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Bioengineering

एक तेजी से छवि आधारित बैक्टीरियल डाह परख अमीबा का उपयोग

Published: June 27, 2018 doi: 10.3791/57844
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Physics and Astronomy, University of California, 2Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California

Summary

यहां, हम एक मेजबान के रूप में डी discoideum (अमीबा) का उपयोग कर planktonic या सतह से जुड़े बैक्टीरिया के डाह को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । डाह 1 एच की अवधि में मापा जाता है और मेजबान की हत्या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण का उपयोग कर quantified है । हम इस जीवाणु पी aeruginosaका उपयोग कर प्रोटोकॉल का प्रदर्शन ।

Abstract

पारंपरिक बैक्टीरियल डाह परख कई घंटे के पाठ्यक्रम पर बैक्टीरिया की लंबे समय तक जोखिम मेजबान कोशिकाओं को शामिल । इस समय के दौरान, बैक्टीरिया विकास पर्यावरण और मेजबान कोशिकाओं की उपस्थिति की मेजबानी के लिए जोखिम के कारण शरीर क्रिया विज्ञान में परिवर्तन से गुजरना कर सकते हैं । हम एक परख के लिए तेजी से बैक्टीरिया की डाह राज्य उपाय है कि किस हद तक बैक्टीरिया मेजबान कोशिकाओं की उपस्थिति में वृद्धि को कम करने के लिए विकसित की है । बैक्टीरिया और amoebae एक साथ मिश्रित कर रहे हैं और एक एकल इमेजिंग विमान पर एक आगर पैड का उपयोग कर मैटीरियल. प्रक्रिया एकल-कक्ष प्रतिदीप्ति इमेजिंग calcein-acetoxymethyl एस्टर (calcein-AM) के साथ होस्ट सेल स्वास्थ्य के एक संकेतक के रूप में उपयोग करता है । मेजबान कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर बैक्टीरिया को मेजबान कोशिकाओं के प्रदर्शन के 1 ज के बाद विश्लेषण किया जाता है । छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए एक मेजबान हत्या सूचकांक गणना किया जाता है । इस पद्धति में planktonic और सतह से जुड़ी Pseudomonas aeruginosa उप-आबादी के भीतर डाह को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है और फिल्म के गठन के प्रारंभिक चरण के दौरान अंय बैक्टीरिया और अंय फिल्म विकास के चरणों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल डाह को मापने की एक तेजी से और मजबूत विधि प्रदान करता है और स्तनधारी सेल लाइनों के विकास और रखरखाव के साथ जुड़े कई जटिलताओं से बचा जाता है । डाह phenotypes मापा यहां का उपयोग amoebae भी किया गया है मांय माउस मैक्रोफेज का उपयोग कर । विशेष रूप से, इस परख के लिए उपयोग किया गया था कि सतह लगाव aeruginosaमें डाह को विनियमित स्थापित ।

Introduction

बैक्टीरियल संक्रमण मानव और पशुओं में मृत्यु के प्रमुख कारणों में से एक है1,2. संस्कृतियों या फिल्मों में बैक्टीरिया के डाह को मापने की क्षमता स्वास्थ्य और अनुसंधान सेटिंग्स में महत्वपूर्ण है । यहां, हम एक बहुमुखी, तेजी से वर्णन है, और अपेक्षाकृत सरल बैक्टीरियल डाह यों तो विधि । eukaryotic जीव Dictyostelium discoideum (अमीबा) मॉडल मेजबान जीव के रूप में प्रयोग किया जाता है । D. discoideum एक मेजबान के रूप में इस्तेमाल किया गया है Pseudomonas aeruginosa में डाह कारकों की पहचान (पी. aeruginosa)3,4,5 और अंय बैक्टीरिया6,7 ,8 और काफी हद तक एक ही डाह कारक है कि प्रकार III स्राव9,10सहित स्तनधारी कोशिकाओं को मारने के लिए अतिसंवेदनशील है । पिछले डाह discoideum का उपयोग कर परख घंटे3,4,5के पाठ्यक्रम पर डी. discoideum कोशिकाओं के साथ बैक्टीरिया के लंबे समय तक जोखिम शामिल है । प्रोटोकॉल, यहां, इस अमीबा का उपयोग कर डाह निर्धारित करने का एक तेजी से विधि प्रस्तुत करता है । इस प्रोटोकॉल (चित्रा 1) का वर्णन कैसे करने के लिए: (1) amoebae axenically (बैक्टीरिया के अभाव में) बढ़ने, (2) परख के लिए बैक्टीरिया बढ़ने, (3) बैक्टीरिया और माइक्रोस्कोप के लिए मेजबान कोशिकाओं को तैयार, (4) epifluorescence माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन, और (5) का विश्लेषण अमीबा प्रतिदीप्ति.

Amoebae शुरू में जमे हुए शेयरों से बाहर निकल रहे है और ई कोलाई (ई. कोलाई), जहां Amoebae बीजाणु का उत्पादन के एक लॉन पर हो गया । इन बीजाणुओं को axenic वृद्धि के लिए समृद्ध माध्यम में चुना और inoculated जाता है । amoebae पोषक तत्वों से भरपूर परिस्थितियों में axenic वृद्धि के माध्यम से बनाए रखा जाता है जब तक वे बैक्टीरियल डाह के आकलन के लिए बैक्टीरिया के साथ मिश्रित होने के लिए तैयार हैं । अस्तित्व या amoebae की मृत्यु calcein-acetoxymethyl (calcein-AM) के प्रतिदीप्ति को मापने से quantified है, जो intracellular esterases से सट जाता है और, जिससे प्रतिदीप्ति11,12के लिए सक्रिय हो जाता है । लाइव amoebae प्रदर्शन कम या कोई प्रतिदीप्ति जबकि जोर दिया और मर कोशिकाओं fluoresce तीव्रता से । यह परिणाम calcein के एक छोटे या कोई निगमन के कारण है-स्वस्थ amoebae और शामिल करने और तनाव में सब्सट्रेट के दरार में हूं13amoebae । यह व्यवहार विशेष रूप से अलग है calcein-AM प्रतिदीप्ति स्तनधारी कक्षों में11,14,15,16।

बैक्टीरिया है कि डाह के लिए मूल्यांकन किया जाएगा अलग से उगाया जाता है । यहां, हम बताते है कि कैसे अवसरवादी रोगज़नक़ पी aeruginosa और विस्तार के डाह को मापने के लिए कैसे planktonic (तैराकी) और सतह से जुड़ी उप आबादी डाह की मात्रा बढ़ाता है । इस प्रोटोकॉल के लिए अंय बैक्टीरिया की डाह परीक्षण अनुकूलित किया जा सकता है । प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में, हम बताते है कि डाह सतह संलग्न कोशिकाओं में सक्रिय है और planktonic कोशिकाओं में कम है, जो पहले13बताया गया था । डाह-आपन सतह से जुड़ी पी. aeruginosa मारती amoebae जबकि गैर विषमय planktonic कोशिकाओं का सेवन amoebae द्वारा किया जाता है. यदि planktonic बैक्टीरिया की डाह पूरी तरह से परख की जा रही है, बैक्टीरिया साधारण संस्कृति ट्यूबों में बजाय पेट्री व्यंजन का उपयोग कर के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित किया जा सकता है ।

amoebae और aeruginosa संस्कृतियों की वृद्धि का समंवय किया जाना चाहिए ऐसी है कि पी aeruginosa संस्कृतियों का इरादा विकास के दौर तक पहुंचने जबकि amoebae पोषक तत्वों से भरपूर परिस्थितियों में स्थिर राज्य में बढ़ रहे हैं । इस हालत में आम तौर पर amoebae संस्कृतियों की आवश्यकता है जब वे जीवाणुओं के साथ मिश्रित कर रहे हैं करने से पहले से कम 1 दिन पतला हो । Amoebae और बैक्टीरिया के मैटीरियल पैड का उपयोग कर रहे हैं, सह रहे है 1 के लिए मशीन, और एक कम संकल्प (10x, संख्यात्मक एपर्चर ०.३) उद्देश्य, हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) फिल्टर, और एक इमेजिंग कैमरा का उपयोग कर imaged । विश्लेषण स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ImageJ सॉफ्टवेयर या अनुकूलित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है । हमारे विश्लेषण एक वैज्ञानिक विश्लेषण13पैकेज का उपयोग कर लिखा हमारे अपने सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था । सॉफ्टवेयर एक मुखौटा चरण कंट्रास्ट छवि का उपयोग कर बनाने और प्रतिदीप्ति छवि में नकाबपोश क्षेत्रों से प्रतिदीप्ति मूल्यों को निकालने चाहिए । प्रतिदीप्ति मूल्यों पर औसत से कम १०० कोशिकाओं, एक संख्यात्मक मेजबान हत्या सूचकांक में जिसके परिणामस्वरूप हैं ।

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं कैलिफोर्निया, इरविन विश्वविद्यालय में किए गए ।

1. बफ़र्स और समाधान

  1. डबल आसुत जल (ddH2ओ) के 1 एल में पौंड-मिलर मिश्रण के 25 ग्राम जोड़कर एक 1 एल ग्लास बोतल में Lysogeny शोरबा (lb) तैयार करें । पेट्री व्यंजन के लिए, आगर के अतिरिक्त 20 ग्राम जोड़ें । आटोक्लेव को निष्फल । 10 सेमी व्यास पेट्री बर्तन में पिघला हुआ आगर मध्यम के 25 मिलीलीटर डालो और कमरे के तापमान पर जमना के लिए अनुमति देते हैं । 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान और आगर प्लेट पर तरल मीडिया की दुकान ।
  2. तैयार ग्लूकोज खमीर Peptone (GYP) प्लेटें एक 1 एल कांच की बोतल में मिलाकर 1 डी का जी-ग्लूकोज, Peptone के 2 ग्राम, खमीर निकालने के ०.२५ ग्राम, KH के ४.२ ग्राम2पीओ4, ५.१ जी के ना2HPO47H2ओ, और आगर के 25 ग्राम में 1 L के ddH2 ओ. आटोक्लेव को निष्फल । 10 सेमी व्यास पेट्री बर्तन में पिघला हुआ आगर के 25 मिलीलीटर डालो और कमरे के तापमान पर जमना के लिए अनुमति देते हैं । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  3. Peptone एस (PS) मीडियम को 1 एल ग्लास की बोतल में मिला कर 10 ग्राम Peptone, खमीर निकालने के 7 ग्राम, डी के 15 ग्राम ग्लूकोज, ०.१२ जी का ना2HPO47H2ओ, १.४ जी का KH2पीओ4, ४० µ जी का विटामिन बी12 , और ८० ddH के ८०० मिलीलीटर में फोलिक एसिड की µ जी2हे । पीएच मीटर एक दिन के भीतर इस्तेमाल नहीं किया गया है, तो पीएच 4 और पीएच 7 मानकों का उपयोग कर एक इलेक्ट्रॉनिक पीएच मीटर जांचना ।
    1. पीएच मीटर का उपयोग कर पुनश्च माध्यम के पीएच उपाय । या तो जोड़ें 5 एम KOH या 5 एम एच3पीओ4 ६.५ के लिए पीएच समायोजित करने के लिए । 1 एल के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें ddH2का उपयोग कर ओ. फिल्टर ०.२२ µm वैक्यूम फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर का उपयोग कर निष्फल ।
      नोट: दस्ताने, सुरक्षात्मक कपड़े, नेत्र सुरक्षा, और चेहरे की सुरक्षा सहित सुरक्षात्मक उपकरण पहनने के द्वारा पीएच समायोजन के साथ सावधानी से आगे बढ़ें ।
  4. एक 1 एल कांच की बोतल में 10x विकास बफर प्राइम (DB ') बफर तैयार KH2पीओ4, १३.४ जी के एनए2HPO4 7H2ओ, और ddH2हे के ३.४ g को जोड़कर ८०० मिलीलीटर की कुल मात्रा । पीएच मीटर एक दिन के भीतर इस्तेमाल नहीं किया गया है, तो पीएच 4 और पीएच 7 मानकों का उपयोग कर एक इलेक्ट्रॉनिक पीएच मीटर जांचना ।
    1. इलेक्ट्रॉनिक पीएच मीटर का उपयोग कर बफर के पीएच उपाय । धीरे या तो 5 एम KOH या 5 एम एच3पीओ4 की जरूरत के रूप में जोड़ने से ६.५ पीएच समायोजित करें । 1 एल के लिए अंतिम मात्रा समायोजित ddH2ओ का उपयोग कर और autoclaving द्वारा निष्फल । कमरे के तापमान पर स्टोर ।
      नोट: दस्ताने, सुरक्षात्मक कपड़े, नेत्र सुरक्षा, और चेहरे की सुरक्षा सहित सुरक्षात्मक उपकरण पहनने के द्वारा पीएच समायोजन के साथ सावधानी से आगे बढ़ें ।
  5. 1 मिलीलीटर के साथ 10x db ' बफर के १०० मिलीलीटर मिश्रण से 1x विकास बफर (db) बनाओ 2 एम MgCl2, और निष्फल 1 एम CaCl2के 1 मिलीलीटर । एक 1 l कांच की बोतल में 1 एल के लिए अंतिम मात्रा समायोजित एक autoclaved का उपयोग कर ddH2ओ. कमरे के तापमान पर स्टोर ।
  6. तैयार पुनश्च: एक 1 एल कांच की बोतल में डीबी मध्यम निष्फल पी एस मध्यम के १०० मिलीलीटर मिश्रण से, निष्फल 10x DB ' बफर के १०० मिलीलीटर, और निष्फल ddH 21 एल पूरक के एक कुल मात्रा के साथ 1 की मिलीलीटर निष्फल 2 मीटर MgCl2 और 1 मिलीलीटर की निष्फल 1 एम CaCl 2. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  7. calcein-am स्टॉक समाधान के लिए ५० µ l को जोड़कर तैयार करें DMSO के ५० µ g को calcein-am प्लास्टिक कंटेनर में निर्माता द्वारा आपूर्ति की गई. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।

2. Amoebae की वृद्धि और अनुरक्षण

  1. विकास ई. कोलाई तनाव बी/amoebae के लिए एक खाद्य स्रोत के रूप में प्रारंभिक वृद्धि की अवधि के दौरान । एक जमे हुए स्टॉक से ई. कोलाई बी/आर पर संग्रहित-८० ° c एक पौंड आगर प्लेट पर और ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी रात भर के लिए एकल कालोनियों प्राप्त करने के लिए ।
  2. Inoculate पौंड मध्यम के 2 मिलीलीटर में ई. कोलाई बी/आर की एक एकल कॉलोनी और एक रोलर ड्रम या ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर में रात भर मशीन ।
  3. कमरे के तापमान के लिए रातोंरात ई. कोलाई संस्कृति लाओ । एक लकड़ी के छड़ी का प्रयोग, एक जमे हुए शेयर से inoculate amoebae में रखा-८० ° c रातोंरात संस्कृति के ७५० µ एल में ।
    नोट: का प्रयोग करें D. discoideum तनाव AX3, जो axenic वृद्धि18में सक्षम है । इस चरण में axenic वृद्धि की आवश्यकता नहीं है, लेकिन बाद में कदम उसकी आवश्यकता होगी ।
  4. तुरंत एक ग्लूकोज खमीर Peptone (GYP) प्लेट पर amoebae-ई. कोलाई मिश्रण के ७०० µ एल जोड़ें । संस्कृति की सतह पर समान रूप से फैलाकर उसे पीठ-पीछे झुकाकर और साथ-साथ जरूरत के अनुसार भी ऊपर की ओर करें. किसी प्रसारकर्ता के प्रयोग से बचें ।
  5. एक बॉक्स है कि उच्च आर्द्रता का कहना है में सामना कर रहे आगार के साथ GYP प्लेट रखें । एक दूसरे के शीर्ष पर खड़ी दो डिस्पोजेबल प्लास्टिक कंटेनर (१८३ cm x १८३ cm x ९१ cm) का उपयोग करें । पानी की लगभग 25 मिलीलीटर के साथ नीचे कंटेनर को भरने और कई ०.५ सेमी व्यास छेद कंटेनर के फर्श के माध्यम से ड्रिल्ड के साथ शीर्ष कंटेनर जगह पानी जलाशय से ऊपर कंटेनर को स्थानांतरित करने के लिए नमी की अनुमति ।
  6. 4-5 दिनों के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर GYP प्लेट और बॉक्स की मशीन जब तक अमीबा बीजाणु थाली की सतह के पास बढ़ रही है (चित्रा 2) मनाया । कमरे के तापमान पर मशीन की तुलना में प्लेटें लगाने के लिए एक प्रशीतित मशीन का प्रयोग करें ।
    नोट: बीजाणु बड़े हो जाने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित होने पर कई हफ्तों तक प्लेटों पर व्यवहार्य रहते हैं । आगर साइड का सामना करना पड़ के साथ प्लेटों की दुकान । मशीन के 3-4 दिनों के बाद, बैक्टीरियल लॉन के भीतर समाशोधन के क्षेत्रों मनाया जा सकता है, जो अमीबा sporulation की शुरुआत का संकेत है ।
    1. 4-5 (चित्रा 2) के बाद प्लेट की सतह के ऊपर छोटे amoebae बीजाणु देखें ।
      नोट: amoebae को एक सप्ताह से अधिक समय तक न बढ़ाएँ, क्योंकि बीजाणुओं की गुणवत्ता इस समयावधि के आगे कम हो जाती है ।
  7. प्लेट की सतह के समानांतर एक बाँझ 1 मिलीलीटर पिपेट टिप झाडू द्वारा amoebae के axenic वृद्धि के लिए तैयार करने के लिए amoebae बीजाणुओं लीजिए । 10 सेमी पेट्री डिश के आधे से बीजाणु इकट्ठा ।
    नोट: इस प्रस्ताव ई. कोलाईकी बड़ी संख्या में एकत्र करेगा के रूप में आगर प्लेट की सतह के लिए टिप छू से बचें ।
  8. पिपेट की नोक पर amoebae पी एस मध्यम के 1 मिलीलीटर में टिप डुबोकर reसस्पेंड और धीरे ऊपर और नीचे pipetting ।
  9. inoculated मिश्रण को २५०-एमएल की कुप्पी में डालकर, 0.25 x एकाग्रता पर एंटीबायोटिक-antimycotic सॉल्यूशन के साथ पूरक PS मध्यम के 25 मिलीलीटर में स्थानांतरित करना ।
    नोट: एंटीबायोटिक-antimycotic समाधान २५० µ एल aliquots के रूप में-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । इस समाधान के पिघलने और ठंड के दोहराया चक्र से बचें क्योंकि यह इसकी प्रभावकारिता कम हो सकती है ।
  10. १०० rpm पर एक घूर्णन शेखर में 22 डिग्री सेल्सियस पर amoebae axenically हो जाना । चरण 5 में डाह परख के लिए, एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए कोशिकाओं को विकसित करने के लिए ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) ०.२ के ०.५ करने के लिए मापा ।
    नोट: इस चरण में टीका (चरण २.७) के समय से 3-4 दिनों की वृद्धि की आवश्यकता है. कोशिकाओं को एक उच्च घनत्व के लिए हो गए हैं, तो संस्कृति वापस पी एस मध्यम में एक आयुध डिपो६०० ०.०५ या कम से पतला और एक आयुध डिपो६०० के लिए वापस हो जाना ०.२ से ०.५ ।

3. पी. aeruginosa की वृद्धि

  1. एक पौंड की थाली से पी aeruginosa की एक भी कॉलोनी उठाओ, यह एक 2 मिलीलीटर पुनश्च में inoculate: DB संस्कृति, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने संतृप्ति के लिए ।
    नोट:-PS: DB मीडिया के लिए एंटीबायोटिक-antimycotic समाधान जोड़ नहीं है ।
  2. एक 6 सेमी व्यास पेट्री डिश पुनश्च: DB का उपयोग कर में रातोंरात संस्कृति 1:100 या 1:1000 पतला । यदि planktonic कोशिकाओं के डाह पूरी तरह से परख की जा रही है, बजाय पारंपरिक संस्कृति ट्यूबों का उपयोग संस्कृतियों हो जाना । ३७ डिग्री सेल्सियस पर १०० rpm पर सेट एक benchtop रोटेटर पर संस्कृति हिला ।
  3. reproducibility सुनिश्चित करने के लिए विशिष्ट समय बिंदुओं पर फसल संस्कृतियों । डाह का आकलन करने से पहले 1 ज करने के लिए 30 मिनट में, धारा 4 में वर्णित के रूप में एक आगर पैड तैयार करते हैं ।
    नोट: P. aeruginosa में डाह सतहों पर विकास के लगभग 8 ज द्वारा प्रेरित है ।
  4. सतह संलग्न कोशिकाओं को अलग करने के लिए, पेट्री डिश से तरल मध्यम निकालें, planktonic कोशिकाओं को दूर करने के लिए डीबी बफर के 1 मिलीलीटर के साथ तुरंत धो, और ५.१ कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ना ।
    चेतावनी: इस के रूप में 30 से अधिक समय नहीं धो के रूप में यह perturb और सतह से जुड़ी कोशिकाओं को अलग करेंगे और डाह माप को प्रभावित कर सकते हैं ।
  5. planktonic कोशिकाओं को अलग करने के लिए, पेट्री डिश से संस्कृति के 10 µ एल स्थानांतरण एक स्वच्छ पेट्री पकवान और तुरंत ५.१ कदम के लिए आगे बढ़ना ।

4. माइक्रोस्कोप-आगर पैड की तैयारी

  1. के बारे में 30 मिनट के लिए तैयार आगर पैड amoebae से पहले पी. aeruginosaके साथ मिलाया जा करने के लिए तैयार हैं ।
  2. 1% की माइक्रोवेव ५० मिलीलीटर (w/v) आगर में DB बफर में एक २५० मिलीलीटर कुप्पी । प्रत्येक 20 एस मिश्रण आगर के झुरमुट तक गायब हो जाते हैं ।
  3. 15 मिनट के लिए गरम ५५ ° c जल स्नान में रखकर पिघला हुआ आगर ठंडा ।
  4. एक शंकु ट्यूब में पिघला हुआ आगर के 15 मिलीलीटर के लिए calcein-AM स्टॉक समाधान के 15 µ एल जोड़ें । मिश्रण धीरे ट्यूब औंधा 4-5 बार और अगले कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ना ।
    नोट: एक में इस कदम प्रदर्शन 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब । एक मोटे शीशे के कंटेनर का उपयोग न करें क्योंकि इस कारण आगर को भी जल्दी जमना होगा ।
  5. एक 12 सेमी x 10 सेमी कांच की थाली के शीर्ष पर पिघला हुआ आगर मिश्रण डालो और आगर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए जमना के लिए अनुमति देते हैं । एक मुद्रित ग्रिड पर कांच की थाली रखकर और एक धातु शासक का उपयोग ग्रिड के साथ काटने से छोटे १.५ cm x १.५ cm वर्गों में जम आगर पैड काटा ।
  6. यह प्रयोग के लिए तैयार है जब तक एक नम बॉक्स में हाइड्रेटेड जेल रखें ।

5. सूक्ष्म-बैक्टीरिया की तैयारी-इमेजिंग के लिए अमीबा नमूना

  1. सतह से जुड़ी बैक्टीरियल कोशिकाओं के डाह परख करने के लिए, २.१० कदम से अमीबा कोशिकाओं के 10 µ एल जोड़ने के लिए सतह से जुड़े बैक्टीरिया ३.४ कदम से ।
    नोट: यह कदम बैक्टीरिया के साथ amoebae के मिश्रण का वर्णन करता है ।
  2. planktonic कोशिकाओं के डाह को परख करने के लिए, स्टेप ३.५ से µ बैक्टीरिया के 10 planktonic l के साथ स्टेप २.१० से अमीबा कोशिकाओं के 10 µ l को मिलाएं ।
    नोट: axenically-उगाया अमीबा कोशिकाओं (०.२ के एक आयुध डिपो६०० पर) बैक्टीरिया के साथ मिश्रण से पहले धो नहीं है । एंटीबायोटिक-antimycotic सॉल्यूशन के उपयोग के कारण अमीबा कल्चर में कोई ई. कोलाई विकास देखा जाएगा ।
  3. तुरंत १.५ सेमी x १.५ सेमी calcein-AM आगर पेट्री डिश सतह पर बैक्टीरिया-अमीबा मिश्रण के शीर्ष पर ४.५ कदम से पैड जगह है ।
    नोट: एक त्वरित चिकनी गति का उपयोग कर मिश्रण के शीर्ष पर आगार पैड रखें । पैड कम नहीं धीरे मिश्रण पर के रूप में इस प्रस्ताव को परिधि की ओर कोशिकाओं को धक्का और पैड के नीचे से दूर जाता है । यह कदम यह सुनिश्चित करेगा कि बैक्टीरिया और amoebae समान रूप से मिश्रित, मैटीरियल हैं और यह दोनों कोशिका प्रकार एक ही विमान तक सिमटे हुए हैं ।
  4. अतिरिक्त तरल निकालें धीरे से बाहर pipetting पैड आसपास किसी भी शेष तरल बाहर । पेट्री डिश कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें ।
  5. एक ढक्कन के साथ पेट्री डिश के साथ कवर और एक अतिरिक्त ४० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्थिर अमीबा-बैक्टीरिया मिश्रण गर्मी । ६.१ चरण पर जाएं ।
    नोट: समय के साथ पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है के रूप में यह समय की एक ही राशि के लिए सभी नमूनों गर्मी महत्वपूर्ण है । 1 एच की एक मशीन समय की सिफारिश की है । amoebae कोशिकाओं को फट शुरू हो सकता है के रूप में 1 घंटे से अधिक समय के लिए मशीन कम reproducible हैं ।

6. माइक्रोस्कोपी-छवि अधिग्रहण

  1. छवि brightfield और हरे प्रतिदीप्ति छवियों को प्राप्त करने में सक्षम एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर amoebae. ग्रीन प्रतिदीप्ति के लिए, क्रमशः उत्तेजना और उत्सर्जन के लिए 474/27 एनएम और 525/45 एनएम के साथ ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) फिल्टर्स का इस्तेमाल करें । amoebae छवि के लिए एक 10x (≥ ०.३ संख्यात्मक एपर्चर) उद्देश्य का उपयोग करें ।
    नोट: calcein-AM आगर में ग्रीन प्रतिदीप्ति चैनल में प्रतिदीप्ति करने के लिए मरने amoebae कारण होगा । स्वस्थ amoebae हैं अन्यथा फ्लोरोसेंट नहीं.
  2. चरण कंट्रास्ट के लिए प्राप्ति समय समायोजित करें, phototoxicity को सीमित करने के लिए GFP चैनल्स, और छवि तीव्रता के डायनेमिक रेंज का अनुकूलन करें । यदि आवश्यक हो तो अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) चरण कंट्रास्ट स्थानापन्न ।
    नोट: यदि संभव हो तो चरण कंट्रास्ट और GFP प्रतिदीप्ति के लिए १००-२०० ms एक्सपोज़र का उपयोग करें । पूरे प्रयोग के दौरान एक्सपोज़र और इंस्ट्रूमेंट सेटिंग अपरिवर्तित रखें । इस मेजबान की हत्या सूचकांक कंप्यूटिंग के लिए महत्वपूर्ण है ।
  3. आदेश में मेजबान की हत्या सूचकांक की गणना के लिए अच्छे आंकड़े प्राप्त करने के लिए कम से १०० अमीबा कोशिकाओं के लिए छवियों का अधिग्रहण ।

7. छवि विश्लेषण और मेजबान हत्या सूचकांक

  1. ImageJ का उपयोग करते हुए छवि विश्लेषण करें ।
  2. फ़ाइल पर क्लिक करके ImageJ में चरण कंट्रास्ट छवि फ़ाइल खोलें । खोलें और छवि का चयन करें । छवि पर क्लिक करके सीमा समायोजित करें । विश्लेषण । दहलीज. केवल तीव्रता चोटी (चित्रा 3ए) का चयन करने के लिए निचली और ऊपरी दहलीज समायोजित करें ।
  3. प्रक्रिया क्लिक करके बाइनरी में छवि परिवर्तित करें | बाइनरी | बाइनरी बनाएं। प्रक्रिया का चयन करके छेद भरें । बाइनरी | छेद भरें।
    नोट: स्रोत के रूप में चित्र 1 में छवि का उपयोग करना, चरण ७.१-७.२ एक छवि का उत्पादन करेगा जिसमें amoebae और सतह से जुड़े बैक्टीरिया डार्क क्षेत्रों (चित्रा 3B) के रूप में दिखाई देते हैं ।
  4. सुनिश्चित करें कि क्षेत्र और मतलब ग्रे मूल्य बक्से में जांच कर रहे है विश्लेषण । माप सेट करें। मुख्य उपकरण पट्टी पर अंडाकार उपकरण का चयन करके amoebae के अनुमानित आकार को मापने । विश्लेषण क्लिक करें | प्रतिनिधि amoebae के क्षेत्र को मापने और ध्यान दें ।
  5. विश्लेषण क्लिक करके amoebae के लिए मास्क बनाएं । कणों का विश्लेषण। आकार बॉक्स में, क्षेत्र है कि amoebae शामिल होंगे दर्ज करें, लेकिन बैक्टीरिया को बाहर । दिखाएं विकल्पके लिए ड्रॉपडाउन मेनू पट्टी में मास्क का चयन करें । सुनिश्चित करें कि प्रबंधक में जोड़ें बॉक्स चेक किया गया है ।
  6. ठीक क्लिक करें और केवल amoebae और एक ROI प्रबंधक संवाद प्रदर्शित करने वाली छवि दिखाई देगी (चित्र 3C).
  7. फ़ाइल का उपयोग कर प्रतिदीप्ति छवि खोलें । खोलें और उपयुक्त फ़ाइल का चयन करें । नीचे Shift कुंजी दबाकर और सूची में प्रत्येक क्षेत्र पर क्लिक करके रॉय प्रबंधक में सभी क्षेत्रों का चयन करें (चित्रा 3डी) ।
  8. ROI प्रबंधकमें माप बटन पर क्लिक करें. यह एक परिणाम प्रत्येक अमीबा का मतलब तीव्रता मूल्य प्रदर्शित खिड़की खुल जाएगा ।
  9. एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में प्रत्येक अमीबा के लिए प्रतिदीप्ति मूल्यों की प्रतिलिपि बनाएं और सभी प्रतिदीप्ति मूल्यों का औसत लेने के द्वारा मेजबान की हत्या सूचकांक की गणना ।

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Representative Results

हम जंगली-प्रकार पी aeruginosa तनाव PA1419 या एक ΔlasR तनाव20 में ही PA14 पृष्ठभूमि में 6 सेमी-व्यास पेट्री व्यंजन में वृद्धि हुई और डाह और सतह से जुड़ी कोशिकाओं के planktonic की परख की । संस्कृतियों में एक-कालोनियों से inoculated थे पुनश्च: db संस्कृतियों में, संस्कृति ट्यूबों में एक रोलर ड्रम में रातोंरात उगाया ३७ ° c संतृप्ति करने के लिए, पुनश्च में 1:100 पतला: DB, में 8 ज के लिए उगाया 6 cm व्यास पेट्री में मिलाते हुए व्यंजन १०० rpm, और planktonic और सतह से जुड़ी aeruginosa उप आबादी खंड 3 में वर्णित के रूप में पृथक किया गया ।

सतह से जुड़ी जंगली प्रकार पी aeruginosa amoebae, जो एक दौर अमीबा कक्ष आकार और calcein प्रतिदीप्ति (चित्रा 4ए, ऊपर से बाएं पैनल) के प्रेक्षण द्वारा संकेत दिया गया था । यह एक उच्च मेजबान हत्या सूचकांक में हुई (चित्रा 4बी) । Planktonic कोशिकाओं amoebae, जो अमली अमीबा कक्ष आकृतियों और कम या कोई calcein प्रतिदीप्ति ऊपर पृष्ठभूमि (चित्रा 4एक, शीर्ष सही पैनल) के प्रेक्षण द्वारा संकेत दिया गया था द्वारा भस्म हो गए थे । यह एक अपेक्षाकृत कम मेजबान हत्या सूचकांक में हुई (चित्रा 4बी) । दोनों सतह संलग्न और ΔlasR तनाव के planktonic कोशिकाओं amoebae है, जो कम मेजबान की हत्या अनुक्रमित द्वारा संकेत दिया गया था द्वारा भस्म किया गया (आंकड़ा 4बी, नीचे पैनल) । परिणाम इस प्रकार बताते है कि डाह सतह संलग्न आबादी में विनियमित है और LasR सतह सक्रिय डाह है, जो पहले13वर्णित किया गया था के लिए आवश्यक है । इन प्रयोगों से इस प्रकार भावी प्रयोगों के लिए सुदृढ़ सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण स्थापित होते हैं.

Figure 1
चित्रा 1 : योजनाबद्ध डाह परख के एक सिंहावलोकन का वर्णन । (1) अमीबा मेजबान कोशिकाओं बड़े हो रहे हैं, (2) बैक्टीरियल संस्कृतियों हो रहे हैं, और (3) planktonic या सतह से जुड़ी बैक्टीरियल कोशिकाओं amoebae के साथ मिश्रित कर रहे है और एक ही इमेजिंग पैड का उपयोग कर विमान पर मैटीरियल । मेजबान कोशिकाओं calcein-AM, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, और छवि विश्लेषण का उपयोग कर स्वास्थ्य के लिए quantified हैं. स्केल बार्स ५० µm का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : विकास के 5 दिनों के बाद एक GYP 10 सेमी व्यास पेट्री डिश प्लेट पर बीजाणु अमीबा । बीजाणु पेट्री डिश की सतह के ऊपर बनाते हैं । इनसेट पकवान सतह के एक एकल अनुभाग के एक बढ़ाया देखने से पता चलता है । सतह बैक्टीरिया है जो इस संकल्प पर विचार नहीं किया जा सकता है शामिल हो सकते हैं । मुख्य और इनसेट छवियों में स्केल सलाखों क्रमशः 1 सेमी और 2 मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : माइक्रोस्कोपी ImageJ का उपयोग कर डेटा की छवि विश्लेषण. (क) सीमा उपकरण का उपयोग कर पीक तीव्रता का चयन । (ख) चित्रा 1 से चरण विपरीत स्रोत छवि के बाद परिणामस्वरूप छवि एक द्विआधारी छवि में बदल दिया है । (ग) छवि के बाद आने वाली छवि बाद में एक मुखौटा में परिवर्तित कर दिया है । (D) ROI प्रबंधक का उपयोग करके रुचि के क्षेत्रों के चयन के स्क्रीनशॉट. स्केल बार्स ५० µm का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 : अमीबा के प्रतिनिधि परिणाम पी aeruginosa कोशिकाओं द्वारा हत्या । (क) Calcein-हूं प्रतिदीप्ति चरण माइक्रोस्कोपी छवियों पर मढ़ा और (ख) मेजबान की हत्या अनुक्रमित सतह से जुड़ी या planktonic वंय-प्रकार या ΔlasR पी aeruginosa। जंगली प्रकार की सतह से जुड़ी P aeruginosa amoebae, जो महत्वपूर्ण calcein प्रतिदीप्ति प्रदर्शन और इसलिए एक महत्वपूर्ण मेजबान हत्या सूचकांक मारता है । Planktonic कोशिकाओं amoebae, जो थोड़ा calcein प्रतिदीप्ति प्रदर्शन और एक कम मेजबान हत्या सूचकांक उत्पादन द्वारा भस्म कर रहे हैं । दोनों सतह से जुड़े और planktonic ΔlasR amoebae द्वारा भस्म कर रहे है और एक कम मेजबान हत्या सूचकांक में परिणाम । स्केल पट्टियों का प्रतिनिधित्व ५० µm. सलाखों के तीन स्वतंत्र प्रयोगों और त्रुटियों सलाखों के औसत का संकेत मानक विचलन का संकेत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल aeruginosaमें डाह परख करने के लिए एक तेजी से और मात्रात्मक विधि का वर्णन । इस प्रोटोकॉल अंय बैक्टीरिया के साथ परीक्षण किया जा सकता है । तथापि, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि विकास के माध्यम अमीबा वृद्धि की स्थिति के साथ संगत होना चाहिए । विशेष रूप से, हम का उपयोग कर प्रोटोकॉल अनुकूलित है पुनश्च: बैक्टीरियल विकास माध्यम के रूप में DB । अंय मीडिया का उपयोग किया जाता है, तो यह कि मध्यम amoebae के साथ संगत है सत्यापित करने के लिए मौजूद कोई बैक्टीरियल कक्ष नहीं है एक वृद्धि मीडिया-केवल नियंत्रण करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।

इस विधि डाह की वृद्धि चरण निर्भरता परख करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है । विशेष रूप से, बैक्टीरियल संस्कृतियों के बजाय एक निश्चित समय बिंदु के समय की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उगाया जा सकता है । हमारे अनुभव में, यह aeruginosa में डाह के रूप में विशिष्ट समय बिंदुओं पर फसल जीवाणु संस्कृतियों के लिए महत्वपूर्ण है विकास के चरण पर निर्भर प्रतीत होता है । हमने देखा है कि पी aeruginosa में डाह पेट्री व्यंजन में वृद्धि के 6-8 ज के बीच प्रेरित किया गया था ।

विकास पर्यावरण के साथ जुड़े कई चर मेजबान स्वास्थ्य और बैक्टीरियल डाह को प्रभावित करते हैं । इस प्रकार, यह प्रत्येक प्रयोग के लिए उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक सकारात्मक नियंत्रण और ΔlasR के रूप में जंगली प्रकार की सतह-संलग्न पी aeruginosa का इस्तेमाल किया है । हम इन नियंत्रणों डाह परख प्रदर्शन किया जाता है हर बार प्रदर्शन का सुझाव । इन नियंत्रणों की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है कि मेजबान सेल मौतों amoebae की उंर के रूप में किसी भी बाह्य कारकों के कारण नहीं हैं, तापमान में बदलाव, आदि इसके अलावा, हम जैविक प्रतिकृति में सभी प्रयोगों के प्रदर्शन को स्थापित करने का सुझाव reproducibility के डाह phenotypes ।

हम अपने प्रयोगों का प्रदर्शन किया है ०.२ के एक ऑप्टिकल घनत्व पर amoebae का उपयोग कर ०.५ के एक कमजोर पड़ने के बाद कम से 1:10 और amoebae संस्कृति के तापमान ठीक से विनियमित है 22 ° c । इन विकास की स्थिति के बाहर, हमने पाया है कि विषमय बैक्टीरिया और डाह परख के reproducibility को amoebae की संवेदनशीलता बदल रहे हैं । अमीबा कोशिकाओं अपेक्षाकृत जल्दी गोली । सुनिश्चित करें कि संस्कृतियों ऊपर और नीचे तुरंत ऑप्टिकल घनत्व माप किया जाता है pipetting द्वारा reसस्पैंड कर रहे हैं । अमीबा संस्कृतियों उच्च घनत्व के लिए विकास के रूप में 1 का एक आयुध डिपो६०० घनत्व से अधिक विकसित नहीं प्रयोग के reproducibility को प्रभावित करता है । अब से 1 सप्ताह के लिए axenic संस्कृतियों का प्रचार । इसके अलावा, यह सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि amoebae विकसित कर रहे हैं axenically (चरण २.७ में शुरुआत) 20X या उच्च आवर्धन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से इस तरह कि अन्य रोगाणुओं संस्कृति में मौजूद नहीं हैं. यदि संस्कृतियों २.१० कदम में पंकिल है प्रारंभिक टीका निंनलिखित विकास के 2 दिनों के बाद, यह संभावना एक माइक्रोबियल contaminant की उपस्थिति का संकेत होगा । बैक्टीरियल संदूषण संदिग्ध है, तो हम ३७ डिग्री सेल्सियस पर amoebae संस्कृति के 1 मिलीलीटर 4-8 एच के लिए बढ़ सुझाव देते हैं । इन शर्तों के तहत एक पंकिल संस्कृति का अवलोकन जीवाणु संदूषण का सुझाव देगा । अगर दोहराया जीवाणु संक्रमण मनाया जाता है, एंटीबायोटिक antimycotic समाधान प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए ।

मेजबान हत्या सूचकांक है कि एक जीवाणु आबादी विषमय या avirulent है की एक विश्वसनीय संकेतक है । इस परख डाह के विभिंन मध्यवर्ती स्तर के बीच तुलना के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है (यानी, कम डाह की तुलना में मध्यम-कम डाह) और परिणामों की अधिक व्याख्या से बचा जाना चाहिए । संभावित तरीके इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए कई दिनों पर डाह परख की पुनरावृत्ति कर रहे है मेजबान कोशिकाओं के विभिंन बैचों का उपयोग परिणामों में विश्वास स्थापित करने के लिए, अतिरिक्त प्रयोग दोहराने प्रदर्शन, और उचित प्रदर्शन सांख्यिकीय विश्लेषण ।

planktonic कोशिकाओं के संक्रमण (MOI) की बहुलता जीवाणु संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को सामान्य करके नियंत्रित की जा सकती है. हालांकि, इस परख सतह से जुड़े बैक्टीरिया कोशिकाओं के MOI पर नियंत्रण नहीं है । हमने देखा है कि बैक्टीरियल सतह घनत्व समय के साथ बढ़ जाती है । इस प्रकार, पेट्री डिश में विकास के समय का समायोजन सतह घनत्व में इसी परिवर्तन में परिणाम हो सकता है । इसके अलावा, सतह घनत्व सतह की सामग्री पर निर्भर करता है । aeruginosa कोशिकाओं को यहां वर्णित परख में polystyrene सतहों के लिए देते हैं । हालांकि, कांच, आगर सहित अन्य सतहों, और polyacrylamide भी13परख हो सकता है । एकल स्तरित बैक्टीरियल आबादी की सतह घनत्व 100X आवर्धन चरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मापा जा सकता है । यदि सतह घनत्व बहु स्तरित हैं, फोकल माइक्रोस्कोपी उपयुक्त हो सकता है ।

यहां, हमने बैक्टीरियल डाह को मापने के लिए एक तेजी से और मजबूत तरीका बताया है । ऐसी मशीन बार के रूप में व्यक्तिगत मापदंडों को संशोधित करके, फ्लोरोसेंट डाई, बैक्टीरियल तनाव, मेजबान सेल प्रकार, या विकास मीडिया, इस विधि जीवों और विकास की स्थिति की एक विस्तृत श्रृंखला में डाह यों तो बढ़ाया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

केपी और के रूप में लिखा और पांडुलिपि संशोधित । केपी ने प्रयोगों और विश्लेषण का प्रदर्शन किया. इस काम के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) कैरियर संक्रमण पुरस्कार (K22AI112816) के रूप में करने के लिए द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto agar, dehydrated BD Difco 214010
Antibiotic-Antimycotic (100X) Life Technologies 15240062 Aliquot < 1 mL and store at -20 °C
Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) Life Technologies C34852 Calcein Acetoxymethyl (AM)
Calcium chloride, anhydrous Sigma-Aldrich C1016
D-Glucose Fisher Chemical D16500 Dextrose
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879
Folic acid Sigma-Aldrich F8758
LB-Miller BD Difco 244620
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Yeast extract Oxoid LP0021
Special peptone Oxoid LP0072
Potassium hyroxide Fisher Chemical P250
Potassium phosphate monobasic  Sigma-Aldrich P0662
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Chemical S373
Vitamin B12 Sigma-Aldrich V2876
Strains
Dictyostelium discoideum Siryaporn lab Strain AX318
Escherichia coli Siryaporn lab Strain B/r17
Pseudomonas aeruginosa Siryaporn lab PA14 PA14 strain19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR Siryaporn lab AFS20.1 PA14-derived strain20
Supplies
0.22 µm filter  Millipore SCGPT01RE For filter sterilization
Conical tube, 15 mL Corning 352097
Glass storage bottles Pyrex 13951L 250 mL, 500 mL, 1000 mL
Petri dish, 6 cm diameter Corning 351007 60 x 15 mm polystyrene plates
Petri dish, 10 cm diameter Fisher FB0875712 100 x 15 mm polystyrene plates
Plastic containers with lid Ziploc 2.57E+09 Square 3-cup containers
Glass plates Bio-Rad 1653308 For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.
Wooden sticks Fisher 23-400-102 
Equipment
Eclipse Ti-E microscope  Nikon MEA53100 Microscope setup
10X Plan Fluor Ph1 objective  0.3 NA Nikon MRH20101 Microscope setup
Fluorescence excitation source Lumencor Sola light engine Microscope setup
Fluorescence filter set Semrock LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000  Microscope setup
Orca Flash 4.0 V2 Camera Hamamatsu 77054098 Microscope setup
ImageJ NIH v. 1.49 Software for image analysis
MATLAB Mathworks R2013 Software for image analysis
Orbital shaker incubator VWR 89032-092 For growth of bacteria at 37 °C
Platform shaker Fisher 13-687-700 For growth of amoebae at 22 °C
Spectrophotometer Biochrom Ultrospec 10
Undercounter refrigerated incubator Fisher 97990E For growth of amoebae at 22 °C
Isotemp waterbath  Fisher 15-462-21Q For cooling media to 55 °C

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References

  1. Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
  2. Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
  3. Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
  4. Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
  5. Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
  6. Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
  7. Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
  8. Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
  9. Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
  10. Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
  11. Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, Abstract 304 58 (1990).
  12. Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
  13. Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
  14. Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
  15. Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
  16. Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
  17. Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
  18. Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
  19. Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  20. O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).

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-अभियांत्रिकी अंक १३६ Pseudomonas aeruginosa सतह से जुड़ी Planktonic Dictyostelium discoideum रैपिड डाह परख डाह में फिल्म
एक तेजी से छवि आधारित बैक्टीरियल डाह परख अमीबा का उपयोग
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Perinbam, K., Siryaporn, A. A Rapid… More

Perinbam, K., Siryaporn, A. A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba. J. Vis. Exp. (136), e57844, doi:10.3791/57844 (2018).

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