sex pili, som klassificeras enligt MOB och MPF typ3,4, 5. Det kan också påverkas av givare och mottagare par6 och tillväxten villkorar av celler7,8,9,10,11,12 ) tillväxttakten, cell densiteten, fast yta eller flytande medium, temperatur, näringsämne tillgänglighet och närvaro av katjoner). För att förstå hur konjugering element sprids bland bakterier, är det nödvändigt att jämföra konjugation frekvens i detalj.
Konjugation frekvensen mellan givare och mottagare par efter parning uppskattas oftast av konventionella metoder som följer. (i) först, numrerar av givare och mottagare kolonier räknas; (ii) sedan, mottagarens kolonierna, som mottog konjugering elementen (= transconjugants) räknas; (iii) och slutligen konjugation frekvensen beräknas genom att dividera de kolonibildande enheter (CFU) i transconjugants av dem av givaren eller mottagaren13. Men när du använder denna metod, är bakgrunden hög på grund av ytterligare konjugation händelser som kan också uppstå på selektiv plattor används för att få transconjugants när cell densiteten är hög10. Därför är det svårt att upptäcka små skillnader i frekvens (under en 10-faldig skillnad). Vi har nyligen infört en mest troliga antal (MPN) metod med flytande medium som innehåller en högre koncentration av antibiotika. Denna metod minskar bakgrunden genom att hämma ytterligare konjugation i selektivt medium; Konjugation frekvensen kunde således beräknas med högre upplösning.
Konjugation kan delas in i tre steg: (1) utmätning av den givare-mottagaren par (2) inledandet av konjugering överföring, och (3) dissociation av par14. Under steg (1) och (3) finns det fysiska samspelet mellan givaren och mottagaren celler; Således, cell densiteten och miljöförhållanden kan påverka dessa steg, även om funktionerna i de kön pili är också viktiga. Steg (2) regleras sannolikt av uttrycket av flera gener inblandade i konjugering som svar på yttre förändringar, som skulle kunna påverkas av olika funktioner av plasmid, givare och mottagare. Även om den fysiska fastsättning eller avlossning av givare-mottagare par kan simuleras matematiskt med hjälp av en uppskattning av celler som partiklar, bör frekvensen av steg (2) mätas experimentellt. Det har förekommit några rapporter om direkta observationer av hur ofta givare kan initiera konjugation [steg (2)] med hjälp av fluorescence mikroskopi15,16; dessa metoder är dock inte hög genomströmning eftersom ett stort antal celler måste övervakas. Därför har vi utvecklat en ny metod för att uppskatta sannolikheten för förekomst av steg (2) med hjälp av fluorescens aktiverad cell sortering (FACS). Vår metod kan tillämpas på någon plasmid, utan identifiering av viktiga gener för konjugation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av en givare med grönt fluorescerande Protein (GFP)- och Kanamycin motstånd gen-taggade plasmider
- Införandet av markörgener i det målet plasmiden pBP136
Obs: Målet med detta protokoll är att generera pBP136::gfp. De bakteriestammar och plasmider som används i denna studie visas i tabell 1.- Odla kulturer av Escherichia coli DH10B hysande pBP13617 i 5 mL steril Luria buljong (LB) och E. coli S17-1λpir18 härbärgerat pJBA2819 [som innehåller en kanamycin (Km)-resistens genen och gfp mut3 * gen med arrangören och terminator i en mini-Tn5] i 5 mL steril LB innehållande 50 μg/mL Km vid 37 ° C över natten (O/N, 16 – 24 h) med skakar på 200 varv per minut (rpm).
- Skörd och tvättning
- Skörda 1 mL av varje kultur, placera det i en 2 mL mikrorör och centrifugera (10 000 × g, rumstemperatur, 2 min). Sedan Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 2 mL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Centrifugera igen (10 000 × g, rumstemperatur, 2 min) och återsuspendera i 500 μL av steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- Filtrera parning
- Förbereda sterila LB plattor (med 1,6% agar), och placera ett membranfilter för sterila 0,22 μm porstorlek storlek på den. Blanda 500 μL E. coli S17-1λpir hysande pJBA28 med E. coli DH10B hysande pBP136 och spot blandningen på filtret på LB plattan. Inkubera plattan O/N vid 30 ° C. Ta bort filtret från LB plattan, placera det i en steril 50 mL plaströr och tillsätt 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
Obs: pJBA28 kan replikera i närvaro av Π protein, kodad av pir genen18, och kan överföras från S17-1λpir till DH10B. pBP136 bär ingen markör gen17 och kan överföras från DH10B till S17-1λpir. Därför kunde vi inte urskilja S17-1λpir härbärgerat pBP136 och pJBA28 från DH10B hysande pBP136 och mini-Tn5 (införlivats i den kromosom eller pBP136) i detta skede. Sedan använde vi blandningar av dem som givare i efterföljande steg (1.1.4.–1.1.5.).
- Förbereda sterila LB plattor (med 1,6% agar), och placera ett membranfilter för sterila 0,22 μm porstorlek storlek på den. Blanda 500 μL E. coli S17-1λpir hysande pJBA28 med E. coli DH10B hysande pBP136 och spot blandningen på filtret på LB plattan. Inkubera plattan O/N vid 30 ° C. Ta bort filtret från LB plattan, placera det i en steril 50 mL plaströr och tillsätt 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- Växer en O/N kultur av ovanstående parning blandningen i sterila LB innehållande 50 μg/mL Km vid 37 ° C med skakningar vid 200 rpm och en kultur av Pseudomonas putida KT2440 [Km-känsliga (Kms), rifampicin-känsliga (Rifs), gentamicin-känsliga (Gms) och tetracyklin resistenta (Tcr)] i medium innehållande 12,5 μg/mL Tc vid 30 ° C under skakning på 200 rpm.
- Efter skörd och tvättning cellerna som i steg 1.1.2 använda dem (parning blandning och KT2440) för filter parning (O/N, 30 ° C) som i steg 1.1.3.
- Förbereda sterila LB plattor som innehåller 50 μg/mL Km och 12,5 μg/mL Tc (LB + Km + Tc plattor).
- Späd den återsuspenderade blandningen på membranfiltret med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (101– 105-vik), och sedan sprids varje utspädning på LB + Km + Tc plattor och inkubera plattorna vid 30 ° C för 2 – 3 d.
- Plocka kolonier från plattorna, växer en O/N kultur i sterila LB som innehåller Km samt Tc och P. resinovorans CA10dm4RG (Rifr och Gmr)6 i sterila LB som innehåller Rif (25 μg/mL) och Gm (30 μg/mL) vid 30 ° C och 200 rpm.
Obs: Som beskrivs i föregående not, kolonierna på LB + Km + Tc tallrikar (från 1.1.7.) kan KT2440 hysande pBP136 bära en mini-Tn5 och KT2440 med en mini-Tn5, eftersom pJBA28 kunde överföras direkt från S17-1λpir hysande pBP136 och pJBA28 till KT2440. Det är därför en annan parning med P. resinovorans CA10RG krävs för att få det målet pBP136 med en mini-Tn5 i följande steg. - Efter skörd och tvätta cellerna som i steg 1.1.2, använda dem för filter parning (O/N, 30 ° C) som i steg 1.1.3.
- Förbereda sterila LB plattor som innehåller Rif, Gm och Km (LB + Rif + Km + Gm plattor).
- Återsuspendera blandningen på filtret och späd sedan denna 101– 105-vik, sprida det på LB + Rif + Km + Gm plattor och inkubera plattorna för 2 – 3 d vid 30 ° C.
- Plocka kolonierna och kontrollera om de hyser pBP136 med PCR med specifika primers för Plasmiden.
- Införandet av en selektiv markörgen i det målet plasmiden pCAR1
Obs: Målet med detta protokoll är att generera pCAR1::gfp- Växer en O/N kultur av P. putida KT2440 hysande pCAR1 (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 på 200 rpm och 30 ° C och E. coli S17-1λpir18 härbärgerat pJBA28 i 5 mL steril LB innehållande 50 μg/mL Km vid 200 rpm och 37 ° C.
- Efter skörd och tvätta cellerna som i steg 1.1.2, använda dem för filter parning (O/N, 30 ° C) som i steg 1.1.3.
- Ta bort filtret från LB plattan, placera det i en steril 50 mL plaströr och tillsätt 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- Späd den återsuspenderade blandningen med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (101– 105-vik), och sprida den utspädda blandningen på sterila selektiv LB + Tc + Km plattor.
Obs: pCAR1 inte replikeras i E. coli; Således, P. putida KT2440 hysande pCAR1 med en mini-Tn5 kan väljas på LB + Tc + Km plattor. - Plocka en koloni från plattan, och växa en O/N kultur i sterila LB som innehåller Km och Tc och en kultur av P. resinovorans CA10dm4RG i sterila LB som innehåller Rif och Gm (200 rpm, 30 ° C).
- Efter skörd och tvättning som i steg 1.1.2 använda cellerna för filter parning (O/N, 30 ° C) som i steg 1.1.3.
- Återsuspendera blandningen på filtret och sedan späda ut det, breds på LB + Rif + Km + Gm plattor och inkubera plattorna för 2 – 3 d vid 30 ° C.
- Plocka kolonierna och kontrollera om de hyser pCAR1 med PCR med specifika primrar för Plasmiden.
- Bekräfta överförbarheten av de taggade-plasmidsna och förbereda givarna för nästa steg
Obs: Målet med detta protokoll är att bekräfta överförbarheten av de ovan Byggyta plasmidsna och förbereda givarna för nästa steg.- Växer en O/N kultur av P. resinovorans CA10dm4RG hysande pBP136::gfp eller pCAR1::gfp i sterila LB som innehåller Km och en kultur av P. putida SMDBS [Kms, Gms, Rifr, Tcr, Lindgren q, där PA1/O4/O3-gfpmut3* uttrycks inte på grund av dess kromosomala lacIq gen]21 3 ml LB som innehåller Tc (200 rpm, 30 ° C).
- Efter skörd och tvätta cellerna som i steg 1.1.2, använda dem för filter parning (O/N, 30 ° C) som i steg 1.1.3.
- Placera filtret i ett sterilt 50 mL plaströr och blandas med 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Späd den återsuspenderade blandningen med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (101– 105-vik), sprida den utspädda blandningen på sterila selektiv LB + Tc + Km plattor.
- Plocka kolonierna och kontrollera om de harbor varje av plasmidsna med PCR med specifika primers.
Obs: Bekräftelse av positionen införande av mini-Tn5 av sekvensering efter plasmid extraktion är valfritt, att bekräfta att insättningspunkten inte påverkar överföringsfunktionen av plasmidsna.
2. beräkning av konjugation frekvens av metoden MPN
- Förbereda sterila LB + Km och LB + Gm plattor.
- Växer en O/N kultur av P. putida SMDBS hysande pBP136::gfp eller pCAR1::gfp 3 ml steril LB som innehåller Km och en kultur av P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) 3 ml LB som innehåller Gm (140 rpm, 30 ° C).
- Efter skörd och tvätta cellerna som i steg 1.1.2, använda dem för filter parning vid 30 ° C i 45 min som i steg 1.1.3.
- Seriellt utspädd ovanstående givare och mottagare kultur (101 – 107) och sprida det på LB + Km (givare) eller LB + Gm (mottagaren) plattor (vardera i tre exemplar) för att räkna de kolonibildande enheter (CFU). Inkubera plattorna vid 30 ° C i 2 d.
- Återsuspendera blandningen på filtret i sterila LB som innehåller Km och Gm och seriellt späd (från 21 till 224– 107,2) med en platta med 96 brunnar cell i kultur (i fyra exemplar).
- Inkubera i plattan med 96 brunnar i lämplig tidpunkt (2 d vid 30 ° C).
- Räkna CFU av givare och mottagare på plattorna (steg 2,4.) och räkna antalet brunnar där transconjugants växa.
- Beräkna MPN och dess avvikelse med hjälp av MPN beräkningen programmet utvecklats av Jarvis et al. 22, som finns på http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls.
- Ange namnet på experimentet (ex., 'test'), datum för experimentet (ex., 2018/4/9), antalet test serier och max. Nej. utspädningar (ange '24') i raden #7 i det 'programmet' blad av Excel-fil ('MPN_ver5.xls').
- Ange ' 2-1 (= 0,5) till 2-24 (= 5.96 × 10-8)' i kolumnen 'utspädning faktor d', '0,01' i kolumnen 'volym i ml eller g w'och ' 4' i ' nr. av rör n' i tabellerna automatiskt producerade av 'dataunderlag'.
- Ange antalet brunnar där transconjugants växa på varje provspädning (0 – 4).
- Tryck den övre högra 'Beräkna resultat'-knappen, och sedan få resultatet (i MPN/μL) och deras 95% konfidensintervall (nedre och övre).
- Beräkna konjugation frekvensen av plasmidsna genom att dividera antalet transconjugants (MPN/mL) av antalet givare och mottagare celler (CFU/mL).
3. förberedelser för uppskattning av sannolikheten för givare-initierade konjugation
- Växer en O/N kultur av P. putida SMDBS hysande pBP136::gfp eller pCAR1::gfp 3 ml steril LB som innehåller Km och en kultur av P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) 3 ml steril LB som innehåller Gm med 300 mL kolvar (140 rpm, 30 ° C) som precultures.
- Överföra 200 μL av preculture i 200 mL färsk sterila LB innehållande Km eller Gm i 500 mL kolvar och inkubera vid 30 ° C med skakningar vid 140 rpm.
- Mäta grumligheten på 600 nm (OD600) av kulturen med hjälp av en UV-VIS spektrofotometer och spot kulturen, utspädd i LB (101– 108-vik utspädningar), på en LB skylt som innehåller Km eller Gm. Inkubera dessa LB plattorna vid 30 ° C för 1 – 2 d , och bestämma CFU.
- Rita OD600 -värdena och CFU med tillväxt tid att generera tillväxtkurvor av givare och mottagare.
- Växa kulturer av givare och mottagare stammen till mitten av log fas, baserat på tillväxtkurvan.
- Efter skörd och tvätta cellerna, förbereda 101– 103 CFU givarens i 10 μL av LB och 105– 107 CFU av mottagaren i 100 μL av LB.
- Blanda 10 μL av givaren och 100 μL av mottagarens kulturer vid olika tätheter i 96 brunnar (i tre exemplar). Till exempel blanda 101 CFU av givaren och 105 CFU av mottagaren och lägga till varje 96 brunnarna, och blanda 101 CFU givarens och 106 CFU av mottagaren i en annan plattan med 96 brunnar, och så vidare.
- Inkubera blandningen vid 30 ° C i 45 min och Lägg sedan till höga koncentrationer av antibiotika (100 μg/mL Km och 60 μg/mL Gm) till varje brunn för att förhindra ytterligare konjugation.
- Inkubera plattan vid 30 ° C i 2 d.
- Räkna antalet brunnar där transconjugants växer.
- Välj mottagarens densitet som är lämplig för uppskattning av sannolikheten för givare-initierade konjugation baserat på ovanstående data (transconjugants ska finnas i minst 1 väl av en plattan med 96 brunnar).
Obs: Transconjugants kommer att växa i alla brunnar när tätheterna av givare och mottagare cellerna är hög och mer än en konjugation inträffar i en brunn. Däremot hittas ingen transconjugants i alla brunnar när cell densiteten är låg. I följande avsnitt sorteras en enda donator cell i en brunn. Därför bör mottagaren densiteten högst.
4. uppskattning av sannolikheten för givare-initierade konjugation
- Förbereda 200 mL av en halva log fas kultur av givare P. putida SMDBS hysande pBP136::gfp eller pCAR1::gfp och att mottagarens P. putida KT2440RGD, som beskrivs i 3,6 – 3,7.
- Plats 106 CFU av mottagaren i 100 μL av LB i varje brunn en plattan med 96 brunnar.
- Ställa in systemets FACS (flöde flödescytometri och cell sorterare med en robotarm och en 488 nm argon laser strypmunstycke 70 μm munstycke). Inställt framåt scatter (FSC), med en 1% tröskel som förvärvet utlöser. Tune H förstärkningen och en vinst för FSC och side scatter (SSC) på maximal känslighet, vilket kan utesluta falska positiva signaler, med PBS som en negativ kontroll. Ställ in stadsporten sortera baserat på FSC och SSC och 0,5 droppe sorteringsläge för maximal sortera renhet.
- Sortera en enda donator cell av FACS på en LB skylt (384 olika ställen), inkubera plattan vid 30 ° C i 2 d, och sedan räkna hur många kolonier visas på plattan från sorterade cellerna.
Obs: Detta förfarande är för validering av set grinden. Om det finns 384 kolonier på tallriken, betyder det att 100% av de sorterade cellerna kunde bilda kolonier. Genomsnittliga giltigheten av sorteringen är alltid 90 – 95%. - Sortera en enda donator cell av FACS i varje brunn av en plattan med 96 brunnar med mottagaren (4.2).
- Inkubera plattan för 45 min vid 30 ° C, och sedan lägga till höga koncentrationer av antibiotika (100 μg/mL Km och 60 μg/mL Gm) till varje brunn för att förhindra ytterligare konjugation.
- Inkubera plattan vid 30 ° C i 2 d.
- Räkna antalet brunnar där transconjugants växte som bestäms av okulärbesiktning med blotta ögat.
- Beräkna sannolikheten för givare-initierade konjugation genom att dividera antalet brunnar med transconjugants av det totala antalet brunnar där givaren var sorterade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jämförelse av konjugation frekvens av metoden MPN
I vårt tidigare betänkande, Vi jämförde konjugation frekvenserna av pBP136::gfp och pCAR1::gfp i three-fold utspädda LB (1/3 LB) flytande medium med olika omrörning priser efter en 45 min parning med 125 mL spinner kolvar10. Vi jämförde konjugation frekvenserna av pBP136::gfp och pCAR1::gfp med 106 CFU/mL av givare och mottagare stammar under olika omrörning förhållanden (0-600 rpm). Konjugation frekvensen av båda plasmider ökade omrörning högre, och den maximala skillnaden i konjugation frekvensen var < 10-faldig för pBP136::gfp (mellan 0 och 400 rpm), medan pCAR1::gfp var ~ 25-fold (mellan 0 och 200 rpm; (Se fig. 1).
Uppskattning av sannolikheten för givare-initierade konjugation
Den tidigare uppskattade sannolikheten för givare-initierade konjugation visas i tabell 2. För att bestämma tätheten av mottagarens celler krävs att jämföra sannolikheten för konjugation, parning analyser utfördes med olika tätheter av givare och mottagare. Som visas i tabell 2, pBP136::gfp transconjugants upptäcktes i 100% (96/96) av brunnar innehållande 103 CFU för givare och 105-107 CFU av mottagaren, och de med 102 CFU för givare och 106-107 CFU av mottagaren, vilket indikerar att cell densiteten var för hög. Parning analyser med 101 CFU för givare och 106 eller 105 CFU av mottagaren resulterade i ett minskat antal transconjugant-positiva brunnar (66% och 2,1%, respektive, tabell 2). Således, > 105 CFU av mottagaren förutspåddes för att krävas för parning med en enda donator cell. Likaså vi utfört de parning analyserna med pCAR1::gfp vid olika tätheter av givare och mottagare stammar. Procentsatserna för transconjugant-positiva brunnar var mycket lägre än de av pBP136::gfp (tabell 2). Antar att givare och mottagare cellerna kan bifoga till varandra på samma sätt, var sannolikheten för konjugation initiering för pCAR1 givaren lägre än för pBP136 givaren. Baserat på dessa resultat vi fastställt att 107 CFU av mottagaren krävdes för en enda donator cell sorterade efter FACS.
Sedan räknades antalet transconjugant-positiva brunnar. Andelen transconjugant-positiva brunnar för pBP136::gfp var större (1,9%) än för pCAR1::gfp (< 0.052%; (Se tabell 2). Det var alltså mer än en 36-fold skillnad i sannolikheten för givare-initierade konjugation mellan dessa två plasmider.
Figur 1. Jämförelse av konjugation frekvenserna av pBP136::gfp och pCAR1::gfp med 106 kolonin bildar enheter (CFU) mL-1 av donator (Pseudomonas putida SMDBS) och mottagaren (P. putida KT2440RGD) på olika omrörning priser (0-600 rpm). Felstaplar var beräknas baserat på 95% konfidensintervall av metoden MPN och standardavvikelsen för CFU för givare och mottagare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Bakteriestammar | Genotyp och relevent fenotyp | Referens eller källa |
| Escherichia coli DH10B | F–, mcrA, Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80d ΔlacX74, recA1, deoR,LindholmΔM15, araD139, Δ (ara leu) 7697, galU, galK , Λ–, rpsL, endA1, nupG | Thermo |
| E. coli S17-1(λpir) | TMrSmr, recA, thi, pro, hsdR–M+, RP4: 2-Tc: Mu: Km Tn7 λpir | 18 |
| Pseudomoans putida KT2440 | Kms, Rifs, Gms, Tcr | 25 |
| Pseudomoans putida KT2440(pCAR1) | KT2440 hysande pCAR1 | 20 |
| Pseudomoans putida KT2440RGD | Tcr, miniTn7, Gmr, Rifr, kms(Gm) PA1/O4/O3DsRedExpress-en är inseted i kromosomen | 10 |
| Pseudomoans putida SMDBS | Härledda stam av P. putida KT2440, dapB-bort, Kms, Gms, Rifr, Tcr, Lindgrenq sätts i kromosomen | 21 |
| P. resinovorans CA10RG | Kms, Rifr, Gmr, Tcs | 6 |
| Plasmider | ||
| pBP136 | IncP-1, MOBP, MPFT plasmid | 17 |
| pBP136::gfp | pBP136 transporterar Kmr och PA1/04/03-gfp kassett i parA (26,137 nt) | 21 |
| pCAR1 | IncP-7, MOBH, MPFF, karbazol nedbrytningsvägar plasmid | 26, 27 |
| pCAR1::gfp | pCAR1 transporterar Kmr och PA1/04/03-gfp kassett i ORF171 (182,625 nt) | 21 |
| pJBA28 | APr, Kmr, leverans plasmid för mini-Tn5-Km-PA1/04/03- RBSII-gfpmut3*-T0-T1 | 18 |
Tabell 1. Bakteriestammar och plasmider.
| Plasmid | en Givare | en Mottagare | Numrerar av brunnarna med transconjugants per 96 brunnarna | Andel |
| [CFUs eller cell] | [CFUs] | [%] | ||
| pBP136::gfp | 103 | 107 | 96/96 | 100 |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 96/96 | 100 | ||
| 102 | 107 | 96/96 | 100 | |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 54/96 | 56 | ||
| 101 | 107 | 71/96 | 74 | |
| 106 | 63/96 | 66 | ||
| 105 | 2/96 | 2.1 | ||
| 1 | 107 | 23/1212 | 1.9 | |
| pCAR1::gfp | 103 | 107 | 6/96 | 6.3 |
| 106 | 6/96 | 6.3 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 102 | 107 | 1/96 | 1 | |
| 106 | 1/96 | 1 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 101 | 107 | 0/96 | 0 | |
| 106 | 0/96 | 0 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 1 | 107 | 1/1920 | < 0.052 |
Tabell 2. Antalet brunnar, med annan cell densiteter, som innehåller transconjugants för att jämföra sannolikheten för givare-initierade konjugation mellan pBP136::gfp och pCAR1::gfp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi ett högupplöst protokoll för att upptäcka skillnader i konjugation frekvens under olika förhållanden, med en MPN metod för att uppskatta antalet transconjugants. Ett viktigt steg i protokollet att späda ut blandningen av givare och mottagare efter parning tills ingen transconjugants växer. Ett annat steg är att lägga till höga koncentrationer av antibiotika till selektiva flytande medium att förhindra ytterligare konjugation. Dessa förfaranden kan minska bakgrunden orsakas av ytterligare konjugation i det selektivt mediet. Vi kunde identifiera skillnader, även efter en kortvarig parning mellan givaren och mottagaren. Konjugering frekvensen beräknas genom detta protokoll skulle kunna ändras av små skillnader i tillväxten villkorar av givare och mottagare stammar. Dessa villkor bör således utformas omsorgsfullt.
Dessutom presenterar vi ett protokoll för att uppskatta det andra steget i konjugering med FACS för enskilda givaren cell sortering. Det viktigaste steget i detta protokoll är att bestämma den lämpliga djurtäthet mottagarens celler för en sorterad enda donator cell. När antalet mottagare celler kring en enda donator cell är tillräckligt stor, fysisk kontakt mellan givaren och mottagaren är vissa. Sedan, konjugation frekvensen kan påverkas, inte av sannolikheten för hur ofta givare och mottagare cellerna kontakta varandra, men av sannolikheten för givare-initierade konjugation. Sortera en enda donator cell av FACS är inte svårt; 96 brunnarna är dock inte alltid tillräcklig för att uppskatta sannolikheten. 10-100 plattor bör därför utarbetas. En av gränserna för protokollet är att det inte är lämpligt för att mäta sannolikheten för givare-initierade Konjugation av en plasmid med låg frekvens överförbarhet.
Baserat på dessa metoder och deras resultat, rapporterade vi nyligen att två plasmider visade olika Böjningar frekvenser i flytande media genom att ändra de omrörning skattesatserna, som kan påverka de första och tredje steg av konjugation, fastsättning och avlossning av givare-mottagare par. Dessutom hittade vi också skillnader i sannolikheten för den andra steg10. Dessa resultat visar hur konjugation frekvensen ändras under olika förhållanden. Dessa protokoll är användbara för att jämföra funktionerna Konjugation av plasmider under olika villkor, inklusive aerob eller anaerob villkor, olika givare-mottagare par, olika temperatur eller pH, och i närvaro eller frånvaro av specifika kemikalier, såsom katjoner, näringsämnen och antibiotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. K. Kamachi av det nationella institutet för infektionssjukdomar (Japan) för att tillhandahålla pBP136 och Prof. Dr. H. Nojiri av University of Tokyo (Japan) för att tillhandahålla pCAR1. Vi är också tacksamma mot Professor Dr Molin Sølen av Danmarks tekniska universitet för att ge pJBA28. Detta arbete stöds av JSPS KAKENHI (Grant nummer 15H 05618 och 15KK0278) till MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
- Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F.
- Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
- Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
- Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
- Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
- Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
- Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).
- Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
- Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
- Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
- Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
- Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E.
- Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
- Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
- Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
- Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
- Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
- Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
- Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
- Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
- Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).
