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Bioengineering

Un dosage de la Virulence bactérienne rapide basé sur une Image à l’aide d’amibe

Published: June 27, 2018 doi: 10.3791/57844
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Physics and Astronomy, University of California, 2Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à mesurer la virulence de bactéries planctoniques ou attaché à la surface à l’aide de d. discoideum (amibes) en tant qu’hôte. Virulence est mesurée sur une période de 1 h et hôte tuant est quantifiée à l’aide de fluorescence microscopie et analyse d’images. Nous démontrons ce protocole à l’aide de la bactérie P. aeruginosa.

Abstract

Les dosages traditionnels de la virulence bactérienne impliquent une exposition prolongée des bactéries au cours de plusieurs heures pour les cellules de l’hôte. Pendant ce temps, bactéries peuvent subir des changements dans la physiologie en raison de l’exposition à l’environnement de croissance d’hôte et la présence de cellules hôtes. Nous avons mis au point un test permettant de mesurer rapidement l’état de la virulence des bactéries qui réduisent au minimum l’étendue à laquelle les bactéries se développent en présence de cellules de l’hôte. Les bactéries et les amibes sont mélangés et immobilisés sur un seul plan d’imagerie à l’aide d’un tampon d’agar. La procédure utilise imagerie de fluorescence monocellulaires avec calcéine-acétoxyméthyl ester (calcéine-AM) comme indicateur de la santé de cellule hôte. La fluorescence des cellules de l’hôte est analysée après 1 h d’exposition des cellules hôtes aux bactéries à l’aide de la microscopie à épifluorescence. Logiciel d’analyse image est utilisée pour calculer un index de mise à mort d’hôte. Cette méthode a été utilisée pour mesurer la virulence dans planctoniques et attaché à la surface Pseudomonas aeruginosa sous-populations durant le stade initial de la formation de biofilm et peuvent être adaptées à d’autres bactéries et autres stades de croissance de biofilm. Ce protocole fournit une méthode rapide et fiable de mesurer la virulence et évite beaucoup des complexités liées à la croissance et le maintien des lignées cellulaires de mammifères. Phénotypes de résistance mesurées ici à l’aide d’amibes ont également été validés à l’aide de macrophages de souris. En particulier, ce test a été utilisé pour établir cette virulence augmente de surface pièce jointe chez P. aeruginosa.

Introduction

Infection bactérienne est l’une des principales causes de mortalité chez l’homme et les animaux1,2. La capacité de mesurer la virulence des bactéries dans des cultures ou des biofilms est importante dans les milieux de soins de santé et de la recherche. Nous décrivons ici une méthode relativement simple, rapide et polyvalent pour quantifier la virulence bactérienne. L’organisme eucaryote Dictyostelium discoideum (amibes) est utilisé comme organisme modèle hôte. D. discoideum a été utilisé comme un hôte pour identifier les facteurs de virulence Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)3,4,5 et autres bactéries6,7 ,8 et est susceptibles d’être en grande partie les mêmes facteurs de virulence qui tuent les cellules mammifères, y compris le type III sécrétion9,10. Précédents essais de virulence à l’aide de d. discoideum ont impliqué une exposition prolongée des bactéries aux cellules de d. discoideum au cours des heures3,4,5. Le protocole, ici, présente une méthode rapide de détermination de virulence à l’aide de cette amibe. Ce protocole (Figure 1) décrit comment faire pour : (1) poussent les amibes axéniques (en l’absence de bactéries), (2) développer des bactéries pour le dosage, (3) préparer des bactéries et cellules de l’hôte pour la microscopie, (4) effectuent la microscopie à épifluorescence et (5) analysent amibe fluorescence.

Amibes sont initialement striées sur des stocks congelés et cultivés sur une pelouse d' Escherichia coli (e. coli), où les amibes produisent des spores. Ces spores sont cueillies et inoculés dans un milieu enrichi de croissance axénique. Les amibes sont maintenues grâce à une croissance axénique dans des conditions nutritives jusqu'à ce qu’ils sont prêts à être mélangés avec les bactéries pour l’évaluation de la virulence bactérienne. La survie ou la mort des amibes est quantifiée par la mesure de la fluorescence de calcéine-acétoxyméthyl (calcéine-AM), qui est clivé par les estérases intracellulaires et, ainsi, activé pour fluorescence11,12. Direct amibes présentent peu ou pas de fluorescence qu’a souligné et cellules mourantes réagissent en intensément. Ce résultat est dû à l’incorporation de petite ou pas de calcéine-AM dans les amibes sains et l’incorporation et le clivage du substrat dans les amibes stressé13. Ce comportement diffère notamment de fluorescence de calcéine-AM dans les cellules de mammifères11,14,15,16.

Les bactéries qui seront évaluées pour la virulence sont cultivés séparément. Ici, nous décrivons comment mesurer la virulence de l’agent pathogène opportuniste de P. aeruginosa et détailler comment quantifier la virulence des planctonique (natation) et attaché à la surface de certaines sous-populations. Ce protocole peut être adapté pour tester la virulence d’autres bactéries. Dans la section résultats de représentant, nous montrons que la virulence est activé dans les cellules attachées à la surface et est faible dans les cellules planctoniques, qui a été rapporté précédemment13. Activé par virulence rattaché au surface P. aeruginosa tue amibes alors que non virulentes cellules planctoniques sont consommés par les amibes. Si la virulence des bactéries planctoniques est uniquement être analysée, les bactéries peuvent être cultivées dans des tubes à culture ordinaire plutôt que d’utiliser des boîtes de Pétri comme décrit dans le protocole.

La croissance des amibes et P. aeruginosa cultures doit être coordonnée, tel que les cultures P. aeruginosa atteint la phase de croissance prévue, tandis que les amibes sont de plus en plus à l’état stable dans des conditions de nutriments. Cette condition nécessite généralement des cultures d’amibes à diluer au moins 1 jour avant lorsqu’ils sont mélangés avec des bactéries. Les amibes et bactéries sont immobilisées à l’aide de tampons de gélose, sont conjointement mis en incubation pendant 1 h et imagés à l’aide d’une faible résolution (10 X, ouverture numérique 0,3) filtres de protéine de fluorescence objective, verte (GFP) et une caméra d’imagerie. Analyse peut être effectuée à l’aide disponible gratuitement logiciel ImageJ ou personnalisées logiciel analyse d’images. Notre analyse a été réalisée à l’aide de nos propres logiciels écrits à l’aide d’une analyse scientifique paquet13. Le logiciel devrait créer un masque à l’aide de l’image de contraste de phase et extraire des valeurs de fluorescence des zones masquées à l’image de fluorescence. Valeurs de fluorescence sont en moyenne sur au moins 100 cellules, ayant pour résultat un index de mise à mort d’hôte numérique.

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Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées à l’Université de Californie, Irvine.

1. tampons et Solutions

  1. Préparer, lysogénie bouillon (LB) dans un flacon de verre de 1 L en ajoutant 25 g de mélange de LB-Miller dans 1 L d’eau bidistillée (ddH2O). Pour boîtes de Pétri, ajouter une supplémentaire 20 g d’agar. Autoclave pour stériliser. Verser 25 mL de milieu gélosé fondu dans Pétri de 10 cm de diamètre et laisser pour solidifier à température ambiante. Stocker des milieux liquides à température ambiante et les boîtes de gélose à 4 ° C.
  2. Préparer les assiettes de Glucose levure Peptone (GYP) dans un flacon de verre de 1 L en mélangeant 1 g de D-glucose, extrait de 2 g de peptone, 0,25 g de levure, 4,2 g de KH2PO4, 5,1 g Na2HPO47 H2O et 25 g d’agar dans 1 L de ddH2 O. Autoclave pour stériliser. Verser 25 mL d’agar fondu dans Pétri de 10 cm de diamètre et laisser pour solidifier à température ambiante. Conserver à 4 ° C.
  3. Préparer des moyen de Peptone S (PS) dans un flacon de verre de 1 L en mélangeant 10 g de peptone, extrait de 7 g de levure, 15 g de D-glucose, 0,12 g de Na2HPO47 H2O, 1,4 g de KH2PO4, 40 µg de vitamine B12 , et 80 µg d’acide folique dans 800 mL de ddH2O. calibrer un pH-mètre électronique à l’aide de pH 4 et les normes de pH 7 si le pH-mètre n’a pas été utilisé en une journée.
    1. Mesurer le pH du milieu PS pH-mètre. Ajouter 5 M KOH ou 5 M H3PO4 pour ajuster le pH à 6,5. Ajuster le volume final de 1 L à l’aide de ddH2filtre O. stériliser à l’aide de filtres sous vide de 0,22 µm et conserver à 4 ° C.
      NOTE : Procéder avec prudence avec les ajustements de pH en portant des équipements de protection y compris les gants, vêtements de protection, protection des yeux et visage protection.
  4. Préparer 10 x premier tampon développement (DB') tampon non contrôlé dans une bouteille de verre de 1 L en ajoutant 3,4 g de KH2PO4, 13,4 g de Na2HPO4 7 H2O et FD2O à un volume total de 800 mL. Calibrer un pH-mètre électronique à l’aide de pH 4 et les normes de pH 7 si le pH-mètre n’a pas été utilisé en une journée.
    1. Mesurer le pH de la mémoire tampon en utilisant le pH-mètre électronique. Ajuster le pH à 6,5 en ajoutant doucement 5 M KOH ou 5 M H3PO4 selon les besoins. Ajuster le volume final à 1 L avec les ddH2O et stériliser à l’autoclave. Conserver à température ambiante.
      NOTE : Procéder avec prudence avec les ajustements de pH en portant des équipements de protection y compris les gants, vêtements de protection, protection des yeux et visage protection.
  5. Faire 1 x tampon de développement (DB) en mélangeant 100 mL de 10 x DB' tampon avec 1 mL de stérilisé de MgCl 2 M2, et 1 mL de stérilisé 1 M CaCl2. Ajuster le volume final de 1 L dans un flacon de verre de 1 L en utilisant un autoclave ddH stérilisé2O. magasin à la température ambiante.
  6. Préparer PS:DB milieu dans un flacon de verre de 1 L en mélangeant 100 mL de milieu stérilisé de PS, 100 mL de stérilisé 10 x DB' tampon et stérilisé ddH2O pour un volume total de 1 L. supplément avec 1 mL de stérilisé de MgCl 2 M2 et 1 mL de stérilisé 1 M CaCl 2. conserver à 4 ° C.
  7. Préparer la solution mère de calcéine-AM en ajoutant 50 µL de DMSO à 50 µg de calcéine-AM dans le récipient en plastique fourni par le fabricant. Conserver à-20 ° C.

2. croissance et le maintien des amibes

  1. Cultiver la souche e. coli b/r17 comme source de nourriture pour les amibes pendant la période de croissance initiale. Strie Escherichia coli b/r d’un stock congelé conservés à-80 ° C sur une gélose LB et incuber à 37 ° C pendant la nuit pour obtenir des colonies individuelles.
  2. Ensemencer une seule colonie d' Escherichia coli b/r dans 2 mL de milieu LB et incuber dans un tambour de rouleau ou un shaker à 37 ° C pendant la nuit.
  3. Porter la nuit culture d’e. coli à la température ambiante. À l’aide d’un bâton en bois, ensemencer les amibes provenant d’un stock de surgelés conservés à-80 ° C à 750 µL de la culture au jour le jour.
    Remarque : Utilisation d. discoideum la souche AX3, qui est capable de croissance axénique18. Cette étape ne nécessite pas de croissance axénique, mais les étapes suivantes auront son exigence.
  4. Immédiatement ajouter 700 µL du mélange amibes -e. coli sur une plaque de Glucose levure Peptone (GYP). Diffuser la culture uniformément sur la surface de la plaque en l’inclinant et-avant-arrière et gauche-droite au besoin. Éviter l’usage d’un épandeur.
  5. Placer la plaque GYP avec agar vers le haut dans une boîte qui maintient une humidité élevée. Utiliser deux contenants de plastique jetables (183 x 183 cm x 91 cm) empilés sur le dessus de l’autre. Remplir le réservoir de bas d’environ 25 mL d’eau et placer le récipient supérieur avec plusieurs 0,5 cm de diamètre trous percés dans le plancher du conteneur pour que l’humidité vers le réservoir d’eau le récipient supérieur.
  6. Incuber la plaque GYP et boîte à 22 ° C pendant 4 à 5 jours jusqu'à ce que les spores de l’amibe, on observe de plus en plus près de la surface de la plaque (Figure 2). Utiliser un incubateur réfrigéré pour Incuber les plaques plutôt que l’incubation à température ambiante.
    Remarque : Après que les spores ont augmenté, ils restent viables sur plaques pendant plusieurs semaines, lorsqu’il est conservé à 4 ° C. Ranger les plaques côté agar vers le haut. Après 3-4 jours d’incubation, les zones de compensation dans la pelouse bactérienne peuvent être observés, qui indiquent le début de la sporulation amibe.
    1. Observer les amibes petites spores au-dessus de la surface de la plaque après 4-5 jours d’incubation (Figure 2).
      Remarque : Ne poussent pas les amibes pendant plus d’une semaine, diminution de la qualité des spores au-delà de cette période de temps.
  7. Recueillir des spores d’amibes pour préparer la croissance axénique des amibes en balayant une pointe de pipette stérile de 1 mL parallèle à la surface de la plaque. Recueillir des spores de la moitié d’une boîte de Pétri de 10 cm.
    Remarque : Ne pas toucher l’extrémité de la surface de la gélose que cette proposition permettra de recueillir un grand nombre d’Escherichia coli.
  8. Remettre en suspension les amibes sur l’embout de la pipette en plongeant la pointe dans 1 mL de milieu de PS et doucement pipetage de haut en bas.
  9. Transférer le mélange inoculé dans un flacon de 250 mL contenant 25 mL de milieu PS complété avec la solution antibiotique-antimycosiques à 0,25 x concentration.
    NOTE : Stocker la solution antibiotique-antimycosique comme 250 µL d’extraits à-20 ° C. Éviter les cycles répétés de dégel et le gel de cette solution, car cela peut diminuer son efficacité.
  10. Cultiver les amibes axéniques à 22 ° C dans un agitateur rotatif à 100 tr/min. Pour le test de virulence à l’étape 5, la croissance de cellules à une densité optique mesurée à 600 nm (OD600) de 0,2 à 0,5.
    Remarque : Cette étape nécessite 3-4 jours de croissance entre le moment de l’inoculation (étape 2.7). Si les cellules ont atteint une densité plus élevée, diluer la culture en milieu de PS à une OD600 ou inférieure à 0,05 et poussent à une OD600 de 0,2 à 0,5.

3. la croissance de P. aeruginosa

  1. Prélever une colonie unique de P. aeruginosa sur un plat de livre, il ensemencer une culture PS:DB de 2 mL et poussent en une nuit à 37 ° C à saturation.
    Remarque : Ne pas ajouter la solution antibiotique-antimycosiques aux médias PS:DB.
  2. Diluer la nuit culture au 1/100 ou 1 : 1 000 dans une boîte de Pétri 6 cm de diamètre à l’aide de PS:DB. Si la virulence des cellules planctoniques est uniquement être dosée, poussent les cultures à l’aide de tubes de culture conventionnelle à la place. Secouez la culture sur un rotateur de benchtop fixé à 100 tr/min à 37 ° C.
  3. Récolter les cultures à des moments spécifiques pour assurer la reproductibilité. À 30 min à 1 h avant d’évaluer la virulence, préparer un tampon agar comme décrit dans la section 4.
    Remarque : La Virulence chez P. aeruginosa est induite par environ 8 h de croissance sur les surfaces.
  4. Pour isoler les cellules attachées à la surface, retirer le milieu liquide de la boîte de Pétri, se laver immédiatement avec 1 mL de tampon de DB pour éliminer les cellules planctoniques et passez immédiatement à l’étape 5.1.
    ATTENTION : Ne pas laver à plus de 30 s comme cela va perturber et détacher les non-inscrits sur la surface des cellules et peuvent influer sur la mesure de la virulence.
  5. Pour isoler les cellules planctoniques, transférer 10 µL de la culture de la boîte de Pétri dans une boîte de Petri propre et passez immédiatement à l’étape 5.1.

4. microscopie - préparation de la garniture de Agar

  1. Préparer les coussinets agar environ 30 min à 1 h avant amibes sont prêts à être mélangés avec P. aeruginosa.
  2. Cuire au four 50 mL de gélose de 1 % (p/v) dans le tampon de la DB dans un ballon jaugé de 250 mL. Mélanger toutes les 20 s jusqu’en touffes d’agar disparaissent.
  3. Refroidir l’agar fondu en le plaçant dans le bain-marie préchauffé à 55 ° C pendant 15 min.
  4. Ajouter 15 µL de la solution mère de calcéine-AM à 15 mL de l’agar fondu dans un tube à fond conique. Mélanger en retournant doucement le tube le 4 - 5 fois et passer immédiatement à l’étape suivante.
    Remarque : Exécutez cette étape dans un tube à centrifuger en polypropylène 15 mL. Ne pas utiliser un récipient en verre épais car cela provoquerait l’agar pour solidifier trop rapidement.
  5. Verser le mélange agar fondu sur le dessus une plaque de verre de 12 cm x 10 cm et laisser l’agar pour solidifier pendant 10 minutes à température ambiante. Couper le bloc de gélose solidifiée en plus petites sections de 1,5 x 1,5 cm en plaçant la plaque de verre sur une grille imprimée et coupe le long de la grille à l’aide d’une règle métallique.
  6. Garder le gel hydraté dans une boîte humide jusqu'à ce qu’il est prêt à l’emploi.

5. microscopie - préparation de l’échantillon de bactéries-amibe pour l’imagerie

  1. Pour doser la virulence des non-inscrits sur la surface des cellules bactériennes, ajouter 10 µL de cellules amibe de l’étape 2.10 à bactéries attachées à la surface de l’étape 3.4.
    Remarque : Cette étape décrit le mélange des amibes par des bactéries.
  2. Pour doser la virulence des cellules planctoniques, mélanger 10 µL de cellules amibe de l’étape 2.10 avec 10 µL de bactéries planctoniques de l’étape 3.5.
    Remarque : Ne pas laver les cellules cultivées axéniques amibe (à une OD600 de 0,2 à 0,5) avant de les mélanger avec les bactéries. Aucune croissance d’e. coli ne sera observée dans la culture de l’amibe en raison de l’utilisation de la solution antibiotique-antimycosiques.
  3. Placer immédiatement le tampon d’agar calcéine-AM 1,5 x 1,5 cm de l’étape 4.5 sur le mélange de bactéries-amibe sur la surface de la boîte de Pétri.
    Remarque : Placez agar sur le mélange à l’aide d’un rapide mouvement souple. N’abaissez pas le coussinet lentement sur le mélange que ce mouvement tend à pousser les cellules vers la périphérie et loin sous le coussin. Cette étape fera en sorte que les bactéries et les amibes sont uniformément mélangés, immobilisé et que les deux types de cellules sont confinés à un même plan.
  4. Retirer le liquide en excès par pipetage doucement sur n’importe quel liquide restant entourant le bloc de gélose. Laissez la boîte de Pétri sécher pendant 20 min à température ambiante.
  5. Couvrir avec la boîte de Pétri avec un couvercle et laisser incuber le mélange de bactéries-amibe immobilisé à température ambiante pendant une supplémentaire 40 min. passez à l’étape 6.1.
    Remarque : Il est important d’Incuber tous les échantillons pendant le même laps de temps, comme les augmentations de fluorescence de fond au fil du temps. Une durée d’incubation de 1 h est recommandée. Incubation pendant plus de 1 h est moins reproductible que les cellules amibes peuvent commencent à éclater.

6. microscopie - Acquisition d’images

  1. Amibes d’image à l’aide d’un microscope à fluorescence capable d’acquérir des images de fluorescence de fond clair et vert. Pour la fluorescence verte, utiliser des filtres de protéine (GFP) de fluorescence verte avec 474/27 nm et 525/45 nm pour l’excitation et d’émission, respectivement. Utilisez un objectif de (ouverture numérique ≥0.3) X 10 afin d’imager les amibes.
    Remarque : La calcéine-AM dans la gélose entraînera amibes mourants à fluorescence dans le chenal de fluorescence verte. Amibes sains sont par ailleurs pas fluorescents.
  2. Ajuster le temps d’acquisition pour le contraste de phase, canaux GFP pour limiter la phototoxicité et optimiser la plage dynamique de l’intensité de l’image. Remplacez par le contraste de phase (DIC) de contraste interférentiel différentiel si nécessaire.
    Remarque : Utilisez les expositions de 100 à 200 ms pour contraste de phase et fluorescence GFP si possible. Garder les paramètres d’exposition et instrument inchangés tout au long de l’expérience entière. Cela est essentiel pour le calcul de l’index de mise à mort d’hôte.
  3. Acquisition d’images au moins 100 cellules d’amibe afin d’obtenir de bonnes statistiques pour le calcul de l’hôte index de mise à mort.

7. analyse et hôte Index de mise à mort de l’image

  1. Effectuer l’analyse d’images à l’aide de ImageJ.
  2. Ouvrez le fichier d’image de contraste phase dans ImageJ en cliquant sur fichier | Ouvrir et en sélectionnant l’image. Régler le seuil en cliquant sur Image | Analyse | Seuil de. Ajustez le seuil inférieur et supérieur pour sélectionner uniquement le pic d’intensité (Figure 3A).
  3. Convertir l’image binaire en cliquant sur processus | Binaire | Rendre le binaire. Remplissez les trous en sélectionnant processus | Binaire | Remplir les trous.
    Remarque : L’utilisation de l’image dans la Figure 1 comme source, étapes 7,1 à 7,2 produira une image dans laquelle les amibes et les non-inscrits sur la surface des bactéries apparaissent comme des régions sombres (Figure 3B).
  4. Vérifiez que les cases zone et gris valeur moyenne sont cochées dans Analyze | Définir des mesures. Mesurer la taille approximative des amibes en sélectionnant l’outil ovale sur la barre d’outils principale. Cliquez analyser | Mesure et notez la zone d’amibes représentatifs.
  5. Créer des masques pour les amibes en cliquant Analyze | Analyser les particules. Dans la zone taille, entrer dans la zone qui inclura les amibes sans exclure les bactéries. Sélectionner des masques dans la barre de menu déroulant pour l' option de montrer. Assurez-vous que la case Ajouter au Manager est cochée.
  6. Cliquez sur OK et une image montrant seulement les amibes et un gestionnaire de ROI, boîte de dialogue apparaîtra (Figure 3C).
  7. Ouvrez l’image de fluorescence à l’aide de fichier | Ouvrir et en sélectionnant le fichier approprié. Sélectionnez toutes les régions dans le Gestionnaire de ROI en maintenant la touche Maj enfoncée et en cliquant sur chaque région dans la liste (Figure 3D).
  8. Cliquez sur le bouton de mesure dans le Gestionnaire de ROI. Cela ouvrira une fenêtre de résultats affiche la valeur de la densité moyenne de chaque amibe.
  9. Copier les valeurs de fluorescence pour chaque amibe dans un tableur et calculer l’hôte tuant indice en calculant la moyenne de toutes les valeurs de fluorescence.

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Representative Results

Nous avons grandi sauvage souche de P. aeruginosa PA1419 ou un ΔlasR souche20 dans le même contexte de PA14 en Pétri de 6 cm de diamètre et dosé la virulence des cellules planctoniques et attaché à la surface. Les cultures ont été inoculés de single-colonies à PS:DB cultures, du jour au lendemain en tubes de culture dans un fût de rouleau à 37 ° C à saturation, dilué au 1/100 en PS:DB, cultivés pendant 8 h en 6 cm de diamètre Pétri secouant à 100 tr/min et planctoniques et attaché à la surface P. aeruginosa sous-populations ont été isolées comme décrit à l’article 3.

Rattaché au surface sauvage de P. aeruginosa tué amibes, qui a été indiqué par une forme de cellule ronde amibe et l’observation de calcéine fluorescence (Figure 4A, panneau supérieur gauche). Il en est résulté un index de mise à mort de hôte haute (Figure 4B). Les cellules planctoniques ont été consommés par les amibes, qui a été indiqué par l’amibe amorphe cellule formes et l’observation de la fluorescence de calcéine peu ou pas au-dessus de fond (Figure 4A, panneau supérieur droit). Il en est résulté un index de mise à mort de hôte relativement faibles (Figure 4B). Tant attaché à la surface des cellules planctoniques de la souche delasR Δ étaient consommées par les amibes, qui a été indiqué par le hôte faible tuant index (Figure 4B, panneau inférieur). Les résultats montrent donc que la virulence est augmentée chez les populations attachées à la surface et le LasR est requis pour la virulence de surface-activé, qui a été décrit précédemment13. Ces expériences ainsi établissent des contrôles positifs et négatifs robustes pour de futures expériences.

Figure 1
Figure 1 : Schéma décrivant une vue d’ensemble de l’essai de virulence. (1) cellules hôtes amoeba sont cultivés, cultures (2) bactériennes sont cultivés, et (3) planctoniques ou attaché à la surface des cellules bactériennes sont mélangés avec les amibes et immobilisées sur le même plan d’imagerie à l’aide d’un tampon d’agar. Cellules de l’hôte sont quantifiés pour la santé à l’aide de calcéine-AM, microscopie à fluorescence et analyse d’images. Barres d’échelle représentent 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Amoeba spores sur un plat de Pétri GYP 10 cm-diamètre après 5 jours de croissance. Forme de spores au-dessus de la surface de la boîte de Pétri. L’encart montre une vue agrandie d’une seule section de la surface du plat. La surface peut contenir des bactéries qui ne peuvent être discernés à cette résolution. Barres d’échelle dans les images principales et encart représentent 1 cm et 2 mm, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Analyse des données de la microscopie à l’aide de ImageJ d’image. (A) sélection de l’intensité du pic à l’aide de l’outil seuil. (B) l’image obtenue après que l’image de source de contraste de phase de la Figure 1 est converti en une image binaire. (C) l’image obtenue après que l’image est ensuite converti en un masque. (D) captures d’écran de la sélection des régions d’intérêt en utilisant le gestionnaire de ROI. Barres d’échelle représentent 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Des résultats représentatifs de l’amibe, tué par les cellules P. aeruginosa . (A) fluorescence de calcéine-AM superposée sur des images de microscopie de phase et d’hôte (B) , tuant les indices de surface-attaché ou planctoniques sauvage ou Δde P. aeruginosa lasR. Sauvage attaché à la surface P. aeruginosa tue les amibes, qui présentent la fluorescence de calcéine importante et donc une importante foule tuant index. Les cellules planctoniques sont consommés par les amibes, qui présentent peu de fluorescence calcéine et produisent un index de mise à mort de hôte faible. Attaché à la surface tant Δ planctoniqueslasR sont consommés par les amibes et résultat dans un index de mise à mort d’hôte faible. Barres échelle représentent 50 µm. barres indiquent la moyenne de trois expériences indépendantes et les barres d’erreurs indiquent écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce protocole décrit une méthode rapide et quantitative pour doser la virulence chez P. aeruginosa. Ce protocole peut être testé avec d’autres bactéries. Toutefois, il est important de garder à l’esprit que le milieu de croissance doit être compatible avec les conditions de croissance d’amibe. En particulier, nous avons optimisé le protocole en utilisant PS:DB comme le milieu de croissance bactérienne. Si les autres médias sont utilisés, il peut être nécessaire d’effectuer un contrôle de croissance de médias uniquement dans lequel il n’y a aucune cellule bactérienne présente pour vérifier que le support est compatible avec les amibes.

Cette méthode peut être étendue pour doser la dépendance de phase de croissance de virulence. En particulier, les cultures bactériennes peuvent être cultivés pour un large éventail de fois au lieu d’un point de temps fixe. Dans notre expérience, il est important de récolter les cultures bactériennes à des moments spécifiques comme la virulence chez P. aeruginosa semble dépendre de la phase de croissance. Nous avons observé que la virulence chez P. aeruginosa a été induite entre 6-8 h de croissance dans les boîtes de Pétri.

Nombreuses variables associées à l’environnement de croissance affectent la santé de l’hôte et de la virulence bactérienne. Ainsi, il est important d’utiliser des contrôles positifs et négatifs appropriés pour chaque expérience. Nous avons utilisé sauvage attaché à la surface P. aeruginosa comme un contrôle et Δ positivelasR comme témoin négatif. Nous vous suggérons d’effectuer ces contrôles chaque fois que le test de virulence est réalisé. Ces contrôles sont importants pour vérifier que décès de cellule hôte ne sont pas en raison de facteurs externes tels que l’âge des amibes, variations de température, etc en outre, nous vous suggérons effectuer toutes les expériences dans réplication biologique d’établir la reproductibilité des virulence des phénotypes.

Nous avons effectué nos expériences utilisant des amibes à une densité optique de 0,2 à 0,5 après une dilution d’au moins 01:10 et ont réglé la température de la culture d’amibes précisément à 22 ° C. En dehors de ces conditions de croissance, nous avons trouvé que la susceptibilité des amibes de bactéries virulentes et la reproductibilité du dosage virulence sont altérées. Cellules d’amibe pellet relativement rapidement. Veiller à ce que les cultures sont resuspendues en pipettant également haut et en bas, juste avant la mesure de la densité optique est faite. Ne poussent pas les cultures de l’amibe supérieurs à une densité de600 OD 1 car la croissance à forte densité influe sur la reproductibilité de l’expérience. Propager la culture axénique pour pas plus de 1 semaine. En outre, il est important de vérifier que les amibes sont cultivées en conditions axéniques (commençant à l’étape 2.7) par 20 X ou microscopie de grossissement élevé tels que d’autres microbes ne sont pas présents dans la culture. Si les cultures sont troubles à l’étape 2.10 après 2 jours de croissance suite à l’inoculation initiale, cela indique probablement la présence d’un contaminant microbien. Si la contamination bactérienne est suspectée, nous vous suggérons de 1 mL de la culture d’amibes à 37 ° C pendant 4 à 8 heures de plus en plus. L’observation d’une culture trouble dans ces conditions vous suggère une contamination bactérienne. Si répété la contamination bactérienne est observée, la solution antibiotique-antimycosiques doit être remplacée.

L’index de mise à mort d’hôte est un indicateur fiable de savoir si une population bactérienne est virulent ou non virulente. Ce test n’a pas été optimisé pour les comparaisons entre les différents niveaux intermédiaires de virulence (c.-à-d., de faible virulence par rapport à la moyenne-faible virulence) et une interprétation des résultats doit être évitée. Les méthodes possibles pour résoudre ce problème sont la répétition de l’essai de virulence sur plusieurs jours à l’aide de différents lots de cellules hôtes pour établir la confiance dans les résultats, des expériences répétées supplémentaires et l’exécution appropriée analyses statistiques.

La multiplicité d’infection (MOI) de cellules planctoniques peut être contrôlée en normalisant la densité optique de la culture bactérienne. Cependant, ce dosage ne contrôle pas le ministère de l’intérieur de cellules bactériennes attachées à la surface. Nous avons observé que la densité bactérienne de surface augmente avec le temps. Par conséquent, réglage temps de croissance dans la boîte de Pétri peut entraîner un changement correspondant dans masse surfacique. En outre, la densité de surface dépend du matériau de la surface. Cellules P. aeruginosa s’attachent sur le polystyrène dans l’essai décrit ici. Cependant, les autres surfaces, y compris le verre, agar et polyacrylamide peuvent également être dosé13. La masse surfacique des populations bactériennes seule couche peut être mesurée à l’aide de 100 X microscopie de phase de grossissement. Si la densité surface est multicouche, microscopie confocale peut être appropriée.

Ici, nous avons décrit une méthode rapide et fiable pour mesurer la virulence bactérienne. En modifiant les différents paramètres tels que le temps d’incubation, le colorant fluorescent, la souche bactérienne, le type de cellule hôte ou milieux de croissance, cette méthode peut être étendue afin de quantifier la virulence dans un large éventail d’organismes et des conditions de croissance.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

KP et AS a écrit et révisé le manuscrit. KP effectué les expériences et l’analyse. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH) Bourse de Transition de carrière (K22AI112816) à As.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto agar, dehydrated BD Difco 214010
Antibiotic-Antimycotic (100X) Life Technologies 15240062 Aliquot < 1 mL and store at -20 °C
Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) Life Technologies C34852 Calcein Acetoxymethyl (AM)
Calcium chloride, anhydrous Sigma-Aldrich C1016
D-Glucose Fisher Chemical D16500 Dextrose
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879
Folic acid Sigma-Aldrich F8758
LB-Miller BD Difco 244620
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Yeast extract Oxoid LP0021
Special peptone Oxoid LP0072
Potassium hyroxide Fisher Chemical P250
Potassium phosphate monobasic  Sigma-Aldrich P0662
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Chemical S373
Vitamin B12 Sigma-Aldrich V2876
Strains
Dictyostelium discoideum Siryaporn lab Strain AX318
Escherichia coli Siryaporn lab Strain B/r17
Pseudomonas aeruginosa Siryaporn lab PA14 PA14 strain19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR Siryaporn lab AFS20.1 PA14-derived strain20
Supplies
0.22 µm filter  Millipore SCGPT01RE For filter sterilization
Conical tube, 15 mL Corning 352097
Glass storage bottles Pyrex 13951L 250 mL, 500 mL, 1000 mL
Petri dish, 6 cm diameter Corning 351007 60 x 15 mm polystyrene plates
Petri dish, 10 cm diameter Fisher FB0875712 100 x 15 mm polystyrene plates
Plastic containers with lid Ziploc 2.57E+09 Square 3-cup containers
Glass plates Bio-Rad 1653308 For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.
Wooden sticks Fisher 23-400-102 
Equipment
Eclipse Ti-E microscope  Nikon MEA53100 Microscope setup
10X Plan Fluor Ph1 objective  0.3 NA Nikon MRH20101 Microscope setup
Fluorescence excitation source Lumencor Sola light engine Microscope setup
Fluorescence filter set Semrock LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000  Microscope setup
Orca Flash 4.0 V2 Camera Hamamatsu 77054098 Microscope setup
ImageJ NIH v. 1.49 Software for image analysis
MATLAB Mathworks R2013 Software for image analysis
Orbital shaker incubator VWR 89032-092 For growth of bacteria at 37 °C
Platform shaker Fisher 13-687-700 For growth of amoebae at 22 °C
Spectrophotometer Biochrom Ultrospec 10
Undercounter refrigerated incubator Fisher 97990E For growth of amoebae at 22 °C
Isotemp waterbath  Fisher 15-462-21Q For cooling media to 55 °C

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References

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Bio-ingénierie numéro 136 Pseudomonas aeruginosa attaché à la Surface planctoniques Dictyostelium discoideum test rapide de virulence virulence dans les biofilms
Un dosage de la Virulence bactérienne rapide basé sur une Image à l’aide d’amibe
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Perinbam, K., Siryaporn, A. A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba. J. Vis. Exp. (136), e57844, doi:10.3791/57844 (2018).

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