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Biology

वीवो में एक दिल विशेष MicroRNA-स्पंज की Nanovector डिलिवरी

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57845
Automatic Translation
1, 2, 2
1Princess Margaret Cancer Centre, University of Toronto, 2Department of Pathology, Department of Cardiology, Johns Hopkins University

Summary

ऊतक विशिष्ट microRNA अवरोध एक तकनीक है कि microRNA क्षेत्र में विकसित की है । इस के साथ साथ, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए सफलतापूर्वक myoblast कोशिकाओं में दिल से मीर-१८१ microRNA परिवार को बाधित । Nanovector प्रौद्योगिकी एक microRNA स्पंज कि vivo कार्डियो विशिष्ट मीर-१८१ परिवार निषेध में महत्वपूर्ण दर्शाता है उद्धार करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

Abstract

MicroRNA (miRNA) छोटे गैर कोडिंग आरएनए जो पोस्ट-transcriptional दूत आरएनए (mRNA) अभिव्यक्ति को रोकता है । मानव रोगों, जैसे कैंसर और हृदय रोग, रोग प्रगति के साथ जुड़े ऊतक और/या कोशिका-विशिष्ट miRNA अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है । miRNA अभिव्यक्ति की बाधा एक चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए क्षमता प्रदान करता है । हालांकि, पारंपरिक दृष्टिकोण miRNAs को बाधित करने के लिए, antagomir oligonucleotides रोजगार, वैश्विक वितरण पर विशिष्ट miRNA कार्यों को प्रभावित । इस के साथ साथ, हम vivo कार्डियो में एक चूहा मॉडल में मीर-१८१ परिवार के विशेष निषेध के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एक miRNA-स्पंज का निर्माण 10 दोहराया विरोधी मीर-१८१ बाध्यकारी दृश्यों को शामिल करने के लिए बनाया गया है । कार्डियो-विशिष्ट α-MHC प्रमोटर pEGFP रीढ़ में क्लोन है कार्डियो विशिष्ट मीर-१८१ miRNA-स्पंज अभिव्यक्ति ड्राइव । एक स्थिर सेल एक्सप्रेस मीर-१८१-स्पंज, myoblast H9c2 कोशिकाओं के साथ transfected रहे है बनाने के लिए α-MHC-EGFP-मीर-१८१-स्पंज का निर्माण और प्रतिदीप्ति द्वारा क्रमबद्ध-सक्रिय कक्ष छँटाई (FACs) GFP सकारात्मक H9c2 कोशिकाओं में जो निओमायसिन के साथ संस्कृति रहे हैं (G418) । निओमायसिन में स्थिर विकास के बाद, मोनोक्लोनल सेल आबादी अतिरिक्त FACs और एकल सेल क्लोनिंग द्वारा स्थापित कर रहे हैं । जिसके परिणामस्वरूप myoblast H9c2-मीर-१८१-स्पंज-GFP की कोशिकाओं मीर के समारोह के नुकसान का प्रदर्शन-१८१ परिवार के सदस्यों के रूप में मीर की वृद्धि की अभिव्यक्ति के माध्यम से मूल्यांकन-१८१ लक्ष्य प्रोटीन और H9c2 एक हाथापाई गैर कार्यात्मक स्पंज व्यक्त कोशिकाओं की तुलना में । इसके अलावा, हम मीर के प्रणालीगत प्रसव के लिए एक nanovector-१८१-स्पंज जटिल सकारात्मक आरोप लगाया liposomal नैनोकणों और नकारात्मक मीर-१८१-स्पंज plasmids आरोप लगाया द्वारा निर्माण का विकास । vivo इमेजिंग में GFP से पता चलता है कि एक तीन सप्ताह की अवधि में एक nanovector के कई पूंछ नस इंजेक्शन एक कार्डियो विशेष तरीके से मीर-१८१-स्पंज की एक महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने में सक्षम हैं । महत्वपूर्ण बात, मीर-१८१ समारोह का नुकसान दिल के ऊतकों में नहीं बल्कि गुर्दे या जिगर में मनाया जाता है । miRNA-स्पंज ऊतक विशिष्ट miRNA अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है । एक ऊतक से miRNA-स्पंज अभिव्यक्ति ड्राइविंग-विशिष्ट प्रमोटर miRNA अवरोध, जो एक लक्षित अंग या ऊतक तक ही सीमित किया जा सकता है के लिए विशिष्टता प्रदान करता है । इसके अलावा, nanovector और miRNA-स्पंज प्रौद्योगिकियों के संयोजन एक प्रभावी वितरण और vivo मेंऊतक विशिष्ट miRNA निषेध परमिट ।

Introduction

पिछले दो दशकों में, वहां कई अध्ययनों कि मानव रोग में miRNAs की महत्वपूर्ण भूमिका की ओर इशारा किया गया है । साहित्य के एक बड़े शरीर से निष्कर्षों रोगों के pathophysiology में miRNAs के निर्विवाद महत्व को प्रदर्शित करता है, ऐसे कैंसर के रूप में1 और हृदय रोग2,3,4,5. उदाहरण के लिए, मीर-21 कई कैंसर में विनियमित है, एक वृद्धि हुई कोशिका चक्र और सेल प्रसार6में जिसके परिणामस्वरूप । हेपेटाइटिस सी संक्रमण में, मीर-१२२ वायरस7की प्रतिकृति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और यह दिखाया गया है कि मीर के निषेध-१२२ वायरल लोड8घट जाती है । कार्डियक अतिवृद्धि में, मीर-212/132 दिल में विनियमित है और रोग phenotype9में शामिल है । downregulation या एक अनियमित miRNA के कार्यात्मक निषेध के स्पष्ट महत्व चिकित्सकीय लगभग सभी रोगों में miRNA जीवविज्ञान का दोहन करने के लिए अवसरों का सुझाव है ।

चार मीर-१८१ परिवार के सदस्य, मीर-181a/बी/सी/डी, मानव जीनोम में तीन जीनोमिक स्थानों में पाए जाते हैं. एक गैर कोडिंग आरएनए मेजबान जीन (MIR181A1-पारा) के intronic क्षेत्र में encodes मीर के क्लस्टर-181-a/b-1 । NR6A1 जीन के intronic क्षेत्र में encodes मीर-181-a/b-2 । मीर-181-सी/डी क्लस्टर गुणसूत्र 19 पर एक विलक्षण प्रतिलिपि में स्थित है । सभी मीर-१८१ परिवार के सदस्यों को एक ही "बीज" अनुक्रम का हिस्सा है और सभी चार मीर-१८१ परिवार के सदस्यों को संभवतः एक ही mRNA लक्ष्य को विनियमित कर सकते हैं ।

हम3,4 और अंय10 मीर के महत्व को उजागर किया है-१८१ परिवार के सदस्यों को अंतिम चरण के दिल की विफलता के दौरान । हम यह भी मांयता प्राप्त है कि एक मीर-181c विनियमन रोग स्थितियों जैसे द्वितीय मधुमेह, मोटापा, और उंर बढ़ने3,4,5के रूप में हृदय रोग का एक बढ़ा जोखिम से संबंधित के तहत होता है । यह माने किया गया है कि मीर के व्यक्त-181c ऑक्सीडेटिव तनाव का कारण बनता है जो एक हृदय रोग की ओर जाता है4।

कई समूहों का सुझाव दिया है कि miRNA mitochondria11,12,13,14में मौजूद है, लेकिन हम पहले प्रदर्शन है कि मीर-181c परमाणु जीनोम, संसाधित से व्युत्पंन है, और बाद में RISC3में mitochondria को translocated । इसके अलावा, हम5दिल के mitochondrial डिब्बे में मीर-181a और मीर-181b की एक कम अभिव्यक्ति का पता चला है । महत्वपूर्ण बात, हमने पाया है कि मीर-181c मीट्रिक टन-COX1 mRNA अभिव्यक्ति, जिससे कि miRNAs mitochondrial जीन विनियमन में भाग लेने और mitochondrial समारोह3,4परिवर्तन दमित ।

इस अनुच्छेद के लिए एक miRNA-स्पंज के लिए नीचे पूरे मीर दस्तक-१८१ cardiomyocytes में परिवार डिजाइन आवश्यक पद्धति पर चर्चा की । इसके अलावा, हम में vivo आवेदन के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा मीर-१८१-स्पंज ।

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय की उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. स्पंज डिजाइन

  1. MicroRNA बंधनकारक ३ ' UTR
    नोट: विशिष्ट आधार के माध्यम से एक miRNA कार्यों में आंशिक रूप से पूरक साइटों के साथ बातचीत बाँधना (UTR) अपने लक्ष्य mRNAs के 3 ' unअनुवादित क्षेत्र (एक व्यापक समीक्षा के लिए, Bartel देखें)15.
    1. miRNA अनुक्रम के लिए महत्वपूर्ण complementarity वाले oligonucleotides के रूप में miRNA व्यंजक के अवरोधकों डिज़ाइन करें । व्यापक आधार बाँधना के माध्यम से एक oligonucleotide परिसर में एक miRNA एकांत miRNA समारोह ब्लॉक करने के लिए ।
  2. एक miRNA स्पंज की डिजाइन
    1. डिजाइन मिलकर आंशिक रूप से पूरक miRNA दृश्यों सरणी सामान्य रूप से 2 Argonaute से सट स्थिति में एक उभार शामिल करने के लिए । उभार किसी भी आरएनए हस्तक्षेप प्रकार दरार और स्पंज की गिरावट को रोकने के लिए परिपक्व miRNA अनुक्रम के न्यूक्लियोटाइड 9-12 पर तैनात है ।
    2. यदि वांछित, डेको लक्ष्य अनुक्रम डिजाइन करने के लिए सभी मीर-१८१ परिवार के सदस्यों को बांध । एक परीक्षा और मीर-१८१ परिवार miRNA दृश्यों की तुलना पर, 5 ' में एक आम अनुक्रम खोजें-8 लगातार न्यूक्लियोटाइड, या एक के सभी 4 मीर-१८१ परिवार के सदस्यों के लिए आम एक अतिरिक्त 8 के उभार के पक्ष पर एक अनुक्रम मिल के लगातार न्यूक्लियोटाइड. इन 2 दृश्यों क्रमशः छोड़ दिया और सही आधा बाध्यकारी साइटों, प्रतिनिधित्व करते हैं ।
      नोट: डेको अनुक्रम छोड़ दिया और सही आधा बाध्यकारी एक GGA स्पेसर द्वारा अलग साइटों की एक मिलकर सरणी है । एक साथ लिंक 5 '-अंत अनुक्रम और 3 '-साइड अनुक्रम (चरण 1.2.2 में वर्णित) एक GGA को उभार जब एक miRNA को annealed बनाने के लिए डिजाइन स्पेसर के साथ (के रूप में कदम 1.2.1 में वर्णित) । दोहराएं इस 1 miRNA बंधन अंतिम मीर में 10x साइट स्पंज का निर्माण ।
  3. अंय miRNA स्पंज विचार
    नोट: क्रम में प्राप्तकर्ता अभिव्यक्ति वेक्टर में स्पंज अनुक्रम क्लोन करने के लिए, प्रतिबंध nuclease मांयता साइटों अनुक्रम के प्रत्येक छोर पर शामिल किया जाना चाहिए । silico पाचन विश्लेषण में एक को चुना प्रतिबंध एंजाइमों और अंय प्रतिबंध द्वारा स्पंज अनुक्रम के गैर विशेष दरार की पुष्टि के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए बहाव क्लोनिंग अनुप्रयोगों में इस्तेमाल एंजाइमों ।
    1. एक डबल स्टॉप codon जोड़ें (ताा ताा) 5 '-अंत सिंथेटिक 3 ' UTR में, इस तरह कि मीर-१८१-स्पंज अनुक्रम एक बढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) के लिए कोडिंग अनुक्रम का हिस्सा नहीं है ।
  4. क्लोनिंग के लिए स्पंज डीएनए का संश्लेषण
    1. एक डीएनए सिंथेसाइज़र का प्रयोग करें या क्लोनिंग के लिए जगह में प्रतिबंध nuclease मांयता साइटों के साथ अंतिम miRNA स्पंज अनुक्रम संश्लेषित करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्रोत को रोजगार । स्पंज एक प्लाज्मिड जो बैक्टीरिया में एक प्रवर्धन के लिए चयन मार्करों शामिल कर सकते है पर भेज दिया है । इसके अलावा, स्पंज क्लोनिंग के लिए एक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) द्वारा परिलक्षित किया जा सकता है या बस दाता वेक्टर प्रतिबंध १.३ कदम में वर्णित साइटों का उपयोग कर गिरा दिया (भी, ३.१ कदम देखें) ।

2. प्राप्तकर्ता वेक्टर क्लोनिंग एक ऊतक विशिष्ट प्रमोटर शामिल करने के लिए

नोट: pEGFP-C1 वेक्टर miRNA स्पंज की अभिव्यक्ति कैसेट के लिए प्राप्तकर्ता वेक्टर के रूप में उपयोग करें । pEGFP-C1 वेक्टर एक EGFP एक cytomegalovirus (सीएमवी) प्रमोटर द्वारा संचालित के लिए एक पढ़ने के फ्रेम शामिल हैं । सीएमवी प्रवर्तक स्तनधारी कोशिकाओं में सक्रिय constitutively है । यदि एक ऊतक विशेष प्रमोटर की आवश्यकता है, सीएमवी प्रमोटर एसईई और NheI एंजाइमों के पाचन द्वारा हटाया जा सकता है (२.१ कदम देखें) । प्लाज्मिड एक व्यापक एकाधिक क्लोनिंग साइट (MCS) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कनमीसिन (कान) और बैक्टीरिया में एक चयन और G418 कोशिकाओं में एक स्थिर अभिव्यक्ति के लिए निओमायसिन (स्तनधारी) मार्करों, क्रमशः शामिल हैं ।

  1. pEGFP से सीएमवी प्रमोटर को हटाने-C1
    1. बनाने के ५० μL पाचन की प्रतिक्रिया का उपयोग 1x वाणिज्यिक उपलब्ध डाइजेस्ट बफर प्रतिबंध एंजाइमों का निर्माण द्वारा सुझाव दिया, प्लाज्मिड डीएनए के 5 μg (पानी में), और 5 μL एसईई और NheI एंजाइमों के प्रत्येक । एक microcentrifuge ट्यूब के लिए सभी घटकों को जोड़ें और धीरे से यह झाड़ द्वारा उन्हें मिश्रण. एक microcentrifuge में 10 एस के लिए ट्यूब स्पिन नीचे प्रतिक्रिया इकट्ठा करने के लिए । 15 मिनट के लिए एक ३७ ° c जल स्नान में प्रतिक्रिया की मशीन ।
    2. पचा रैखिक प्लाज्मिड शुद्ध । 5x स्तंभ बाइंडिंग बफ़र की प्रतिक्रिया मात्रा जोड़ें (उपयोग डीएनए शोधन कॉलम के निर्माण के लिए उचित बाध्यकारी बफर का एक मालिकाना मिश्रण) और निर्माता द्वारा वर्णित के रूप में एक डीएनए शुद्धि कॉलम के साथ प्रतिक्रिया शुद्ध । Elute के 25 μL के साथ रेफरेंस बफर (पानी) को कॉलम के केंद्र में सावधानी से जोड़ा.
    3. जेल इस प्रकार के रूप में ०.५% agarose जेल पर पचता प्लाज्मिड शुद्ध: (५०% ग्लिसरॉल-3x लोडिंग डाई) eluted प्लाज्मिड करने के लिए लोड हो रहा है बफर के 5 μL जोड़ें । 1 में पूरे नमूना लोड ०.५% agarose जेल पर अच्छी तरह से । बिना खतना के सदिश के ५०० एनजी के साथ एक अलग लेन शामिल करें । यह 30-40 मिनट के लिए भागो कटौती और बिना खतना के plasmids की एक पर्याप्त जुदाई तक प्राप्त की है ।
    4. इस प्रकार के रूप में रैखिक प्लाज्मिड शुद्ध: एक यूवी प्रकाश बॉक्स पर agarose जेल में डीएनए कल्पना । एक साफ उस्तरा ब्लेड के साथ, ध्यान से रैखिक प्लाज्मिड के लिए इसी बैंड एक्साइज ।
      नोट: रेखीय प्लाज्मिड बिना खतना के प्लाज्मिड से कम चलाना चाहिए और लगभग ४.२ kb पर एक एकल बैंड के रूप में दिखाई देगा । एक्साइज सीएमवी प्रमोटर लगभग ५०० न्यूक्लियोटाइड (एनटी) पर एक लाइट बैंड के रूप में दिखाई देगा ।
    5. जेल स्लाइस से डीएनए निकालें एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर और पानी की 25 μL के साथ कॉलम से डीएनए elute ।
  2. pEGFP में एक दिल विशेष प्रमोटर क्लोनिंग-C1
    नोट: अल्फा-मायोसिन भारी श्रृंखला (α-MHC) प्रमोटर पहले विशेषता किया गया है और निम्न Molkentin, Jobe, और Markham16में वर्णित के रूप में हृदय-प्रतिबंधित अभिव्यक्ति की मजबूत स्तर पर प्रत्यक्ष करने के लिए प्रदर्शन. अगले वर्गों का वर्णन कैसे क्लोनिंग के लिए वेक्टर के प्रवर्तक बढ़ाना है ।
    1. क्लोन तत्वों के बीच α-MHC प्रवर्तक + ४२० से-२९३४ पहले पीसीआर प्राइमरों कि इस क्षेत्र की दिशा और फिर पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में प्लाज्मिड डिजाइनिंग द्वारा p40 प्लाज्मिड16 में प्रतिलिपि प्रारंभ साइट के सापेक्ष । पहले5वर्णित पीसीआर प्राइमरों का उपयोग प्रमोटर क्षेत्र बढ़ाना । आगे और रिवर्स पीसीआर प्राइमरों pEGFP-C1 (चरण २.१) के पचा समाप्त होता है के लिए ओवरलैप के दृश्यों में संलयन क्लोनिंग के निर्देश की अनुमति के लिए होते हैं । में संलयन क्लोनिंग के लिए प्राइमर डिजाइन की एक व्यापक विवरण के लिए में फ्यूजन मैनुअल से परामर्श करें । प्राइमरी सीक्वेंस 1 टेबलमें पाए जाते हैं ।
    2. एक ५० μL पीसीआर प्रतिक्रिया है, जो प्रत्येक प्राइमर के 1 माइक्रोन और 10 टेंपलेट डीएनए के एनजी शामिल है तैयार करते हैं । पीसीआर एंजाइम और dNTPs का एक उचित मात्रा में जोड़ें चुना के निर्माण पर निर्भर करता है । एक मानक डीएनए सायक्लिंग ब्लॉक पर पीसीआर प्रदर्शन । एक 3 मिनट ९८ ° c denaturing चरण, denaturing के ३५ चक्र के बाद, एनीलिंग, और विस्तार के लिए 5, 30, और १२० एस प्रत्येक, क्रमशः प्रदर्शन । ७२ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट का एक अंतिम विस्तार शामिल हैं ।
    3. पीसीआर और जेल निष्कर्षण को साफ करें । पीसीआर चक्र के पूरा होने पर, 5x पीसीआर प्रतिक्रिया करने के लिए कॉलम बाध्यकारी बफर की प्रतिक्रिया मात्रा जोड़ने और यह निर्माता द्वारा वर्णित के रूप में एक डीएनए शोधन कॉलम के साथ शुद्ध । Elute के 25 μL के साथ मिश्रण को रेफरेंस बफर (पानी) के कॉलम के केंद्र में सावधानी से जोड़ा.
      1. लोड बफर के 5 μL जोड़ें [५०% ग्लिसरॉल (3x) लोड हो रहा है डाई] eluted प्लाज्मिड । 1% agarose जेल पर अच्छी तरह से में पूरे नमूने लोड । यह 30-40 मिनट के लिए भागो; (स्टेप 2.1.5) ऊपर बताए गए अनुसार पीसीआर प्रोडक्ट को टयूब और एक्साइज करें ।
    4. Ligate α-MHC प्रवर्तक के साथ pEGFP-C1 निम्नानुसार है: 10 μL बंधाव प्रतिक्रिया 1x व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बंधाव बफ़र, शुद्ध पीसीआर के 2 μL, और रैखिक वेक्टर के 1 μL जोड़ें । 15 मिनट के लिए ५० ° c पर बंधाव प्रदर्शन और फिर बर्फ पर ठंडा ।
    5. एक जीवाणु परिवर्तक निम्नानुसार कार्य करें: transfect ५० के साथ सक्षम कोशिकाओं के μL-फ्यूजन बंधाव मिश्रण के घटकों को जोड़कर २.५ μL. बर्फ पर Eppendorf ट्यूब 20 मिनट के लिए आराम, यह एक ४२ ° c जल स्नान में डाल ४० एस के लिए, और फिर 2 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब जगह है ।
      1. परिवर्तन के बाद, समाज मीडिया के ३५० μL जोड़ें और ४५ मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित. प्लेट २०० कान के साथ पौंड प्लेटों पर वृद्धि समाधान के μL । एक कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन जो α-MHC प्रवर्तक बंधाव होते हैं, कान प्रतिरोधी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए ।
        नोट: स्क्रीनिंग प्राइमर्स बंधाव जंक्शन के पार पीसीआर को डिजाइन किए गए थे ।
    6. लेग-कण शोरबा में पीसीआर सकारात्मक क्लोनों का विस्तार और plasmids में मानक मिनी तैयारी प्लाज्मिड शुद्धीकरण प्रोटोकॉल का उपयोग कर के रूप में निर्माता द्वारा वर्णित शुद्ध ।

3. स्पंज क्लोनिंग

  1. डाइजेस्ट प्राप्तकर्ता वेक्टर
    1. EcoRI और KpnI के साथ क्लोनिंग के लिए α-MHC-pEGFP प्लाज्मिड रैखिक बनाओ, और ऊपर वर्णित के रूप में जेल शुद्ध (२.१ कदम) ।
  2. पीसीआर बढ़ाना और स्पंज डीएनए को पचाने
    1. मीर-१८१-स्पंज और इसी २८४-nt-पीसीआर के लिए टेंपलेट के रूप में लंबे समय हाथापाई शिपिंग वैक्टर का उपयोग करें । पहले वर्णित पीसीआर प्राइमरों का उपयोग कर स्पंज क्षेत्र बढ़ाना5. ध्यान दें कि आगे और रिवर्स पीसीआर प्राइमर α-MHC-pEGFP-C1 में बंधाव की अनुमति के लिए प्रतिबंध एंजाइम अनुक्रम होते हैं । (चरण -8) ऊपर वर्णित के रूप में पीसीआर प्रदर्शन । बताए गए अनुसार पाचन से पहले पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें (स्टेप 2.2.3) और उन्हें पाचन के लिए पानी के साथ eluted । प्राइमरी दृश्यों के लिए, 1 तालिका देखें ।
    2. बंधाव के लिए स्पंज डीएनए को पचा । एक ५० μL पाचन प्रतिक्रिया 1x डाइजेस्ट बफर, जेल-शुद्ध कदम 3.2.1 से पीसीआर प्रतिक्रिया, और दोनों EcoRI और KpnI एंजाइमों के 5 μL शामिल हैं । एक microcentrifuge ट्यूब के लिए सभी घटकों को जोड़ें और धीरे से यह झाड़ द्वारा उन्हें मिश्रण. एक microcentrifuge में 10 एस के लिए ट्यूब स्पिन नीचे प्रतिक्रिया इकट्ठा करने के लिए । 15 मिनट के लिए एक ३७ ° c जल स्नान में प्रतिक्रिया की मशीन ।
    3. पहले वर्णित के रूप में एक पीसीआर साफ अप कॉलम का उपयोग कर पचा पीसीआर स्पंज शुद्ध (कदम 2.2.1) ।
  3. Ligate मीर-१८१-α में स्पंज-MHC-pEGFP-C1 वेक्टर
    1. एक 21 μL बंधाव प्रतिक्रिया सेट अप करें जिसमें 1x बंधाव बफर, 3 μL के पच और शुद्ध मीर-१८१-स्पंज पीसीआर, रैखिक μL के 1 α-MHC-pEGFP-C1 वेक्टर, 1x डीएनए बफर, और डीएनए μL के 1 ligase शामिल हैं । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बंधाव प्रदर्शन और फिर यह बर्फ पर जगह है ।
    2. बंधाव मिश्रण के 2 μL के साथ XL1-नीला सक्षम कोशिकाओं के ५० μL को रूपांतरित करे । ऊपर वर्णित के रूप में परिवर्तन और चढ़ाना प्रोटोकॉल का प्रयोग करें (step 2.2.5) । सही α-MHC-pEGFP-मीर-१८१-स्पंज अनुक्रम होते हैं जो कान प्रतिरोधी बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए एक कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन । बंधाव जंक्शन के पार पीसीआर को डिजाइन स्क्रीनिंग प्राइमर । प्राइमरी जुगाड़ के लिए 1 टेबल देखें ।
    3. बढ़ाना और अनुक्रम वेक्टर । का विस्तार पीसीआर सकारात्मक क्लोनों में पौंड-कान शोरबा और plasmids में मानक मिनी-तैयारी प्लाज्मिड शुद्धि प्रोटोकॉल का उपयोग कर शुद्ध । वांछित डीएनए अनुक्रम व्यक्त प्लाज्मिड सत्यापित करने के लिए एक डीएनए अनुक्रमण करते हैं ।

4. स्थिर H9c2 मीर की पीढ़ी-१८१-स्पंज एक्सप्रेस कोशिकाओं

  1. H9c2 कोशिकाओं के विकास और रखरखाव
    1. संस्कृति Dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM) में H9c2 कोशिकाओं को 10% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त । उप संस्कृति मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर कोशिकाओं और उंहें 5% कार्बन डाइऑक्साइड में ३७ डिग्री सेल्सियस पर हो जाना ।
  2. अभिकर्मक और H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-मीर-१८१-स्पंज एक्सप्रेस कोशिकाओं का चयन
    1. श्रेष्ठ परिणामों के लिए H9c2 कक्षों की एक electroporation निष्पादित करें । Transfect चूहा myoblasts (H9c2) या तो एक हाथापाई स्पंज के साथ (एक २८४-nt लंबी हाथापाई अनुक्रम जो मीर-१८१-स्पंज अनुक्रम की जगह) या α-MHC-pEGFP-मीर-१८१-स्पंज एक electroporator के साथ निर्माण ।
      1. संक्षेप में, transfect 4x10-5 कोशिकाओं प्लाज्मिड डीएनए के 2 μg के साथ (में 5 µ एल के एच2ओ) और µ डिवाइस के साथ संगत समाधान के १०० electroporation एल. H9c2 कक्षों को transfect करने के लिए DS-१२० के एक electroporation प्रोग्राम का उपयोग करें ।
      2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए cuvette में transfected कोशिकाओं की मशीन । DMEM के ५०० µ l को सीधे cuvette पर जोड़ें । धीरे एक 6-अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से कुल cuvette सामग्री हस्तांतरण ।
    2. के लिए चयन GFP सकारात्मक कोशिकाओं के बाद ४८ एच पोस्ट-अभिकर्मक द्वारा FACs । थाली केवल GFP-व्यक्त की कोशिकाओं में एक 6-अच्छी तरह से प्लेट निओमायसिन (G418) (400ng/एमएल) के एक अतिरिक्त के साथ पूरा विकास मीडिया के लिए ।
      नोट: G418 चयन करने से पहले, एक मार वक्र चयन के लिए आवश्यक निओमायसिन की मात्रा निर्धारित करने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए । H9c2 कोशिकाओं के लिए, G418 के ४०० एनजी/एमएल के एक लगभग ८०% मृत्यु दर में 24 घंटे के बाद गैर प्लाज्मिड transfected H9c2 कोशिकाओं के परिणामस्वरूप और इन कोशिकाओं के लिए G418 के वांछित काम एकाग्रता माना जाता था । 16 दिनों तक G418 में ग्रोथ बनाए रखने के बाद सेल लाइन को स्थिर माना गया ।
    3. एक स्पंज सकारात्मक चयन के लिए एक मार्कर के रूप में GFP की अभिव्यक्ति का उपयोग G418 स्थिर कोशिकाओं की छंटाई FACs प्रदर्शन करते हैं । बीज 5-10 कोशिकाओं के प्रत्येक कुआं में एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट प्रवाह-छंटाई के द्वारा । ९६-अच्छी तरह से थाली से मोनोक्लोनल कोशिकाओं को विस्तार 24-अच्छी तरह से कई मार्ग पर प्लेटें । अनुवर्ती प्रयोगों के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में गद्यांश 3 (p) कक्षों से कक्षों के फ्रीजर स्टॉक्स का उपयोग करें.
    4. P5 और P10 के बीच कम गद्यांश वाले कक्षों के साथ सभी सेल-लाइन-आधारित प्रयोगों को निष्पादित करें.

5. संश्लेषण और स्पंज की शुद्धि-नैनोकणों (मीर-१८१-स्पंज नैनोकणों)

  1. liposomal नैनोकणों को भंग करके cationic amphiphile (DOTAP) और सह-रक्तदाब, कोलेस्ट्रॉल और DSPE-खूंटी-OMe, एक ५:५: ०.१ मिमी अनुपात में क्रमशः क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल के मिश्रण में एक काँच की शीशी में भरकर तैयार कर लें.
  2. ४४-४५ डिग्री सेल्सियस पर कार्बनिक विलायक निकालें, एक निर्वात के तहत एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग करके, नमी मुक्त नाइट्रोजन के एक सौंय प्रवाह के बाद । लिपिड के शेष सूख फिल्म एक उच्च वैक्यूम के तहत रखने के लिए 8 एच.
  3. वैक्यूम सूखे लिपिड फिल्म के लिए 5% ग्लूकोज जोड़कर एक मिश्रण तैयार करें । इस मिश्रण को फिल्म को हाइड्रेट करने की अनुमति देने के लिए इसे रातोंरात छोड़ दें । भंवर कमरे के तापमान पर 2 से 3 मिनट के लिए शीशी में एक ४५ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में एक सामयिक झटकों के साथ multilamellar बुलबुले का उत्पादन करने के लिए ।
    1. Sonicate multilamellar बुलबुले 3-4 मिनट के लिए एक बर्फ स्नान में छोटे unilamellar बुलबुले को तैयार करने के लिए जब तक स्पष्टता मनाया जा सकता है, एक १००% शुल्क चक्र और 25 डब्ल्यू उत्पादन शक्ति में ।
  4. मिश्रण या तो एक हाथापाई अनुक्रम या एक मीर-१८१-स्पंज pEGFP में क्लोन अनुक्रम (α-MHC) वैक्टर और liposome एक 1:3 चार्ज अनुपात आधार पर nanovector4फार्म ।
    नोट: पॉजिटिव-चार्ज्ड liposomal नैनोकणों और नेगेटिव-चार्ज्ड प्लाज्मिड डीएनए के एक इलेक्ट्रोस्टैटिक कॉम्प्लेक्स को nanovector के नाम से जाना जाता है ।

6. स्पंज की प्रणालीगत डिलिवरी-नैनोकणों और Vivo प्रभाव में मांयता

  1. चूहों में स्पंज-नैनोकणों का प्रणालीगत वितरण
    1. Sprague-Dawley (SD) चूहों का प्रयोग करें । मीर-१८१-स्पंज nanovector या पूंछ नस के माध्यम से nanovector हाथापाई के साथ नसों में चूहों सुई । एसडी पुरुष चूहों, जो शरीर के वजन में लगभग २०० ग्राम हैं का उपयोग करें ।
    2. nanovector/kg शरीर के वजन के 4 मिलीग्राम की एक खुराक का उपयोग कर पूंछ नस इंजेक्शन प्रदर्शन और इस 2 सप्ताह से अधिक 6 पूंछ नस इंजेक्शन के एक आहार का उपयोग कर दोहराएँ । दोहराया nanovector वितरण के बाद, एक 1-सप्ताह की अवधि (15-21 दिन) के लिए vivo मेंवेक्टर की अभिव्यक्ति की अनुमति दें ।
    3. ऑप्टिमाइज़ेशन GFP संकेत इमेजिंग से पहले, के दौरान, और nanovector वितरण के बाद की पुष्टि करें । tomographic इमेजिंग सॉफ्टवेयर है, जो अर्द्ध मात्रात्मक डेटा उत्पंन द्वारा GFP संकेत विश्लेषण ।
  2. में की मांयता vivo मीर-१८१ मीर ने निषेध-१८१-स्पंज
    1. क्रम में पश्चिमी दाग प्रदर्शन के लिए एक कार्यात्मक मीर-१८१-दिल के ऊतकों में स्पंज की अभिव्यक्ति प्रदर्शित करने के लिए ।
      नोट: इस अध्ययन के लिए एमटी-COX1 एक्सप्रेशन की जांच की गई ।
  3. के कार्यात्मक परिणाम में vivo मीर-१८१-दिल में स्पंज अभिव्यक्ति
    1. एक दो आयामी प्रदर्शन, एम मोड, और डॉपलर इकोकार्डियोग्राफी के दौरान और nanovector प्रसव के बाद कार्डियक फंक्शन और रूपात्मक परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए. मूषक दिलों में बेहतर स्कैनिंग क्षमता के लिए, एक 15 मेगाहर्ट्ज रैखिक सरणी transducer के साथ सुसज्जित एक अल्ट्रासाउंड प्रणाली का उपयोग करें ।
    2. संज्ञाहरण कार्डियक सिकुड़ना को प्रभावित कर सकते हैं; इसलिए, मीर-१८१-स्पंज nanovector या हाथापाई nanovector पशुओं कि जागरूक और इकोकार्डियोग्राफी प्रक्रिया के दौरान किसी भी संवेदनाहारी रिएजेंट के बिना कर रहे है के वितरण प्रदर्शन । कृपया दास, एट अलदेखें । 4 आगे स्पष्टीकरण के लिए ।

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Representative Results

में छुरा transfected pEGFP-मीर-१८१-स्पंज-व्यक्त H9c2 कोशिकाओं (४.२ कदम से), पूरे मीर की अभिव्यक्ति-१८१ परिवार (मीर-181a, मीर-181b, मीर-181c, और मीर-181d) की pEGFP-तले-व्यक्त H9c2 कोशिकाओं के सापेक्ष मामूली कमी हुई थी. मीर-१८१-स्पंज पूरे मीर-१८१ परिवार के एक प्रतियोगी अवरोधक के रूप में कार्य करता है, तो हम प्रत्याशित है कि मीर की अभिव्यक्ति-181c mitochondrial लक्ष्य जीन, मीट्रिक टन-COX1, वृद्धि होगी । पश्चिमी दाग डेटा कि मीट्रिक टन-COX1 अभिव्यक्ति pEGFP-मीर-१८१-स्पंज-व्यक्त H9c2 कोशिकाओं pEGFP-हाथापाई-व्यक्त H9c2 कोशिकाओं की तुलना में बढ़ गया था कि सुझाव देते हैं । इसके अतिरिक्त, या तो mt-COX2 या mt-COX3 के लिए कोई व्यंजक परिवर्तन pEGFP-मीर-१८१-स्पंज-एक्सप्रेस H9c2 कक्षों में immunoblot के माध्यम से पाए गए । हम immunoblotting विश्लेषण के लिए सामान्यीकरण नियंत्रण के रूप में α-tubulin का इस्तेमाल किया. GFP संकेत मुख्य रूप से जिगर और गुर्दे में मनाया गया 2 सप्ताह के बाद मीर-स्पंज nanovector (चित्रा 1a) की प्रणालीगत डिलिवरी । हालांकि, GFP अभिव्यक्ति दिल के ऊतकों में काफी अधिक था मीर के 3 सप्ताह के बाद-१८१-स्पंज nanovector वितरण (आंकड़ा 1a और 1b) । नोट की, वहां एक GFP कुछ जानवरों में जिगर ऊतक में पाया संकेत था 3 सप्ताह प्रणालीगत प्रसव के बाद; हालांकि, उस समय बिंदु पर जिगर में मीर-१८१-स्पंज का कोई कार्यात्मक प्रभाव थे ।

पश्चिमी ब्लाट मीट्रिक टन में COX1 अभिव्यक्ति में एक उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई-१८१-स्पंज nanovector-हाथापाई nanovector समूहों (चित्रा 2) की तुलना चूहों इंजेक्शन । उच्च मीट्रिक टन-COX1 पता चलता है वहां एक कम मीर दिल में 181c अभिव्यक्ति है मीर-१८१-स्पंज nanovector वितरण के 3 सप्ताह के बाद, के रूप में मीट्रिक टन-COX1 मीर-181c के लिए सीधा लक्ष्य है । हम immunoblots के लिए सामांय नियंत्रण के रूप में α-tubulin करते थे ।

इकोकार्डियोग्राफी मीर के कार्डियक समारोह में कोई परिवर्तन नहीं दिखाया-१८१-स्पंज nanovector-चूहों इंजेक्शन से पहले, दौरान, और उपचार आहार के अंत में, पशु के हाथापाई nanovector समूह की तुलना में ।

Figure 1
चित्र 1. वीवो में मीर के nanovector डिलिवरी का विश्लेषण-१८१-स्पंज । (क) यह पैनल पूंछ नस के माध्यम से 6 नसों में इंजेक्शन के साथ अनुकूलित 3 सप्ताह के उपचार प्रोटोकॉल से पता चलता है । epifluorescence छवि में पीला रंगभरण pEGFP वेक्टर की अभिव्यक्ति को प्रदर्शित करता है । पीले रंगभरण की अधिकतम तीव्रता सप्ताह 3 समय बिंदु पर मनाया जाता है । (ख) α-MHC प्रवर्तक अनुक्रम pEGFP वेक्टर में चुनिंदा या तो मीर-१८१-स्पंज या दिल में तले हुए अनुक्रम 21 दिन में व्यक्त करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. मीर के प्रभाव का सत्यापन-१८१-मीर पर स्पंज nanovector-181c अभिव्यक्ति. यह pEGFP-हाथापाई और pEGFP-मीर-१८१-स्पंज nanovector-चूहों इंजेक्शन से प्राप्त lysates दिल में मीट्रिक टन-COX1 अभिव्यक्ति के पश्चिमी दाग विश्लेषण है । पूरे दिल homogenates संकेत एंटीबॉडी के साथ जांच की गई । हम एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में α-tubulin इस्तेमाल किया । बैंड-densitometry नीचे पट्टी ग्राफ में दिखाया गया है । छात्र टीपरीक्षण किया गया था, और मानक त्रुटि बार ग्राफ में त्रुटि सलाखों के रूप में रची गई थी । * p < 0.05 बनाम pEGFP-हाथापाई समूह । n = 4.

प्राइमरी का नाम अनुक्रम Tm नोट्स उपयोग लक्ष्य
SAM3-1F ATGCATTAGTTATTAATGCTT
GACACACTTGACAATTTCT		 ५८.४ चूहा MHC प्रवर्तक EGFP में क्लोन करने के लिए पीसीआर MHC प्रवर्तक
SAM3-2R GACCGGTAGCGCTAGCTG
ACTCACTGGGAGATTGCTT		 ५९.८ चूहा MHC प्रवर्तक EGFP में क्लोन करने के लिए पीसीआर MHC प्रवर्तक
SAM3-3F CGAACGACCTACACCGAACT ६४ स्क्रीन EGFP-F कॉलोनी पीसीआर सकारात्मक प्रवर्तक क्लोन
SAM3-4R CGCTAGTCCTTGACCCTCTG ६३.९ स्क्रीन MHC-R कॉलोनी पीसीआर सकारात्मक प्रवर्तक क्लोन
SAM5-1F CCTGTCTCCAACACACAAGC ५९.३ अनुक्रम MHC प्रवर्तक Sequencing MHC प्रवर्तक
SAM5-2R CAGACTGCAGGGCTGGTT ६० अनुक्रम MHC प्रवर्तक Sequencing MHC प्रवर्तक

तालिका 1. प्राइमरी जुगाड़.

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Discussion

इस अनुच्छेद के डिजाइन और एक miRNA-स्पंज के संश्लेषण का वर्णन किया है और कैसे ऊतक स्पंज की विशिष्ट अभिव्यक्ति का प्रदर्शन ऊतक विशिष्ट miRNA परिवार अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है ।

हमने दिखा दिया है कि एक मीर-१८१ परिवार को लक्षित स्पंज एक हृदय के साथ एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में क्लोन किया जा सकता है विशिष्ट प्रमोटर । प्लाज्मिड कुशलतापूर्वक दोनों विट्रो में और vivo में electroporation या एक पूंछ नस इंजेक्शन का उपयोग करते हुए वितरण के लिए एक nanovector कण में पैक किया जा सकता, क्रमशः (चित्रा 1) । मीर-१८१ स्पंज मीर-१८१ परिवार की एक हृदय विशेष अभिव्यक्ति को बाधित कर सकते है और मीर की अभिव्यक्ति-१८१ लक्ष्य जीन (चित्रा 2) को प्रभावित कर सकते हैं । प्लाज्मिड में GFP एक जोड़ा लाभ है, जो पशुओं के त्याग के बिना प्रसव और nanovector की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल कल्पना कर सकते हैं ।

संक्षेप में, एक miRNA-स्पंज miRNA antisense एक रिपोर्टर जीन है कि एक डेको miRNA लक्ष्य mRNA के रूप में कार्य के बाद रखा दृश्यों की एक श्रृंखला के होते हैं । स्वाभाविक रूप से होने वाली miRNA-स्पंज के रूप में पौधों और पशु कोशिकाओं में व्यक्त endogenously होना पाया गया है लंबे समय से गैर कोडिंग RNAs (lncRNAs)17। वर्तमान अध्ययन में, हम दिल में पूरे मीर-१८१ परिवार को बाधित करने के लिए एक स्पंज दृष्टिकोण का उपयोग किया है । हालांकि मीर-१८१-स्पंज दृष्टिकोण एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक को downregulate में मीर-१८१ परिवार को प्रसंस्कृत कोशिकाओं, मीर के vivo आवेदन में एक-१८१-स्पंज हानिकारक हो सकता है विधि है । उदाहरण के लिए, कई अध्ययनों से अलग सेल में मीर-181a और मीर-181b की सुरक्षात्मक भूमिका का प्रदर्शन किया है,18,19,20। इसलिए, मीर-१८१-स्पंज अभिव्यक्ति दिल के ऊतकों को विशेष रूप से लक्षित किया जाना चाहिए ।

छोटे oligonucleotides को एनीलिंग के माध्यम से परिपक्व miRNA गाइड किनारा करने के लिए miRNA समारोह ब्लॉक और आरएनए प्रेरित मुंह बंद करने परिसर (RISC) में एक उचित लदान को रोकने के लिए प्रदर्शन किया गया है । इस दृष्टिकोण के साथ जुड़े एक समस्या यह है कि oligonucleotides को एक संतृप्त खुराक में दिया जाना है जो परिपक्व miRNAs के सेलुलर पूल को ब्लॉक करने के लिए पर्याप्त है । Oligonucleotides भी सेलुलर झिल्ली और अणु के एक सामांय स्थिरता के पार परिवहन शामिल चुनौतियों से पीड़ित हैं । सरल, यह दिखाया गया है कि एक exogenously आपूर्ति miRNA लक्ष्य अपने cognate miRNA21के लिए एक डेको के रूप में कार्य कर सकते हैं । कई बाध्यकारी साइटों के आधार पर एक छद्म 3 ' UTR निर्माण, डेको लक्ष्य, या miRNA-स्पंज में एक साथ सीमित, छुरा अपने लक्ष्य miRNAs के साथ बातचीत करने में सक्षम है और miRNA परिसरों (microribonucleoprotein) में miRNPs एकांत, इस प्रकार प्रभावी ढंग से miRNA फ़ंक्शन को रोकना. तथाकथित "miRNA-स्पंज" एक प्रभावी विरोधी भावना प्रौद्योगिकी है, जो कुशलतापूर्वक दोनों विट्रो में और vivo मेंmiRNA downregulate कर सकते हैं । इसलिए, एक miRNA-स्पंज के आवेदन miRNA हानि-समारोह phenotypes अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस धारणा है कि आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) चिकित्सकीय के एक नए वर्ग के लिए नेतृत्व कर सकते है अपनी खोज के बाद जल्द ही कई जांचकर्ताओं का ध्यान पकड़ा । एप्लाइड RNAi चिकित्सकीय के क्षेत्र लैब से बेडसाइड बहुत जल्दी स्थानांतरित कर दिया है । वर्तमान में, miRNA चिकित्सीय कैंसर विज्ञान में तेजी से बढ़ रही चिकित्सीय हस्तक्षेपों में से एक है और इस समय चरण में है 1 नैदानिक परीक्षण. Antisense oligonucleotides, या antagomirs, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया miRNA निरोधात्मक दृष्टिकोण में से एक हैं । एमए एट अल. 22 इस्तेमाल किया मीर-10b antagomir, दोनों विट्रो में और vivo में, एक ठोस ट्यूमर में विनियमित मीर-10b मौन करने के लिए ।

vivo में, विनियमित miRNAs के कुशल मुंह बंद करने बंधन संबध, जैव स्थिरता, और pharmacokinetic गुणों में सुधार करने के लिए antagomirs के एक रासायनिक संशोधन की आवश्यकता है । द्वैध पिघलने तापमान को बढ़ाने के लिए (टीएम) और antagomirs के nuclease प्रतिरोध में सुधार, रासायनिक संशोधनों का प्रदर्शन किया जा सकता है, जैसे 2 '-ओ-मिथाइल (2 ′-o-मुझे), 2 '-o-methoxyethyl (2 ′-मो) 2 '-fluoro, और bicyclic-न्यूक्लिक एसिड बंद ( LNA)23,24,25,26,27,28,29,30,31. vivo डिलिवरी में बेहतर दक्षता के लिए, antagomir को phosphorothioate (PS) लिंकेज द्वारा संशोधित किया जा सकता है, जिससे nuclease प्रतिरोध28बढ़ गया है । इसके अतिरिक्त, पुनश्च रीढ़ संशोधन भी प्लाज्मा प्रोटीन मूत्र उत्सर्जन को कम करने के लिए बाध्यकारी वृद्धि हुई है । इस प्रकार, पुनश्च संशोधित antagomirs pharmacokinetic गुणों का एक महत्वपूर्ण सुधार दिखाने के लिए, उनके प्रणालीगत डिलीवरी३२की सुविधा । यह भी दिखाया गया है कि पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड का उपयोग कर (ॄणा) या morpholino oligomers, एक विशिष्ट miRNA को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया गया, miRNA के नुकसान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता-समारोह phenotypes३३,३४,३५, ३६ , ३७ , ३८ , ३९. Polylysine-संयुग्मित और nanoparticle-जटिल ॄणा antagomirs कुशलतापूर्वक दोनों विट्रो में miRNA फ़ंक्शन को बाधित और vivo में३६,३७,३८, ३९. हाल के अग्रिमों के बावजूद, miRNA-डेरिवेटिव की एक प्रभावी और ऊतक-विशिष्ट डिलीवरी एक चुनौती बनी हुई है. ये बंद लक्ष्य प्रभाव के लिए संभावित शामिल हैं, सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर और, सबसे महत्वपूर्ण, लक्षित अंगों की कोशिकाओं में एक विशिष्ट वितरण प्राप्त करने/

साथ ही, miRNA अभिव्यक्ति स्तर बहुत कक्ष और ऊतक प्रकार४०के आधार पर बदलती हैं । इसके अलावा, miRNA अभिव्यक्ति या बढ़ाया जा सकता है रोग में कमी आई है । एक बदल miRNA अभिव्यक्ति और स्पंज-बाधित miRNA अभिव्यक्ति के साथ सेलुलर और ऊतक समारोह पर प्रभाव का परिणाम के लिए मांय और empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । पशु रोग मॉडल में व्यापक पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए एक दिया miRNA लक्ष्य के लिए अवरोध के इष्टतम स्तर निर्धारित करने की जरूरत है ।

दिलचस्प है, मीर-181c miRNA प्रदर्शन सेलुलर compartmentalization3,4,5। विशेष रूप से, के रूप में की उंमीद है, मीर-181s नाभिक में इनकोडिंग है और लंबे समय के रूप में लिखित पंचायती राज-miRNA टेप जो कोशिका द्रव्य में dicing मशीनरी द्वारा संसाधित कर रहे है और RISC में शामिल किया । हालांकि, विहित miRNAs के विपरीत है कि कोशिका द्रव्य में समारोह, मीर के परिपक्व रूप-181c mitochondria में translocates और कार्यों में mitochondrial के विनियमन-विशिष्ट जीन3। हमने यह दर्शाया है कि मीर-१८१-स्पंज मीर के परिपक्व रूप को बाँध कर cytoplasmic अंश में 181c कर सकते हैं, इस प्रकार mitochondria को translocation से रोक देते हैं. नतीजतन, मीट्रिक टन के एक COX1-181c अभिव्यक्ति की एक downregulation की शर्तों के तहत mitochondria में मनाया जा सकता है ।

हम किसी भी miRNA की अभिव्यक्ति नीचे दस्तक और miRNA-स्पंज के vivo आवेदन में के लिए एक प्रोटोकॉल को रेखांकित करने के लिए एक miRNA-स्पंज डिजाइन करने के लिए आवश्यक पद्धति की सूचना दी है । ऊतक विशिष्ट miRNA अवरोध वर्तमान में एक के तहत miRNA क्षेत्र में विकसित तकनीक है । मानव रोग में अनियमित miRNAs के downregulation या कार्यात्मक निषेध के महत्व का पता चलता है कि यह उपचारात्मक हस्तक्षेप के लिए miRNA जीव विज्ञान का दोहन करने के लिए संभव हो सकता है ।

यह अध्ययन एक miRNA को कम करने के लिए एक रणनीति पर प्रकाश डाला, जो vivo मेंएक ऊतक विशेष तरीके से सफलतापूर्वक नियोजित किया जा सकता है । miRNA-स्पंज miRNA "बीज" अनुक्रम के antisense अनुक्रम का उपयोग । इसलिए, miRNA-स्पंज सभी miRNAs कि एक ही "बीज" अनुक्रम, अर्थात, संपूर्ण miRNA परिवार को साझा करने के लिए downregulate कर सकते हैं । इस अध्ययन में, हम मीर की अभिव्यक्ति के साथ पूरे मीर-१८१ परिवार (मीर-181a, मीर-181b, मीर-181c, और मीर-181d) की एक महत्वपूर्ण downregulation मनाया है-१८१-स्पंज, दोनों विट्रो में और vivo में। यदि एक परिवार के सदस्य संरक्षण प्रदान करते हुए एक और परिवार के सदस्य एक ही अंग के भीतर हानिकारक प्रभाव है, miRNA-स्पंज प्रौद्योगिकी का उपयोग आदर्श दृष्टिकोण नहीं होगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम Leung जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान विभाग, ब्लूमबर्ग पब्लिक हेल्थ के स्कूल, जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय के डिजाइन के साथ अपनी तकनीकी मदद के लिए कश्मीर-१८१-स्पंज के निर्माण के लिए धंयवाद एंथोनी के एल । हम भी Polina Sysa-शाह और आणविक और तुलनात्मक Pathobiology विभाग के कैथलीन Gabrielson, जॉंस हॉपकिंस चिकित्सा संस्थानों miRNA-स्पंज डिलीवरी के vivo इमेजिंग में द्वारा उनकी तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद ।

यह काम NIH, HL39752 (चार्ल्स Steenbergen को) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 14SDG18890049 (समरजीत दास को) से एक वैज्ञानिक विकास अनुदान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । चूहे कार्डियो विशेष प्रमोटर उदारता Jeffery Molkentin द्वारा सिनसिनाटी चिल्ड्रन अस्पताल में प्रदान की गई थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEGFP-C1 vector Addgene 6084-1
In-fusion Clontech 121416
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
miR-181-sponge synthesis Introgen GeneArt custome made
PCR primers Integrated DNA Technologies custome
EcoRI enzymes New Endland Biolabs R0101S
KpnI enzymes New Endland Biolabs R0142S
Rapid DNA Ligation Kit Sigma-Aldrich 11635379001
H9c2 cells ATCC CRL-1446
DMEM Media Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082139
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) Lonza VCA-1005
G418, Geneticin Thermo Fisher Scientific 11811023
FACSAria II Flow cytometer BD Bioscience 644832
Branson 450 sonifier Marshall Scientific EDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device Caliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibody Abcam ab14705
α-tubulin antibody Abcam ab7291
Sequoia C256 ultrasound system Siemens

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References

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जीव विज्ञान अंक १३६ MicroRNA miRNA miRNA-स्पंज miRNA अवरोध nanoparticle nanovector मीर-१८१ हृदय mitochondrial miRNA
<em>वीवो में</em> एक दिल विशेष MicroRNA-स्पंज की Nanovector डिलिवरी
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Kent, O. A., Steenbergen, C., Das, S. In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge. J. Vis. Exp. (136), e57845, doi:10.3791/57845 (2018).

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