Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Na Vivo Entrega de nanovector de uma coração-específicas do MicroRNA-esponja

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57845
Automatic Translation
1, 2, 2
1Princess Margaret Cancer Centre, University of Toronto, 2Department of Pathology, Department of Cardiology, Johns Hopkins University

Summary

Inibição de microRNA tecido-específica é uma tecnologia que é subdesenvolvida no campo do microRNA. Aqui, descrevemos um protocolo para inibir com sucesso a família miR-181 microRNA nas células myoblast do coração. Nanovector tecnologia é usada para entregar um microRNA esponja que demonstra significativa na vivo cardio-específicos miR-181 família inibição.

Abstract

MicroRNA (miRNA) é pequeno não-codificantes do RNA que inibe a expressão pós-transcricional RNA mensageiro (mRNA). Doenças humanas, tais como câncer e doenças cardiovasculares, foram mostradas para ativar o tecido e/ou expressão de miRNA célula específicos associados com a progressão da doença. A inibição da expressão de miRNA oferece a possibilidade de uma intervenção terapêutica. No entanto, as abordagens tradicionais para inibir os miRNAs, empregando antagomir oligonucleotides, afetam funções específicas de miRNA na entrega global. Neste documento, apresentamos um protocolo para a inibição de cardio-específicas na vivo da família miR-181 em um modelo do rato. Uma construção de miRNA-esponja é projetada para incluir 10 sequências repetidas de miR-181 de vinculação. O promotor específico cardio α-MHC é clonado para a determinação de pEGFP para dirigir a expressão específica cardio miR-181 miRNA-esponja. Para criar uma célula estável linha expressando a miR-181-esponja, myoblast H9c2 células é transfected com construção de α-MHC-EGFP-miR-181-sponge e classificada por fluorescência-ativado da pilha (FACs) de classificação em células GFP positivas H9c2 que são cultivadas com neomicina (G418). Após um crescimento estável em neomicina, populações de células monoclonais são estabelecidas pela FACs adicionais e clonagem de célula única. As células de H9c2-miR-181-esponja-GFP resultantes myoblast exibem uma perda da função dos membros da família miR-181, avaliadas através do aumento da expressão de proteínas do alvo miR-181 e em comparação com células H9c2, expressando uma esponja não-funcional scramble. Além disso, nós desenvolvemos um nanovector para a entrega sistêmica da construção de miR-181-esponja por complexantes carregados positivamente lipossomas nanopartículas e miR-181-esponja plasmídeos com carga negativa. Na vivo por imagens do GFP revela que múltiplas injeções de veia cauda de um nanovector durante um período de três semanas são capazes de promover uma expressão significativa da miR-181-esponja de forma cardio-específica. Importante, uma perda da função de miR-181 é observada no tecido do coração, mas não no rim ou fígado. A miRNA-esponja é um método poderoso para inibir a expressão tecido-específica miRNA. A expressão de miRNA-esponja de condução de um promotor de tecido-específica fornece especificidade para a inibição de miRNA, que pode ser confinada a um alvo de órgão ou tecido. Além disso, combinando tecnologias nanovector e miRNA-esponja permite uma entrega eficaz e miRNA tecido-específica inibição na vivo.

Introduction

Nas últimas duas décadas, tem havido inúmeros estudos que apontam para o papel significativo dos miRNAs em doenças humanas. Resultados de um vasto corpo de literatura demonstram a importância inegável de miRNAs na fisiopatologia de doenças como o câncer1 e doença cardiovascular2,3,4,5. Por exemplo, miR-21 é upregulated em muitos tipos de câncer, resultando em um aumento ciclo celular e celular proliferação6. Em infecções de hepatite C, miR-122 desempenha um papel importante na replicação do vírus7, e tem sido demonstrado que a inibição da miR-122 diminui a carga viral8. Na hipertrofia cardíaca, miR-212/132 é upregulated no coração e está envolvido com o fenótipo patológica9. A importância óbvia da downregulation ou inibição funcional de uma miRNA upregulated sugere oportunidades para explorar terapeuticamente a biologia de miRNA em quase todas as doenças.

Os quatro membros da família 181-miR, miR-181/b/c/d, encontram-se em três locais genoma no genoma humano. A região intrônicas de um gene de anfitrião de RNA não-codificante (MIR181A1-HG) codifica o cluster de miR-181-a/b-1. A região intrônicas do gene NR6A1 codifica a miR-181-a/b-2. O cluster miR-181-c/d está localizado em uma transcrição descaracterizada no cromossomo 19. Todos os membros da família miR-181 compartilham a mesma sequência de "semente" e todos os quatro membros da família miR-181 potencialmente podem regular os mesmos objectivos de mRNA.

Nós3,4 e outros10 já destacou a importância da miR-181 membros da família durante a insuficiência cardíaca estágio final. Também reconhecemos que uma upregulation de miR - 181c ocorre sob condições patológicas associadas com um risco aumentado de doença cardíaca, tais como diabetes tipo II, obesidade e envelhecimento3,4,5. Foi postulado que a superexpressão de miR - 181c provoca estresse oxidativo, que leva a uma disfunção cardíaca4.

Vários grupos têm sugerido que miRNA existem mitocôndrias11,12,13,14, mas nós fomos os primeiros a demonstrar que miR - 181 c é derivado do genoma nuclear, processado, e posteriormente translocada para a mitocôndria no RISC3. Além disso, detectamos uma baixa expressão de miR-181 e miR-181b no compartimento mitocondrial do coração5. Importante, nós encontramos que miR - 181c reprime a expressão de RNAm de mt-COX1, mostrando assim que os miRNAs participar no Regulamento do gene mitocondrial e alterar a função mitocondrial3,4.

Este artigo discute a metodologia necessária para projetar uma miRNA-esponja para derrubar toda a família em cardiomyocytes miR-181. Além disso, nós esboçamos um protocolo para o aplicativo na vivo da miR-181-esponja.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Universidade Johns Hopkins.

1. esponja Design

  1. MicroRNA ligação 3' UTR
    Nota: A miRNA funções através de interações de emparelhamento base específicas com sites parcialmente complementares da região 3' untranslated (UTR) dos seus mRNAs de destino (para uma revisão abrangente, consulte Bartel)15.
    1. Desenha os inibidores de miRNA expressão como oligonucleotides que contêm significativa complementaridade à sequência de miRNA. Sequestrar um miRNA em do oligonucleotide complexo através de extensa base de emparelhamento para bloquear a função de miRNA.
  2. Desenho de uma esponja de miRNA
    1. Projeto tandemly vestiu as sequências de miRNA parcialmente complementares para incluir uma protuberância na posição normalmente clivada por Argonaute 2. O bojo é posicionado no 9-12 de nucleotídeos da sequência de miRNA maduro para impedir qualquer RNA interferência tipo segmentação e a degradação da esponja.
    2. Se desejar, projetar a sequência de destino de chamariz para ligar a todos os membros da família miR-181. Após um exame e comparação das sequências miRNA família miR-181, encontrar uma sequência comum em 5' lado da protuberância contendo 8 nucleotídeos consecutivos, ou uma sequência comum para todos os 4 membros da família miR-181 no 3' lado da protuberância de um adicional de 8 nucleotídeos consecutivos. Estes 2 sequências representam os locais de ligação de meia esquerda e direita, respectivamente.
      Nota: A sequência de isca é uma matriz em tandem dos sites separados por um espaçador GGA vinculação de meia esquerda e direita. Interligar a sequência 5'-final e a sequência 3'-lado (descrito na etapa 1.2.2) com um espaçador GGA projetado para criar o bojo quando recozida para uma miRNA (conforme descrito na etapa 1.2.1). Repita este 1 sítio de ligação de miRNA 10 x na construção final miR-esponja.
  3. Outras considerações de esponja de miRNA
    Nota: Para clonar a sequência de esponja para o vetor de expressão destinatário, sites de reconhecimento de nucleases de restrição devem ser incluídos em cada extremidade da sequência. Uma análise em silico digestão deve ser usada para confirmar a clivagem não-específica da sequência de esponja pelas enzimas de restrição escolhidas e outras enzimas de restrição, utilizadas em aplicações a jusante de clonagem.
    1. Adicione um codão stop duplo (TAA TAA) 5'-na extremidade do sintético 3' UTR, tal que a sequência de miR-181-esponja não é parte da sequência de codificação para uma proteína verde fluorescente melhorada (EGFP).
  4. Síntese da esponja DNA para clonagem
    1. Usar um sintetizador de DNA ou empregar uma fonte disponível comercialmente para sintetizar a sequência de esponja de miRNA final com locais de reconhecimento de nuclease limitação no lugar de clonagem. A esponja é enviada em um plasmídeo que pode conter marcadores selecionáveis para uma amplificação em bactérias. Além disso, a esponja pode ser amplificada por uma reação em cadeia do polymerase (PCR) para clonagem ou simplesmente retirou-se do vetor de doador usando os sites de restrição descritos na etapa 1.3 (consulte também passo 3.1).

2. clonagem do vetor do destinatário para incluir um promotor de tecido-específica

Nota: Use o vetor pEGFP-C1 como o vetor de destinatário para a gaveta de expressão da esponja miRNA. O vetor pEGFP-C1 contém um quadro de leitura para um EGFP impulsionado por um promotor de citomegalovírus (CMV). O promotor CMV é constitutivamente ativo em células de mamíferos. Se um promotor de tecido-específica é necessário, o promotor CMV pode ser removido pela digestão das enzimas AseI e NheI (consulte a etapa 2.1). O plasmídeo contém um extenso local de clonagem múltipla (MCS) bem como canamicina (Kan) e neomicina (G418) marcadores para uma seleção em bactérias e um expressao em células de mamíferos, respectivamente.

  1. Removendo o promotor CMV de pEGFP-C1
    1. Fazer 50 μL de reação de digestão contendo tampão de digerir comercialmente disponível sugerida pelo fabrico das enzimas de restrição usada 1x, 5 μg de plasmídeo (em água) e 5 μL de enzimas AseI e NheI. Adicionar todos os componentes para um tubo de microcentrifugadora e delicadamente, misture-os por agredi-lo. Girar o tubo para 10 s em um microcentrifuge para coletar a reação na parte inferior. Incube a reação em banho-maria 37 ° C por 15 min.
    2. Purifica o plasmídeo linear digerido. Adicionar 5 vezes o volume de reação de tampão de ligação de coluna (uma mistura proprietária do buffer de ligação apropriado para a fabricação das colunas de purificação de DNA usada) e purificar a reação com uma coluna de purificação de DNA, conforme descrito pelo fabricante. Eluir com 25 μL de tampão de eluição (água) adicionado com cuidado para o centro da coluna.
    3. Gel de purificar o plasmídeo digerido em gel de agarose de 0,5% da seguinte forma: Adicionar 5 μL de tampão (50% de glicerol-3 x tintura de carregamento) a carregar para o plasmídeo eluted. Carrega a amostra inteira em 1 bem em gel de agarose de 0,5%. Incluir uma pista separada com 500 ng do vetor sem cortes. Executá-lo por 30-40 min, até que seja alcançada uma separação adequada de plasmídeos de corte e sem cortes.
    4. Purificar o plasmídeo linear da seguinte forma: Visualizar o DNA no gel do agarose em uma caixa de luz UV. Com uma lâmina de barbear limpa, cuidadosamente excisar a banda correspondente para o plasmídeo linear.
      Nota: O plasmídeo linear deve executar mais baixo do que o plasmídeo sem cortes e aparecerá como uma única banda em aproximadamente 4,2 kb. O promotor CMV extirpado aparecerá como uma banda de luz em aproximadamente 500 nucleotídeos (nt).
    5. Extrair o DNA da fatia gel usando um kit disponível comercialmente e eluir o DNA da coluna com 25 μL de água.
  2. Clonagem de um promotor específico coração em pEGFP-C1
    Nota: O promotor de cadeia pesada de miosina-alfa (α-MHC) foi anteriormente caracterizado e demonstrado para direcionar robustos níveis de expressão de restrição cardíaca, conforme descrito no seguinte Molkentin, Jobe e Markham16. As próximas seções descrevem como amplificar o promotor do vetor de clonagem.
    1. Clonar o promotor α-MHC entre elementos 420 para-2934 relativo para o site de início de transcrição para o plasmídeo de p4016 pelo primeiro projetar primers PCR que ladeiam a esta região e, em seguida, o plasmídeo, como um modelo para o PCR. Amplifica a região promotora usando PCR primers descrito anteriormente5. Iniciadores de PCR para diante e reversos contêm sequências de sobreposição aos fins digeridos da pEGFP-C1 (passo 2.1) para permitir a clonagem dirigido em fusão. Consulte o manual de In-fusão para uma explicação abrangente sobre o projeto da primeira demão de clonagem de In-fusão. Sequências da primeira demão são encontradas na tabela 1.
    2. Preparar uma reação de PCR de 50 μL, que contém 1 μM de cada primer e 10 ng de DNA de modelo. Adicione uma quantidade adequada de enzima PCR e dNTPs dependendo o fabrico dos reagentes PCR escolhido. Realize PCR em um bloco padrão de ciclismo DNA. Executar um 3 min 98 ° C desnaturação passo, seguido por 35 ciclos de desnaturação, recozimento e extensão de 5, 30 e 120 s cada, respectivamente. Incluem uma extensão final de 10 min a 72 ° C.
    3. Limpe a extração do PCR e gel. Após a conclusão do ciclo de PCR, adicione 5 x o volume de reação de tampão de ligação a coluna para a reação de PCR e purificá-la com uma coluna de purificação de DNA, conforme descrito pelo fabricante. Eluir a mistura com 25 μL de tampão de eluição (água) adicionado com cuidado para o centro da coluna.
      1. Adicione 5 μL de carregando buffer [50% glicerol (3x) carregando o corante] a eluted do plasmídeo. Carrega a amostra inteira em 1 bem em gel de agarose 1%. Executá-lo por 30-40 min; Visualizar e retirar o produto do PCR como descrito acima (passo 2.1.5).
    4. Ligam o promotor α-MHC com o pEGFP-C1 da seguinte forma: adicionar a reação da ligadura de 10 μL contendo 1 x 1 μL de vetor tornado linear, 2 μL do PCR purificado e buffer de ligadura comercialmente disponível. Realizar a ligadura a 50 ° C por 15 min e depois resfriá-lo no gelo.
    5. Executar uma transformação bacteriana como segue: transfect 50 μL de células competentes com 2,5 μL de mistura de ligadura no Fusion, adicionando os componentes. Descansar a Eppendorf tubo no gelo por 20 min, colocá-lo em um banho de água de 42 ° C durante 40 s e depois lugar o tubo no gelo por 2 min.
      1. Após a transformação, adicionar 350 μL da mídia SOC e desenvolvem-se células a 37 ° C por 45 min. placa 200 μL de solução de consequência em placas LB com Kan. realizar uma colônia PCR para identificar Kan resistentes células que contêm a ligadura de promotor de α-MHC.
        Nota: Triagem primers foram projetados para PCR através da junção de ligadura.
    6. Expanda os clones PCR positivos em caldo LB-Kan e em plasmídeos purificados usando protocolos de purificação de plasmídeo prep mini padrão conforme descrito pelo fabricante.

3. clonagem a esponja

  1. Digerir o vetor de destinatário
    1. Fazer o plasmídeo de α-MHC-pEGFP linear para clonagem com EcoRI e KpnI e purificar o gel como descrito acima (passo 2.1).
  2. PCR amplificar e digerir a DNA de esponja
    1. Use o scramble 284-nt-long miR-181-esponja e correspondente transporte vetores como o modelo para o PCR. Amplifica a região de esponja usando descrito anteriormente PCR primers5. Observe que para diante e reversos iniciadores de PCR contêm sequências de enzima de restrição, para permitir a ligadura em α-MHC-pEGFP-C1. Realize o PCR como descrito acima (passo 2.2.2). Purifica os produtos PCR antes da digestão como descrito (etapa 2.2.3) e eluída-los com água para a digestão. Para sequências da primeira demão, consulte tabela 1.
    2. Digeri a DNA de esponja para ligadura. Uma reação de digestão de 50 μL contém 1 x buffer de digerir, a reação de PCR gel-purificado da etapa 3.2.1 e 5 μL de enzimas EcoRI tanto KpnI. Adicionar todos os componentes para um tubo de microcentrifugadora e delicadamente, misture-os por agredi-lo. Girar o tubo para 10 s em um microcentrifuge para coletar a reação na parte inferior. Incube a reação em banho-maria 37 ° C por 15 min.
    3. Purifica a esponja PCR digerida usando uma coluna de limpar PCR conforme descrito anteriormente (etapa 2.2.1).
  3. Ligate a miR-181-esponja em vetor α-MHC-pEGFP-C1
    1. Configurar uma reação de ligadura μL 21 que contém 1 x buffer de ligadura, 3 μL de digerido e purificado PCR miR-181-esponja, 1 μL de vetor tornado linear de α-MHC-pEGFP-C1, buffer de DNA 1 x e 1 μL de DNA ligase. Realizar a ligadura em temperatura ambiente por 5 min e em seguida, coloque-o no gelo.
    2. Transforme 50 μL de células competentes XL1-azul com 2 μL de mistura de ligadura. Use a transformação e chapeamento protocolos como descrito acima (passo 2.2.5). Realize uma colônia PCR para identificar bactérias resistentes Kan, que contêm a sequência correta de α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge. Desenho de primers para PCR de triagem através da junção de ligadura. Consulte a tabela 1 para sequências da primeira demão.
    3. Amplificar e sequenciar o vetor. Expanda os clones PCR positivos em caldo LB-Kan e em plasmídeos purificados usando protocolos de purificação de plasmídeo prep mini padrão. Execute um sequenciamento de DNA para verificar se o plasmídeo expressando as sequências de DNA desejadas.

4. geração de células de expressar miR-181-esponja H9c2 estável

  1. Crescimento e manutenção das células H9c2
    1. Células de cultura de H9c2 em modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) contendo soro fetal bovino (FBS) a uma concentração final de 10%. Subcultura as células usando protocolos padrão e cultivá-las a 37 ° C 5% de dióxido de carbono.
  2. Transfection e seleção de H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge expressando as células
    1. Execute uma poração de células H9c2 para os melhores resultados. Transfect rato mioblastos (H9c2) com uma esponja scramble (uma sequência de 284-nt-long scramble que substitui a miR-181-esponja-sequência) ou a construção de α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge com um electroporator.
      1. Brevemente, transfect 4 x 10-5 células com 2 μg de DNA de plasmídeo (em 5 µ l de H2O) e 100 µ l de uma solução compatível com o aparelho de eletroporação. Use um programa de eletroporação de DS-120 para transfect as células H9c2.
      2. Incube as celulas transfectadas na cubeta para 10 min à temperatura ambiente. Adicione 500 µ l de DMEM diretamente para a cubeta. Delicadamente, transferi o conteúdo de cubeta total para um poço de uma placa de 6.
    2. Selecione para células positivas de GFP depois do pós-transfection 48 h, pela FACs. Apenas as células GFP-expresso da placa em uma placa de 6 com uma adição de neomicina (G418) (400ng/mL) para a mídia de crescimento completo.
      Nota: Antes da seleção G418, uma curva de morte deve ser estabelecida para determinar a quantidade de neomicina, necessária para a seleção. Para as células H9c2, 400 ng/mL de G418 resultou em uma cerca 80% taxa de morte de não-plasmídeo transfected H9c2 células após 24h e foi considerada a concentração desejada de trabalho de G418 para estas células. A linha celular foi considerada estável depois de crescimento foi mantido em G418 16 dias.
    3. Execute a classificação de FACs das células G418 estáveis usando a expressão da GFP como marcador para uma seleção positiva de esponja. Sementes de 5-10 pilhas em cada poço de uma placa de 96 poços, classificando o fluxo. Expanda as células monoclonais da placa de 96 poços para placas de 24 poços com várias passagens. Estoques de congelador do uso de células de passagem 3 células (P3) como ponto de partida para experiências posteriores.
    4. Execute todos os experimentos baseados em células-linha com células de baixo-passagem entre P5 e P10.

5. síntese e purificação de esponja-nanopartículas (miR-181-esponja nanopartículas)

  1. Prepare as nanopartículas lipossomas dissolvendo amphiphile catiônica (DOTAP) e co de lipídios, colesterol e DSPE-PEG-OMe, em uma relação de 5:5:0.1 mM, respectivamente, em uma mistura de clorofórmio e metanol em um frasco de vidro.
  2. Remova o solvente orgânico em 44-45 ° C, sob vácuo, usando um evaporador rotativo, seguido de um fluxo suave de nitrogênio livre de humidade. Manter o filme seco restante de lipídios de vácuo elevado para 8 h.
  3. Prepare uma mistura adicionando 5% de glicose para o filme lipídico vácuo secas. Deixá-lo durante a noite para permitir que esta mistura hidratar o filme. Vórtice do frasco para 2 a 3 min à temperatura ambiente para produzir vesículas multilamellar com uma agitação ocasional em um banho de água de 45 ° C.
    1. Proceda à sonicação as vesículas multilamellar para preparar unilamellar pequenas vesículas em um banho de gelo para 3-4 min até clareza pode ser observada, em um ciclo de trabalho 100% e 25 W de potência.
  4. Misture uma sequência codificada ou uma sequência de miR-181-esponja clonado em vetores pEGFP(α-MHC) e lipossomas em uma base de proporção 1:3 carga para formar o nanovector4.
    Nota: Um complexo eletrostático de nanopartículas lipossomas carga positiva e carga negativa plasmídeo é conhecido como um nanovector.

6. sistêmica entrega de esponja-nanopartículas e validação dos efeitos In Vivo

  1. Entrega sistêmica de esponja-nanopartículas em ratos
    1. Use ratos Sprague-Dawley (SD). Injete por via intravenosa os ratos com o nanovector miR-181-esponja ou nanovector scramble na veia da cauda. Use ratos machos SD, que são cerca de 200 g de peso.
    2. Realizar a injeção de veia de cauda usando uma dose de 4 mg de nanovector/kg de peso corporal e repita isso usando um regime de 6 injeções de veia de cauda durante 2 semanas. Após a entrega de nanovector repetidas, prever um período de 1 semana (dias 15-21) para a expressão do vetor em vivo.
    3. Confirme a otimização de imagem o sinal GFP, antes, durante e após a entrega de nanovector. Analise o sinal GFP por software de imagens tomográfica, que gera dados semi-quantitativa.
  2. Validação de na vivo miR-181 inibição pela miR-181-esponja
    1. Execute o borrão ocidental para demonstrar a expressão de uma funcional miR-181-esponja no tecido do coração.
      Nota: Para este estudo, mt-COX1 expressão foi examinado.
  3. Consequências funcionais de na vivo expressão miR-181-esponja no coração
    1. Realize uma ecocardiograma bidimensional, modo M e Doppler durante e após a entrega de nanovector para analisar a função cardíaca e alterações morfológicas. Para uma melhor verificação capacidade nos corações roedores, use um sistema de ultra-som, equipado com um transdutor de matriz linear de 15 MHz.
    2. Anestesia pode influenciar a contratilidade cardíaca; Portanto, realize a entrega da nanovector miR-181-esponja ou scramble nanovector aos animais que são conscientes e sem qualquer reagente anestésica durante o processo de ecocardiografia. Por favor, ver Souza, et al. 4 para mais esclarecimentos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nas estàvel transfectadas pEGFP-miR-181-esponja-expressando H9c2 células (da etapa 4.2), a expressão da família inteira de miR-181 (miR-181, 181b-miR, miR - 181c e miR - 181d) moderadamente foi diminuída em relação pEGFP-ovos mexidos-expressando H9c2 células. MiR-181-esponja serve como um inibidor competitivo de toda a família de miR-181, então nós antecipamos que a expressão da miR - 181c mitocondrial alvo gene, mt-COX1, aumentaria. Borrão ocidental dados sugerem que a expressão de mt-COX1 foi aumentada nas células pEGFP-miR-181-esponja-expressando H9c2 em comparação com as células de H9c2 pEGFP-scramble-expresso. Além disso, nenhuma alteração de expressão para COX2-mt ou mt-COX3 foram detectados através de immunoblot nas células H9c2 pEGFP-miR-181-esponja-expressando. Usamos a α-tubulina como o controle de normalização para a análise de immunoblotting. Sinais GFP foram observados principalmente no fígado e rim até à entrega pós-sistêmica de 2 semanas do nanovector miR-esponja (figura 1A). No entanto, a expressão de GFP foi significativamente maior no tecido cardíaco após 3 semanas de entrega nanovector miR-181-esponja (figura 1A e 1B). Digno de nota, havia um sinal GFP detectado no tecido hepático em alguns animais, 3 semanas após o parto sistêmica; no entanto, não havia nenhum efeito funcional da miR-181-esponja no fígado naquele ponto do tempo.

Western blot mostrou um aumento significativo na expressão de mt-COX1 nos ratos nanovector-injetado miR-181-esponja, em comparação com os grupos de nanovector scramble (Figura 2). Mt-COX1 superior sugere que há uma baixa expressão de miR - 181c no coração após 3 semanas da entrega nanovector miR-181-esponja, como mt-COX1 é o alvo direto para miR - 181c. Usamos a α-tubulina como o controle de normalização para o immunoblots.

Ecocardiografia não mostrou nenhuma mudança na função cardíaca de ratos nanovector-injetado miR-181-esponja antes, durante e no fim do regime de tratamento, em comparação com o grupo de nanovector scramble de animais.

Figure 1
Figura 1. Na vivo análise de nanovector entrega da miR-181-esponja. (A), este painel mostra os protocolos de tratamento otimizado de 3 semanas com 6 injeções intravenosas na veia da cauda. O colorido amarelo na imagem de epifluorescência demonstra a expressão do vetor pEGFP. A máxima intensidade da coloração amarela é observada na semana de 3 ponto de tempo. Sequência de promotor (B) α-MHC do vetor pEGFP expressa seletivamente a miR-181-esponja ou a sequência codificada no coração no dia 21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Validação do efeito da nanovector miR-181-esponja na expressão de miR - 181c. Esta é a análise de borrão ocidental da expressão mt-COX1 nos lysates do coração obtidos a partir de pEGFP-scramble e pEGFP-miR-181-esponja injetado nanovector ratos. Todo coração homogenates foram analisados com os anticorpos indicados. Usamos a α-tubulina como um controle de carregamento. A banda-densitometria é mostrado no gráfico de barra abaixo. T do estudante-teste foi realizado, e o erro padrão foi plotado no gráfico de barra como barras de erro. p < 0.05 vs grupo pEGFP-scramble. n = 4.

Nome da primeira demão Sequência de TM Notas Uso Alvo
SAM3-1F ATGCATTAGTTATTAATGCTT
GACACACTTGACAATTTCT		 58,4 Promotor de rato MHC para clonar em EGFP PCR Promotor de MHC
SAM3-2R GACCGGTAGCGCTAGCTG
ACTCACTGGGAGATTGCTT		 59,8 Promotor de rato MHC para clonar em EGFP PCR Promotor de MHC
SAM3-3F CGAACGACCTACACCGAACT 64 Tela EGFP-F PCR de colônia Clones positivos promotor
SAM3-4R CGCTAGTCCTTGACCCTCTG 63,9 Tela MHC-R PCR de colônia Clones positivos promotor
SAM5-1F CCTGTCTCCAACACACAAGC 59.3 Promotor de sequência MHC Sequenciamento Promotor de MHC
SAM5-2R CAGACTGCAGGGCTGGTT 60 Promotor de sequência MHC Sequenciamento Promotor de MHC

Tabela 1. Sequências da primeira demão.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este artigo descreveu o projeto e a síntese de uma esponja-miRNA e demonstrou como a expressão tecido-específica da esponja é uma poderosa ferramenta para inibir a expressão família miRNA tecido-específica.

Temos demonstrado que uma família de miR-181 visando a esponja pode ser clonada em um plasmídeo de expressão com um promotor específico cardíaco. O plasmídeo pode ser eficientemente empacotado em uma partícula de nanovector para entrega tanto in vitro e em vivo usando eletroporação ou uma injeção de veia da cauda, respectivamente (Figura 1). A esponja de miR-181 pode inibir uma expressão cardíaco-específicas da família miR-181 e pode afetar a expressão de genes alvo miR-181 (Figura 2). O GFP no plasmídeo é uma vantagem adicional, que pode visualizar a entrega e o perfil de expressão do nanovector sem sacrificar os animais.

Brevemente, uma esponja-miRNA consiste de uma série de sequências antisentido miRNA, colocado após um gene repórter, que age como um chamariz miRNA alvo do mRNA. Naturalmente ocorrendo miRNA-esponjas foram encontradas para ser endogenamente expressa em células animais e plantas como há muito não-codificantes RNAs (lncRNAs)17. No presente estudo, utilizamos uma abordagem de esponja para inibir toda a família do miR-181 no coração. Embora a abordagem de miR-181-esponja é um método fisiologicamente relevante para downregulate a família miR-181 em culturas de células, um aplicativo na vivo de miR-181-esponjas pode ser prejudicial. Por exemplo, vários estudos têm demonstrado um papel protetor de miR-181 e miR-181b em células/tecidos diferentes tipos18,19,20. Portanto, a expressão de miR-181-esponja deve ser direcionada especificamente ao tecido do coração.

Pequenos oligonucleotídeos tenham sido demonstrados para bloquear a função de miRNA através do recozimento para strand guia miRNA maduro e evitar um carregamento adequado para o complexo silencioso induzido por RNA (RISC). Um problema associado com esta abordagem é que os oligonucleotides deve ser entregue em uma dose de impregnação suficiente para bloquear o celulares piscinas de miRNAs maduros. Os oligonucleotides também sofrem desafios envolvendo o transporte através de membranas celulares e uma estabilidade geral da molécula. Engenhosamente, ficou demonstrado que um alvo de miRNA fornecido exogenamente pode atuar como um chamariz para o seu cognato miRNA21. Em virtude de vários sites de ligação amarrados em um pseudo 3' UTR construir, o destino de chamariz ou miRNA-esponja, é capaz de estàvel interagir com seu alvo miRNAs e sequestrar o miRNA em complexos microribonucleoprotein (miRNPs), assim eficazmente impedindo que a função de miRNA. O so-called "miRNA-esponja" é uma tecnologia de antisenso eficaz, que pode eficientemente downregulate miRNA tanto in vitro e in vivo. Portanto, a aplicação de uma esponja-miRNA pode ser usada para estudar miRNA fenótipos de perda-de-função.

A noção de que o RNA de interferência (RNAi) poderia levar a uma nova classe de terapêutica chamou a atenção de muitos investigadores logo após sua descoberta. O campo de aplicação terapêutica de RNAi moveu muito rapidamente do laboratório para o leito. Atualmente, miRNA terapêutica é uma das intervenções terapêuticas em Oncologia crescimento rápido e está atualmente em fase de ensaios clínicos 1. Os oligonucleotides antisentidos, ou antagomirs, são uma das abordagens mais amplamente utilizado miRNA inibitório. Ma et al . 22 usado antagomir miR-10b, tanto in vitro e em vivo, para silenciar upregulated miR-10b em um tumor sólido.

In vivo, o silenciar eficiente de miRNAs upregulated exige uma modificação química do antagomirs para melhorar a afinidade de ligação, biostability e propriedades farmacocinéticas. Para aumentar o duplex (Tm) de temperatura de fusão e melhorar a resistência de nuclease do antagomirs, podem ser executadas modificações químicas, tais como 2 '-O-metil (2 '-O-Me), 2 '-O-metoxietílico (2 '-MOE) 2 '-fluoro e o bicíclico bloqueado de ácidos nucleicos ( LNA)23,24,25,26,,27,28,29,30,31. Para uma melhor eficiência da entrega na vivo , o antagomir pode ser modificado pelos vínculos phosphorothioate (PS), que aumentaram a resistência de nuclease28. Além disso, as modificações de espinha dorsal do PS também reforçar a ligação às proteínas plasmáticas, reduzindo a excreção urinária. Assim, PS-modificado antagomirs mostram uma melhoria significativa das propriedades farmacocinéticas, facilitando sua entrega sistêmica32. Também tem sido demonstrado que usar peptídeo de ácidos nucleicos (PNA) ou Morpholinos oligómeros, projetados para atingir uma miRNA específico, pode ser usado para estudar miRNA fenótipos de perda-de-função33,34,35, 36 , 37 , 38 , 39. Polylysine-conjugados e nanopartículas-complexado antagomirs PNA eficientemente inibir a miRNA funcionar tanto in vitro e in vivo36,37,38, 39. apesar dos avanços recentes, uma entrega eficaz e tecido-específica de miRNA-derivados permanece um desafio. Estes incluem o potencial de efeitos fora do alvo, provocando inatas respostas imunes e, mais importante, obtendo uma entrega específica em células de tecidos/órgãos alvo.

Além disso, os níveis de expressão de miRNA variam muito, dependendo da célula e tecido digite40. Além disso, a expressão de miRNA pode ser aumentada ou diminuída na doença. A consequência de uma expressão de miRNA alterada e o efeito sobre a função celular e tecido com expressão de miRNA inibidora de esponja deve ser validado e determinada empiricamente. Extensos estudos pré-clínicos em modelos animais da doença são necessários para determinar o nível óptimo de inibição para um alvo determinado miRNA.

Curiosamente, o miR - 181c miRNA exibe compartimentalização subcelular3,4,5. Especificamente, como esperado, o miR-181s são codificados no núcleo e transcrito como long-pri-miRNA transcrições são processadas no citoplasma da máquina de corte em cubos e incorporadas em RISC. No entanto, ao contrário de miRNAs canônicos que funcionam no citoplasma, a forma madura de miR - 181c translocates nas mitocôndrias e funções na regulação dos genes mitocondriais específico3. Nós demonstramos que a miR-181-esponja pode vincular a forma madura de miR - 181c na fração citoplasmática, impedindo assim a translocação para a mitocôndria. Por conseguinte, um upregulation de mt-COX1 pode ser observado nas mitocôndrias nas condições de uma downregulation da miR - 181c expressão.

Nós temos relatado a metodologia necessária para projetar uma miRNA-esponja para derrubar a expressão de qualquer miRNA e delineou um protocolo para o aplicativo na vivo da miRNA-esponja. Inibição de tecido-específica miRNA atualmente é uma técnica de subdesenvolvidos no campo miRNA. A importância da regulação baixa ou inibição funcional de miRNAs upregulated em doença humana sugere que é possível explorar a biologia de miRNA para intervenção terapêutica.

Este estudo destacou uma estratégia para a redução de uma miRNA, que pode ser empregado com sucesso em uma forma de tecido-específica em vivo. MiRNA-esponjas que utilizam a sequência antisentida da sequência de "semente" miRNA. Portanto, miRNA-esponjas podem downregulate todos os miRNAs que compartilham a mesma "semente" sequência, Viz, a família inteira miRNA. Neste estudo, observamos uma significativa downregulation da família inteira de miR-181 (miR-181, 181b-miR, miR - 181c e miR - 181d) com a expressão da miR-181-esponja, tanto in vitro e in vivo. Se um membro da família confere proteção enquanto outro membro da família tem efeitos nocivos no âmbito do mesmo órgão, usando a tecnologia de miRNA-esponja não seria a abordagem ideal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos a Anthony K. L. Leung do departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Bloomberg School of Public Health, Universidade de Johns Hopkins para seu técnico ajuda com projeto de construção de miR-181-esponja. Agradecemos também Polina Sysa-Sousa e Kathleen Gabrielson do departamento de Molecular e Patobiológico comparativo, Johns Hopkins Medical instituições para sua assistência técnica pela imagem no vivo da entrega miRNA-esponja.

Este trabalho foi apoiado por concessões do NIH, HL39752 (para Charles Steenbergen) e por uma concessão de desenvolvimento de cientista do 14SDG18890049 a associação americana do coração (para Samarjit Das). O promotor de cardio-específico do rato foi generosamente fornecido por Jeffery D. Molkentin no Hospital infantil de Cincinnati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEGFP-C1 vector Addgene 6084-1
In-fusion Clontech 121416
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
miR-181-sponge synthesis Introgen GeneArt custome made
PCR primers Integrated DNA Technologies custome
EcoRI enzymes New Endland Biolabs R0101S
KpnI enzymes New Endland Biolabs R0142S
Rapid DNA Ligation Kit Sigma-Aldrich 11635379001
H9c2 cells ATCC CRL-1446
DMEM Media Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082139
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) Lonza VCA-1005
G418, Geneticin Thermo Fisher Scientific 11811023
FACSAria II Flow cytometer BD Bioscience 644832
Branson 450 sonifier Marshall Scientific EDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device Caliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibody Abcam ab14705
α-tubulin antibody Abcam ab7291
Sequoia C256 ultrasound system Siemens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
  2. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
  3. Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
  4. Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
  5. Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
  6. Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
  7. Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
  8. Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
  9. Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
  10. Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
  11. Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
  12. Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
  13. Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
  14. Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
  15. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  16. Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
  17. Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
  18. Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
  19. Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
  20. Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
  21. Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
  22. Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
  23. Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
  24. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  25. Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
  26. Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
  27. Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
  28. Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
  29. Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
  30. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
  31. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  32. Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
  33. Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
  34. Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
  35. Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
  36. Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2'-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
  37. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  38. Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
  39. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  40. Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).

Tags

Biologia questão 136 MicroRNA miRNA miRNA-esponja miRNA inibição nanopartículas nanovector miR-181 coração miRNA mitocondrial
<em>Na Vivo</em> Entrega de nanovector de uma coração-específicas do MicroRNA-esponja
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kent, O. A., Steenbergen, C., Das,… More

Kent, O. A., Steenbergen, C., Das, S. In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge. J. Vis. Exp. (136), e57845, doi:10.3791/57845 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter