Summary
Mit dem Ziel, die Verhaltensweisen der verschiedenen bakteriellen konjugative DNA-Elemente unter verschiedenen Bedingungen zu verstehen, beschreiben wir ein Protokoll für die Unterschiede in der Konjugation Frequenz mit hoher Auflösung, einzuschätzen, wie effizient das Spender-Bakterium Konjugation initiiert.
Abstract
Bakterielle Konjugation ist ein wichtiger Schritt in die horizontale Übertragung von Antibiotikaresistenz-Genen über ein konjugative DNA-Element. Eingehende Vergleiche der Konjugation Frequenz unter verschiedenen Bedingungen müssen verstehen, wie das konjugative Element in der Natur verbreitet. Jedoch eignen sich herkömmliche Methoden zum Vergleichen von Konjugation Frequenz nicht für eingehende Vergleiche wegen der hohen Hintergrund durch das Auftreten von zusätzlichen Konjugation Ereignissen auf der selektiven Platte verursacht. Durch Einführung einer wahrscheinlichste Anzahl (MPN) Methode und eine höhere Konzentration von Antibiotika zur Verhinderung weiterer Konjugation in selektiven flüssigen Medium haben wir erfolgreich den Hintergrund reduziert. Darüber hinaus entwickelten wir ein Protokoll für die Schätzung der Wahrscheinlichkeit wie oft Spender Zellen initiieren Konjugation durch einzelne Spenderzellen in Empfänger-Pools durch Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) sortieren. Im flüssigen Medium unterschiedlich rühren konnte mit zwei Plasmide, pBP136 und pCAR1, die Unterschiede in der Konjugation Frequenz in Pseudomonas Putida Zellen nachgewiesen werden. Die Frequenzen der Konjugation Einweihung waren höher für pBP136 als für pCAR1. Mit diesen Ergebnissen können wir besser verstehen, die Konjugation Features in diese zwei Plasmide.
Introduction
Bakterielle Konjugation von mobile genetische Elemente, konjugative Plasmide und integrative und konjugative Elemente (ICEs) ist wichtig für die horizontale Verbreitung der genetischen Information. Es kann fördern schnelle bakterielle Entwicklung und Anpassung und multidrug-Resistenz-Gene-1,-2zu übertragen. Die Konjugation Frequenz kann beeinflusst werden, durch Proteine codiert auf die konjugative Elemente für die Mobilisierung der DNA (MOB) und Paarung Paarbildung (MPF), einschließlich Geschlecht Pili, die laut MOB und MPF Typ3,4eingestuft sind, 5. Es kann auch durch die Spender und Empfänger Paar6 und die Wachstumsbedingungen der Zellen7,8,9,10,11,12 (beeinflusst werden Wachstumsrate, Zelldichte, feste Oberfläche oder flüssigen Medium, Temperatur, Nährstoffverfügbarkeit und die Anwesenheit von kationen). Um zu verstehen wie die konjugative Elemente unter Bakterien verbreiten, ist es notwendig, Konjugation Frequenz im Detail zu vergleichen.
Die Konjugation Frequenz zwischen Spender und Empfänger-Paare nach der Paarung werden in der Regel mit konventionellen Methoden wie folgt geschätzt. (i) zuerst werden die Zahlen von Spender und Empfänger Kolonien gezählt. (Ii) dann werden die Empfänger Kolonien, die die konjugative Elemente erhalten (= Transconjugants) gezählt; (Iii) und schließlich die Konjugation Frequenz errechnet sich durch Division der Koloniebildenden Einheiten (KBE) von der Transconjugants von denen der Spender oder Empfänger13. Wenn Sie diese Methode verwenden, ist der Hintergrund jedoch durch zusätzliche Konjugation Ereignisse, die auch, auf die selektive Platten verwendet auftreten können, um Transconjugants zu erhalten, wenn die Zelldichte hoch10ist hoch. Daher ist es schwer zu erkennen, kleine Unterschiede in der Häufigkeit (unter 10-divisibel Unterschied). Wir hat vor kurzem eine wahrscheinlichste Anzahl (MPN) Methode mit flüssigen Medium mit einer höheren Konzentration von Antibiotika. Diese Methode reduziert den Hintergrund durch die Hemmung weitere Konjugation in selektiven Medium; So konnte die Konjugation Frequenz mit höherer Auflösung geschätzt werden.
Konjugation kann in drei Schritte unterteilt werden: (1) Befestigung der Spender-Empfänger koppeln (2) die Einleitung der konjugative Übertragung und (3) Dissoziation der paar14. Während der Schritte (1) und (3) gibt es physikalische Interaktion zwischen Spender und Empfänger Zellen; So können Zelldichte und die Umweltbedingungen diese Schritte beeinflussen, obwohl die Merkmale des Sex-Pili auch wichtig sind. Schritt (2) ist wahrscheinlich durch den Ausdruck von mehreren Genen in Konjugation als Reaktion auf äußere Veränderungen, geregelt, die durch verschiedene Merkmale von Plasmid, Spender und Empfänger betroffen sein könnten. Obwohl die physische Anlage oder Ablösung der Spender-Empfänger-Paare mathematisch kann eine Schätzung der Zellen als Partikel verwenden simuliert werden, sollte die Häufigkeit der Schritt (2) experimentell gemessen werden. Es gab ein paar Berichte über direkte Beobachtungen wie oft Geber initiieren können Konjugation [Schritt (2)] mit Fluoreszenz-Mikroskopie15,16; Diese Methoden sind jedoch nicht Hochdurchsatz-da eine große Anzahl von Zellen überwacht werden muss. Daher entwickelten wir eine neue Methode zur Abschätzung der Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Schritt (2) mittels Fluoreszenz aktiviert Zelle sortieren (FACS). Unsere Methode kann auf alle Plasmid, ohne Identifizierung der wesentlichen Gene für Konjugation angewendet werden.
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Protocol
1. Vorbereitung eines Spenders mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP)- und Kanamycin Resistenz-Gen-Tags Plasmide
- Einführung von Markergenen in der Ziel-Plasmid-pBP136
Hinweis: Ziel dieses Protokolls ist es, pBP136 zu generieren::Gfp. Die Bakterienstämme und Plasmide verwendet in dieser Studie sind in Tabelle 1aufgeführt.- Kulturen von Escherichia coli DH10B beherbergen pBP13617 in 5 mL sterile Luria Brühe (LB) und E. Coli S17-1λPir18 pJBA2819 beherbergen wachsen [enthält eine Kanamycin (Km)-Resistenz-Gen und Gfp mut3 * gen mit seinen Promotor und Terminator in einem Mini-Tn-5] in 5 mL sterile LB mit 50 μg/mL Km bei 37 ° C über Nacht (O/N, 16 – 24 h) mit schütteln mit 200 Umdrehungen pro Minute (u/min).
- Ernten und waschen
- Ernten Sie 1 mL der jeweiligen Kultur zu, legen Sie sie in eine 2 mL Reaktionscup und Zentrifuge (10.000 × g, Raumtemperatur, 2 min). Dann den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Zentrifuge wieder (10.000 × g, Raumtemperatur, 2 min), und in 500 μl steriler PBS aufzuwirbeln.
- Filtern, Paarung
- Bereiten Sie sterile LB-Platten (mit 1,6 % Agar), und setzen Sie einen sterilen 0,22 μm Pore Größe Membranfilter auf. Mix 500 μL der E. Coli S17-1λPir beherbergen pJBA28 mit E. Coli DH10B beherbergen, pBP136 und Stelle die Mischung auf dem Filter auf der LB-Platte. Inkubieren Sie die Platte O/N bei 30 ° c Entfernen Sie den Filter von der LB-Platte, legen Sie sie in ein Plastikrohr steril 50 mL, und 1 mL sterile PBS.
Hinweis: pJBA28 in Gegenwart von Π Protein kodiert, indem der Pir gen18, replizieren kann und von S17-1λPir auf DH10B übertragen werden können. pBP136 trägt keine Marker-gen17 und kann von DH10B auf S17-1λPirübertragen werden. Daher konnten wir S17-1λPir beherbergen pBP136 und pJBA28 von DH10B beherbergen pBP136 und die Mini-Tn-5 (umgesetzt in das Chromosom oder pBP136) in diesem Stadium nicht unterscheiden. Dann haben wir Mischungen von ihnen als Spender in den nachfolgenden Schritten (1.1.4.–1.1.5.).
- Bereiten Sie sterile LB-Platten (mit 1,6 % Agar), und setzen Sie einen sterilen 0,22 μm Pore Größe Membranfilter auf. Mix 500 μL der E. Coli S17-1λPir beherbergen pJBA28 mit E. Coli DH10B beherbergen, pBP136 und Stelle die Mischung auf dem Filter auf der LB-Platte. Inkubieren Sie die Platte O/N bei 30 ° c Entfernen Sie den Filter von der LB-Platte, legen Sie sie in ein Plastikrohr steril 50 mL, und 1 mL sterile PBS.
- Wachsen eine O/N Kultur der oben genannten Paarung Mischung in sterilen LB mit 50 μg/mL Km bei 37 ° C mit Schütteln bei 200 u/min und eine Kultur der Pseudomonas Putida KT2440 [Km-Sensitive (Kms), Rifampicin-Sensitive (Rif-s), Gentamicin-empfindliche (GV-s) und Tetracyclin resistent (Tc-R)] in 12,5 μg/mL Tc bei 30 ° C mit Schütteln bei 200 u/min-haltigem Medium.
- Nach dem Ernten und waschen die Zellen wie in Schritt 1.1.2, verwenden Sie sie (die Paarung Mischung und KT2440) für Filter (O/N, 30 ° C) wie in Schritt 1.1.3 Paarung.
- Bereiten Sie sterile LB-Platten mit 50 μg/mL Km und 12,5 μg/mL Tc (LB + Km + Tc Platten).
- Die resuspendierte Mischung auf die Membranfilter mit sterilen PBS verdünnen (101– 105-Falten), und dann Verbreitung jeder Verdünnung auf LB + Km + Tc Platten und inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C für 2 – 3-d.
- Wählen Sie Kolonien von den Platten, wachsen Sie eine O/N Kultur in sterilen LB mit Km und Tc sowie P. resinovorans CA10dm4RG (Riff und GV-R)6 in sterilen LB mit Rif (25 μg/mL) und Gm (30 μg/mL) bei 30 ° C und 200 Umdrehungen pro Minute.
Hinweis: Wie beschrieben in die vorhergehende Note, die Kolonien auf der LB + Km + Tc Platten (ab 1.1.7.) kann KT2440 beherbergen pBP136 ein Mini-Tn5 und KT2440 mit einem Mini-Tn5, transportieren da pJBA28 direkt aus S17-1λPir übertragen werden könnte pBP136 und pJBA28, KT2440 beherbergen. Deshalb eine weitere Paarung mit p. Resinovorans CA10RG erforderlich ist, um die Ziel-pBP136 mit einem Mini-Tn-5 in den folgenden Schritten zu erhalten. - Nach dem Ernten und waschen die Zellen wie in Schritt 1.1.2, verwenden sie wie in Schritt 1.1.3 für Filter Paarung (O/N, 30 ° C).
- Bereiten Sie sterile LB-Platten mit Rif, Gm und Km (LB, Rif, Km + GV-Platten).
- Die Mischung auf dem Filter Aufschwemmen und verdünnen Sie es dann 101– 105-Falten, auf LB, Rif, Km + Gm verteilen Platten und inkubieren Sie die Platten für 2 – 3-d bei 30 ° C.
- Wählen Sie die Kolonien und prüfen Sie, ob sie pBP136 durch PCR mit spezifischen Primer für das Plasmid beherbergen.
- Einführung eines selektiven Markergens in der Ziel-Plasmid-pCAR1
Hinweis: Das Ziel dieses Protokolls ist es, pCAR1 zu generieren::Gfp- Wachsen eine O/N Kultur von p. Putida KT2440 beherbergen pCAR1 (Kms, Gms, Rifs, Tc-R)20 bei 200 u/min und 30 ° C und E. Coli S17-1λPir18 beherbergen pJBA28 in 5 mL sterilem LB enthält 50 μg/mL Km bei 200 u/min und 37 ° C.
- Nach dem Ernten und waschen die Zellen wie in Schritt 1.1.2, verwenden sie wie in Schritt 1.1.3 für Filter Paarung (O/N, 30 ° C).
- Entfernen Sie den Filter von der LB-Platte, legen Sie sie in ein Plastikrohr steril 50 mL, und 1 mL sterile PBS.
- Die resuspendierte Mischung mit sterilen PBS verdünnen (101– 105-Falten), und verbreiten Sie die verdünnte Mischung auf sterile selektiven LB + Tc + Km Platten.
Hinweis: pCAR1 repliziert nicht in E. Coli; so p. Putida KT2440 beherbergen pCAR1 mit einem Mini-Tn5 auf LB + Tc + Km wählbar Platten. - Wählen Sie eine Kolonie von der Platte, und wachsen einer O/N Kultur in sterilen LB mit Km und Tc und eine Kultur der P. resinovorans CA10dm4RG in sterile LB mit Rif und Gm (200 u/min, 30 ° C).
- Nach dem Ernten und waschen wie in Schritt 1.1.2, verwenden Sie die Zellen wie in Schritt 1.1.3 für Filter Paarung (O/N, 30 ° C).
- Aufschwemmen der Mischung auf dem Filter und dann verdünnen Sie es auf LB, Rif, Km + Gm Platten verteilt und die Platten für 2 – 3-d bei 30 ° c inkubieren
- Wählen Sie die Kolonien und prüfen Sie, ob sie pCAR1 durch PCR mit spezifischen Zündkapseln für das Plasmid beherbergen.
- Die Übertragbarkeit der tagged-Plasmide bestätigen und die Spendern für die nächsten Schritte vorbereiten
Hinweis: Das Ziel dieses Protokolls ist, bestätigen die Übertragbarkeit von den oben genannten konstruierten Plasmiden und die Spendern für die nächsten Schritte vorbereiten.- Wachsen eine O/N Kultur von p. Resinovorans CA10dm4RG beherbergen pBP136::GLP oder pCAR1::Gfp in sterilen LB mit Km und eine Kultur der p. Putida SMDBS [Kms, Gms, RifR, TcR, LacI Q, in denen PA1/O4/O3-gfpmut3* drückt sich nicht wegen seiner chromosomalen LacIQ gen]21 in 3 mL LB mit Tc (200 u/min, 30 ° C).
- Nach dem Ernten und waschen die Zellen wie in Schritt 1.1.2, verwenden sie wie in Schritt 1.1.3 für Filter Paarung (O/N, 30 ° C).
- Setzen Sie den Filter in einem Plastikrohr steril 50 mL, und mit 1 mL sterile PBS aufzuwirbeln. Die resuspendierte Mischung mit sterilen PBS verdünnen (101– 105-Falten), verbreiten Sie die verdünnte Mischung auf sterile selektiven LB + Tc + Km Platten.
- Wählen Sie die Kolonien und prüfen Sie, ob sie jeweils den Plasmiden durch PCR mit spezifischen Primern Hafen.
Hinweis: Bestätigung über die Einfügeposition des Mini-Tn5 durch direkte Sequenzierung nach der Plasmid-Extraktion ist optional, zu bestätigen, dass die Einfügung die Übertragungsfunktion der Plasmide nicht beeinflusst.
2. Berechnung der Konjugation Frequenz durch die MPN-Methode
- Bereiten Sie sterile LB + Km und LB + GV-Platten.
- Wachsen eine O/N Kultur von p. Putida SMDBS beherbergen pBP136::GLP oder pCAR1::Gfp in 3 mL steril mit Km und eine Kultur der p. Putida KT2440RGD LB (GmR, RifR) in 3 mL LB mit Gm (140 u/min, 30 ° C).
- Nach dem Ernten und waschen die Zellen wie in Schritt 1.1.2, für Filter, die Paarung bei 30 ° C für 45 Minuten wie in Schritt 1.1.3 verwenden.
- Seriell Verdünnen der oben genannten Spender und Empfänger (101 – 107) Kultur und breitete es auf LB + Km (Spender) oder LB + Gm (Empfänger) Platten (jeweils in dreifacher Ausfertigung) um die Koloniebildenden Einheiten (KBE) zählen. Inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C für 2 d.
- Die Mischung auf dem Filter in sterilen LB mit Km und Gm Aufschwemmen und seriell verdünnen (von 21 224– 107,2) mit einer 96-Well Zellplatte Kultur (in Vierfachbestimmungen).
- Gegebener Zeit (2 d bei 30 ° C) inkubieren Sie 96-Well-Platte.
- Die KBE des Spenders und des Empfängers auf den Platten (Schritt 2.4.) zählen Sie und die Anzahl der Vertiefungen, in denen die Transconjugants wachsen.
- Berechnen Sie die MPN und seine Abweichung mithilfe der MPN-Berechnungsprogramm von Jarvis Et al.entwickelt. 22, der an http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls zur Verfügung steht.
- Geben Sie den Namen des Experiments (z. B. "test"), das Datum des Experiments (z. B. 2018/4/9), die Anzahl der Versuchsreihen und die Max. lol Verdünnungen (geben Sie "24") in Zeile #7 des "Programms" Blatt der Excel-Datei ("MPN_ver5.xls").
- Geben Sie "2-1 (= 0,5) bis 2-24 (= 5.96 × 10-8)" in der Spalte 'Verdünnung Faktor d''0,01' Spalte 'Volumen in ml oder g w'und 4' in ' Nr. der Röhren-n' in den automatisch erzeugten Tabellen von input-Daten.
- Geben Sie die Anzahl der Vertiefungen, in denen die Transconjugants bei jeder Probenverdünnung (0 – 4) wachsen.
- Drücken Sie den rechten oberen "Ergebnisse berechnen"-Knopf, und rufen Sie dann die Ergebnisse (MPN/μl) und ihren 95 % Vertrauensbereich (unterer und oberer).
- Berechnen Sie die Konjugation Häufigkeit der Plasmide dividiert die Anzahl der Transconjugants (MPN/mL) durch die Zahl der Spender und Empfänger Zellen (KBE/mL).
3. Vorbereitung zur Abschätzung der Wahrscheinlichkeit des Spenders initiierte Konjugation
- Wachsen eine O/N Kultur von p. Putida SMDBS beherbergen pBP136::GLP oder pCAR1::Gfp in 3 mL steril mit Km und eine Kultur der p. Putida KT2440RGD LB (GmR, RifR) in 3 mL sterile LB mit Gm mit 300 mL Fläschchen (140 u/min, 30 ° C) als Precultures.
- 200 μL der Vorkultur in 200 mL frische sterile LB, Km oder Gm in 500 mL Flaschen enthalten und bei 30 ° C mit Schütteln bei 140 u/min inkubieren.
- Messung die Trübung bei 600 nm (OD600) der Kultur unter Verwendung eines UV-VIS Spektralphotometer und Ort die Kultur, verdünnt in LB (101– 108-Falten Verdünnungen), auf eine LB-Platte mit Km oder GM Incubate diese LB-Platten bei 30 ° C für 1 – 2 d , und bestimmen die KBE.
- Plot der OD-600 -Werte und die KBE mit Wachstumszeit Wachstumskurven des Spenders und des Empfängers zu erzeugen.
- Wachsen Sie Kulturen des Spenders und des Empfängers Stamm auf Mid Log-Phase, anhand der Wachstumskurve.
- Nach dem Ernten und Waschen der Zellen, bereite 101– 103 KBE des Spenders in 10 μL LB und 105– 107 KBE des Empfängers in 100 μL LB.
- Mischung 10 μL des Spenders und 100 μL der Empfänger Kulturen in unterschiedlicher Dichte in 96-Well-Platten (in dreifacher Ausfertigung). Z. B. Mischung 101 KBE des Spenders und 105 KBE des Empfängers und fügen sie alle 96 Wells und Mischung 101 KBE des Spenders und 106 KBE des Empfängers in einem anderen 96-Well-Platte, und so weiter.
- Inkubieren Sie die Mischung bei 30 ° C für 45 min, und fügen Sie hohe Konzentrationen von Antibiotika (100 μg/mL Km und 60 μg/mL Gm) in jede Vertiefung, Konjugation weiter zu hemmen.
- Inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C für 2 d.
- Die Anzahl der Bohrungen in denen Transconjugants wachsen.
- Wählen Sie die Empfänger Dichte, die eignet sich für die Abschätzung der Wahrscheinlichkeit des Spenders initiierte Konjugation anhand der oben genannten Daten (Transconjugants sollte bei mindestens 1 auch von einer 96-Well-Platte gefunden werden).
Hinweis: Transconjugants wachsen in alle Wells, wenn die Dichte von Spender und Empfänger Zellen hoch sind und mehr als eine Konjugation in einen Brunnen tritt. Im Gegensatz dazu wird keine Transconjugants in jedem Brunnen gefunden werden, wenn die Zelldichte zu niedrig ist. Im folgenden Abschnitt wird eine einzelne Spender Zelle in einen Brunnen sortiert. Daher sollten die Empfänger Dichte maximal sein.
4. Schätzung der Wahrscheinlichkeit des Spenders initiierte Konjugation
- Bereiten Sie 200 mL einer Mid Log-Phase Kultur des Spenders p. Putida SMDBS beherbergen pBP136::GLP oder pCAR1::Gfp und der Empfänger p. Putida KT2440RGD, wie in 3.6-3.7 beschrieben.
- Platz 106 KBE des Empfängers in 100 μL LB in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
- Richten Sie die FACS-System (Flow Cytometry und Zelle Sorter mit einem Roboterarm, 488 nm Argonlaser und eine Düse Öffnung 70 μm). Legen Sie auf forward Scatter (FSC), mit einem Schwellenwert von 1 % als Erwerb Auslöser. Stimmen der H-Gain und eine Verstärkung des FSC und Side Scatter (SSC) bei maximaler Empfindlichkeit, die falsche positive Signale, mit PBS als Negativkontrolle ausschließen kann. Festlegen der Art Tores basierend auf FSC und SSC und 0,5 Tropfen Sortiermodus für maximale Art Reinheit.
- Art einer einzigen Spender Zelle durch FACS auf eine LB-Platte (384 verschiedene Flecken), brüten die Platte bei 30 ° C für 2 d und dann zählen, wie viele Kolonien auf der Platte aus der sortierten Zellen angezeigt werden.
Hinweis: Dieses Verfahren ist für die Validierung des eingestellten Tores. Wenn 384 Kolonien auf der Platte vorhanden sind, bedeutet dies, dass 100 % der sortierten Zellen Kolonien bilden kann. Die durchschnittliche Gültigkeit der Sortierung ist immer 90 – 95 %. - Sortieren einer einzigen Spender Zelle durch FACS in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit dem Empfänger (4.2).
- Inkubieren Sie die Platte für 45 min. bei 30 ° C, und fügen Sie hohe Konzentrationen von Antibiotika (100 μg/mL Km und 60 μg/mL Gm) in jede Vertiefung zur Verhinderung weiterer Konjugation.
- Inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C für 2 d.
- Die Anzahl der Brunnen in der Transconjugants als wuchs bestimmt durch Sichtkontrolle mit dem bloßen Auge.
- Berechnen Sie die Wahrscheinlichkeit eines Spenders initiierte Konjugation dividiert die Anzahl der Brunnen mit Transconjugants durch die Gesamtzahl der Brunnen, in denen der Spender sortiert wurde.
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Representative Results
Vergleich der Konjugation Frequenz durch die MPN-Methode
In unserem vorherigen Bericht verglichen wir die Konjugation Frequenzen von pBP136::GLP und pCAR1::Gfp in dreifach verdünnte LB (1/3 LB) flüssigen Medium mit mitreißenden unterschiedlich nach einer 45 min. Paarung mit 125 mL Spinner Fläschchen10. Wir verglichen die Konjugation Frequenzen von pBP136::GLP und pCAR1::Gfp mit 106 KBE/mL Spender und Empfänger Stämme unter verschiedenen Bedingungen rühren (0-600 u/min). Die Konjugation Häufigkeit der beiden Plasmide erhöht mit höherer Rate rühren, und der maximale Unterschied in der Häufigkeit der Konjugation war < 10-divisibel für pBP136::Gfp (zwischen 0 und 400 u/min), während die von pCAR1::Gfp wurde ~ 25-fold (zwischen 0 und 200 u/min; (Abb. 1).
Abschätzung der Wahrscheinlichkeit des Spenders initiierte Konjugation
Die zuvor geschätzte Wahrscheinlichkeit des Spenders initiierte Konjugation ist in Tabelle 2dargestellt. Um festzustellen, die Dichte der Empfängerzellen erforderlich, um die Wahrscheinlichkeit der Konjugation, Paarung Assays vergleichen wurden mit unterschiedlichen Dichten von Spender und Empfänger durchgeführt. Wie in Tabelle 2, pBP136::Gfp Transconjugants erkannt wurden, in 100 % (96/96) von Brunnen mit 103 KBE des Spenders und 105-107 KBE des Empfängers, und diejenigen mit 102 KBE des Spenders und 106-107 KBE der Empfänger darauf hinweist, dass die Zelldichte zu hoch war. Paarung Assays mit 101 KBE des Spenders und 106 oder 105 KBE des Empfängers führte zu einer verringerten Anzahl von Transconjugant-positiven Brunnen (66 % und 2,1 % bzw. Tabelle 2). So, > 105 KBE des Empfängers wurde vorausgesagt, um für die Paarung mit einer einzigen Spender Zelle erforderlich. Ebenso führten wir die Paarung Assays mit pCAR1::Gfp bei unterschiedlichen Dichten von Spender und Empfänger-Stämmen. Die Prozentsätze der Transconjugant-positiven Brunnen waren viel geringer als diejenigen von pBP136::Gfp (Tabelle 2). Geht man davon aus, dass die Spender und Empfänger Zellen einander ähnlich zuordnen können, lag die Wahrscheinlichkeit der Konjugation Einleitung für den Spender pCAR1 niedriger als die für den pBP136-Spender. Basierend auf diesen Ergebnissen wir festgestellt, dass 107 KBE des Empfängers für eine einzelne Spender Zelle sortiert nach FACS benötigt wurde.
Dann wurden die Zahlen des Transconjugant-positiven Brunnen gezählt. Der Anteil der Transconjugant-positiven Brunnen für pBP136::Gfp wurde größer (1,9 %) als bei pCAR1::Gfp (< 0,052 %; ( Tabelle 2). Somit gab es mehr als eine 36-fold Unterschiede in der Wahrscheinlichkeit der Spender initiierte Konjugation zwischen diesen zwei Plasmide.
Abbildung 1: Vergleich der Konjugation Frequenzen von pBP136::GLP und pCAR1::Gfp mit 106 Kolonie Bildenden Einheiten (KBE) mL-1 des Spenders (Pseudomonas Putida SMDBS) und Empfänger (p. Putida KT2440RGD) an verschiedenen unter ständigem Rühren Preise (0-600 u/min). Die Fehlerbalken waren 95 % Vertrauensbereich durch die MPN-Methode und die Standardabweichung der KBE von Spender und Empfänger berechnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Bakterienstämme | Genotyp und relevanten Phänotyp | Referenz oder Quelle |
| Escherichia coli DH10B | F–, McrA, Δ (Mrr-HsdRMS-McrBC), Φ80dLacZΔM15, ΔlacX74, DeoR, recA1, araD139, Δ (Ara Leu) 7697, GalU, GalK , NupG , endA1, λ–, Philatelic | Thermo |
| E. Coli S17-1(λpir) | TMRSmR, RecA, Thi, pro, HsdR–M+, RP4: 2-Tc: Mu: Km Tn7 λpir | 18 |
| Pseudomoans putida KT2440 | Kms, Rifs, Gms, Tc-r | 25 |
| Pseudomoans putida KT2440(pCAR1) | KT2440 beherbergen pCAR1 | 20 |
| Pseudomoans putida KT2440RGD | Kms, RifR, GmR, TcR, MiniTn7(Gm) PA1/O4/O3DsRedExpress-a ist Inseted in Chromosom | 10 |
| Pseudomoans putida SMDBS | Derivative Stamm von p. Putida KT2440, DapB-gelöscht, Kms, Gms, RifR, TcR, LacIQ wird im Chromosom eingefügt | 21 |
| P. Resinovorans CA10RG | Kms, RifR, GmR, Tc-s | 6 |
| Plasmide | ||
| pBP136 | IncP-1, MOBP, MPFT plasmid | 17 |
| pBP136::Gfp | pBP136 tragen KmR und PA1/04/03-Gfp -Kassette in ParA (26.137 nt) | 21 |
| pCAR1 | IncP-7, MOBH, MPFF, Carbazole abbauende plasmid | 26, 27 |
| pCAR1::Gfp | pCAR1 tragen KmR und PA1/04/03-Gfp -Kassette in ORF171 (182.625 nt) | 21 |
| pJBA28 | APR, KmR, Lieferung Plasmid Mini-Tn5-Km-pA1/04/03- RBSII-Gfpmut3*-T0T -1 | 18 |
Tabelle 1. Bakterienstämme und Plasmide.
| Plasmid | ein Spender | ein Empfänger | Die Zahl der Brunnen mit Transconjugants pro 96 wells | Prozentsatz |
| [KBE oder Zelle] | [KBE] | [%] | ||
| pBP136::Gfp | 103 | 107 | 96/96 | 100 |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 96/96 | 100 | ||
| 102 | 107 | 96/96 | 100 | |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 54/96 | 56 | ||
| 101 | 107 | 71/96 | 74 | |
| 106 | 63/96 | 66 | ||
| 105 | 2/96 | 2.1 | ||
| 1 | 107 | 23/1212 | 1.9 | |
| pCAR1::Gfp | 103 | 107 | 6/96 | 6.3 |
| 106 | 6/96 | 6.3 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 102 | 107 | 1/96 | 1 | |
| 106 | 1/96 | 1 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 101 | 107 | 0/96 | 0 | |
| 106 | 0/96 | 0 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 1 | 107 | 1/1920 | < 0,052 |
Tabelle 2. Anzahl der Bohrungen, mit unterschiedlichen Zelldichten, mit Transconjugants zu vergleichen, die Wahrscheinlichkeit des Spenders initiierte Konjugation zwischen pBP136::GLP und pCAR1::Gfp.
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Discussion
Hier präsentieren wir Ihnen eine hochauflösende Protokoll zum Erkennen von Unterschieden in der Konjugation Frequenz unter verschiedenen Bedingungen, mit einer MPN-Methode zur Schätzung der Anzahl der Transconjugants. Ein wichtiger Schritt in dem Protokoll ist die Mischung von Spender und Empfänger nach der Paarung bis keine Transconjugants wachsen verdünnen. Ein weiterer Schritt ist die selektive flüssigen Medium zur Verhinderung weiterer Konjugation hohe Konzentrationen von Antibiotika hinzufügen. Diese Verfahren können durch weitere Konjugation im selektiven Medium verursacht Hintergrund reduzieren. Wir konnten erfolgreich Unterschiede, auch nach einer kurzen Paarungszeit Dauer zwischen Spender und Empfänger erkannt werden. Die konjugative Frequenz berechnet durch dieses Protokoll könnte durch kleine Unterschiede in der Wachstumsbedingungen der Spender und Empfänger Sorten geändert werden. Diese Bedingungen sollten daher sorgfältig geplant werden.
Darüber hinaus präsentieren wir ein Protokoll für die Schätzung des zweiten Schrittdes der Konjugation mithilfe von FACS für einzelne Spender Zellsortierung. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll wird die entsprechende Dichte der Empfängerzellen für eine sortierte Geber Zelle bestimmen. Wenn die Anzahl der Empfänger eine einzigen Spender Zelle umgebenden Zellen groß genug, körperlichen Kontakt zwischen Spender und Empfänger ist, ist sicher. Dann kann die Konjugation Frequenz beeinflusst werden, nicht durch die Wahrscheinlichkeit, wie oft die Spender und Empfänger Zellen miteinander in Verbindung, sondern durch die Wahrscheinlichkeit des Spenders initiierte Konjugation. Sortieren einer einzigen Spender Zelle durch FACS ist nicht schwierig; 96 Wells sind jedoch nicht immer ausreichend, um die Wahrscheinlichkeit zu schätzen. Daher sollten 10-100 Platten bereit sein. Die Grenzen des Protokolls gehört, dass es nicht angebracht für die Wahrscheinlichkeit des Spenders initiierte Konjugation von einem Plasmid mit Niederfrequenz-Übertragbarkeit zu messen.
Basierend auf dieser Methoden und deren Ergebnisse, berichtet wir kürzlich, dass zwei Plasmide zeigte verschiedene Konjugation Frequenzen in flüssigen Medien durch die Änderung die mitreißende Preise, die der erste und dritte Schritt der Konjugation, Bindung und Ablösung der beeinflussen können Spender-Empfänger-Paare. Darüber hinaus fanden wir auch Unterschiede in der Wahrscheinlichkeit der zweite Schritt10. Diese Ergebnisse zeigen, wie die Konjugation Frequenz unter verschiedenen Bedingungen ändert. Diese Protokolle sind nützlich für den Vergleich der Konjugation Merkmale der Plasmide unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich der aeroben und anaeroben Bedingungen, verschiedene Spender-Empfänger-Paare, unterschiedliche Temperatur oder pH-Wert, und in dem Vorhandensein oder Fehlen bestimmter Chemikalien, wie kationen, Nährstoffe und Antibiotika.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. K. Kamachi des National Institute of Infectious Diseases (Japan) für die Bereitstellung von pBP136 und Prof. Dr. H. Nojiri an der University of Tokyo (Japan) für die Bereitstellung von pCAR1. Wir sind auch dankbar, Professor Dr. Molin Sølen der Technical University of Denmark für die Bereitstellung von pJBA28. Diese Arbeit wurde unterstützt von JSPS KAKENHI (Grant-Nummern 15H 05618 und 15KK0278), MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
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