Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

In Vivo Nanovector levering af en hjerte-specifikke MicroRNA-svamp

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57845
Automatic Translation
1, 2, 2
1Princess Margaret Cancer Centre, University of Toronto, 2Department of Pathology, Department of Cardiology, Johns Hopkins University

Summary

Væv-specifikke microRNA hæmning er en teknologi, der er underudviklede i feltet microRNA. Heri, beskriver vi en protokol for at kunne hæmme familien miR-181 microRNA i myoblast celler fra hjertet. Nanovector teknologi bruges til at levere en mikroRNA svamp, der viser betydelig i vivo cardio-specifikke miR-181 familie hæmning.

Abstract

MikroRNA (miRNA) er små ikke-kodende RNA, som hæmmer post-transcriptional messenger RNA (mRNA) udtryk. Menneskelige sygdomme som kræft og hjerte-kar-sygdom, har vist sig at aktivere væv og/eller celle-specifikke miRNA udtryk i forbindelse med sygdomsprogression. Hæmning af miRNA udtryk giver mulighed for en terapeutisk intervention. Traditionelle metoder til at hæmme miRNAs, beskæftiger antagomir oligonukleotider, vil dog påvirke specifikke miRNA funktioner ved global levering. Heri, præsenterer vi en protokol for i vivo cardio-specifik hæmning af miR-181 familie i en rotte model. En miRNA-svamp konstruktion er designet til at indeholde 10 gentagne miR-181 bindende sekvenser. Cardio-specifikke α-MHC promotor er klonet i pEGFP rygrad til at drive cardio-specifikke miR-181 miRNA-svamp udtryk. For at skabe en stabil celle er linje at udtrykke miR-181-svamp, myoblast H9c2 celler transfekteret med den α-MHC-EGFP-miR-181-sponge konstruktion og sorteret efter fluorescens-aktiveret celle sortering (FACs) til normal god landbrugspraksis positive H9c2 celler, der er kulturperler med neomycin (G418). Efter en stabil vækst i neomycin, monoklonale cellepopulationer er etableret af yderligere FACs og enkelt celle kloning. De resulterende myoblast H9c2-miR-181-svamp-NGL celler udviser et tab af funktion af miR-181 familiemedlemmer, som vurderes gennem øget udtryk for miR-181 target proteiner og i forhold til H9c2 celler, der udtrykker en scramble ikke-funktionelle svamp. Derudover udvikler vi en nanovector til den systemiske levering af miR-181-svamp konstruktion af kompleksbindende positivt ladede liposomal nanopartikler og negativt ladede miR-181-svamp plasmider. In vivo billeddannelse af normal god landbrugspraksis afslører, at flere hale vene injektioner af en nanovector over en tre-ugers periode er i stand til at fremme en betydelig udtryk af miR-181-svamp i en cardio-specifikke måde. Vigtigere er, er et tab af miR-181 funktion observeret i hjertet væv, men ikke i nyrerne eller leveren. MiRNA-svamp er en kraftfuld metode til at hæmme væv-specifikke miRNA udtryk. Kørsel miRNA-svamp udtryk fra en væv-specifikke promotor giver specificitet for miRNA-hæmning, som kan være begrænset til en målrettet organ eller væv. Derudover tillader kombinerer nanovector og miRNA-svamp teknologier en effektiv levering og væv-specifikke miRNA hæmning i vivo.

Introduction

I de sidste to årtier, har der været talrige undersøgelser, der har peget på den betydningsfulde rolle miRNAs i sygdom hos mennesker. Resultater fra en stor mængde af litteratur viser de ubestridelige betydningen af miRNAs i Patofysiologi af sygdomme såsom kræft1 og hjerte-kar-sygdom2,3,4,5. For eksempel, er miR-21 upregulated i mange kræftformer, hvilket resulterer i en øget cellecyklus og celle spredning6. Hepatitis C infektion, miR-122 spiller en vigtig rolle i replikering af virus7, og det har vist sig at hæmning af miR-122 reducerer virusmængden8. Hjertehypertrofi, miR-212/132 er upregulated i hjertet og er involveret i patologisk fænotype9. Den indlysende betydning af downregulation eller funktionelle hæmning af en upregulated miRNA antyder muligheder for terapeutisk udnytter miRNA biologi i næsten alle sygdomme.

De fire miR-181 familiemedlemmer, miR-181 a/b/c/d, findes i tre genomisk steder i det menneskelige genom. Regionen intronic i et ikke-kodende RNA vært gen (MIR181A1-HG) koder klynge af miR-181-a/b-1. Regionen intronic af NR6A1-genet koder for miR-181-a/b-2. MiR-181-c/d klynge er beliggende i en uncharacterized udskrift på kromosom 19. Alle miR-181 familie medlemmer deler den samme "frø" sekvens og alle fire miR-181 familiemedlemmer kan potentielt regulere de samme mRNA mål.

Vi3,4 og andre10 har fremhævet betydningen af miR-181 familiemedlemmer under slutstadiet hjertesvigt. Vi har også anerkendt, at en miR - 181c Opregulering opstår patologiske betingelser forbundet med en øget risiko for hjertesygdom, såsom type II diabetes, fedme og aldring3,4,5. Det har været postuleret, at overekspression af miR - 181c forårsager oxidativ stress, som fører til et hjerte-dysfunktion4.

Flere grupper har foreslået at miRNA findes i mitokondrierne11,12,13,14, men vi var de første til at påvise, at miR - 181 c er afledt af det nukleare genom, forarbejdet, og efterfølgende omplantes til mitokondrier i RISC3. Desuden har vi fundet en lav udtryk af miR-181a og miR-181b i hjertet5mitokondrie rum. Vigtigere er, har vi fundet at miR - 181c undertrykker mt-COX1 mRNA udtryk, hvilket viser at miRNAs deltage i forordningen mitokondrie gen og ændre mitokondrie funktion3,4.

I denne artikel beskrives den metode, der kræves til at designe en miRNA-svamp til at vælte hele miR-181 familien i cardiomyocytes. Desuden skitsere vi en protokol for programmet på vivo af miR-181-svamp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Johns Hopkins University.

1. svamp Design

  1. MikroRNA bindende 3' UTR
    Bemærk: A miRNA funktioner gennem specifikke base parring interaktioner med delvist supplerende websteder i den 3' utranslaterede region (UTR) af dens mål mRNAs (for en omfattende gennemgang, se Bartel)15.
    1. Design hæmmere af miRNA udtryk som oligonukleotider, der indeholder betydelige komplementaritet til miRNA sekvens. Udskille en miRNA i en kompleks gennem omfattende base parring at blokere funktionen miRNA oligonukleotid.
  2. Design af en miRNA svamp
    1. Design klædt tandemly delvist supplerende miRNA sekvenser til at omfatte en bule på positionen normalt kløvet af Argonaute 2. Bule er placeret på nukleotider 9-12 af modne miRNA sekvens til at forhindre enhver RNA interferens type kavalergang og nedbrydning af svampen.
    2. Hvis det ønskes, designe lokkedue target sekvens til at binde til alle familiemedlemmer, miR-181. Efter en gennemgang og sammenligning af miR-181 familie miRNA sekvenser, finde en fælles sekvens på 5'-siden om den bule, der indeholder 8 sammenhængende nukleotider, eller finde en sekvens fælles for alle 4 miR-181 familiemedlemmer i 3'-side af bule af en yderligere 8 på hinanden følgende nukleotider. Disse 2 sekvenser repræsenterer de venstre og højre halvdel bindingssteder, henholdsvis.
      Bemærk: Lokkedue sekvens er en tandem vifte af de venstre og højre halvdel bindingssteder adskilt af en GGA spacer. Link sammen 5'-enden sekvens og 3'-side sekvens (beskrevet taktfast 1.2.2) med en GGA spacer designet til at skabe bule når udglødet til en miRNA (som beskrevet i trin 1.2.1). Gentag denne 1 miRNA bindingssted 10 x i den endelige miR-svamp konstruktion.
  3. Andre miRNA svamp overvejelser
    Bemærk: For at klone svamp sekvensen i modtagerens udtryk vektor, begrænsning nukleasen genkendelsessekvenser skal medtages i hver ende af sekvensen. En i siliciummangan fordøjelsen analyse bør bruges til at bekræfte uspecifikke kløvningen af svamp sekvens af de valgte restriktionsenzymer og andre restriktionsenzymer anvendes til downstream kloning.
    1. Tilføje en dobbelt stop codon (TAA TAA) på 5'-enden af den syntetiske 3' UTR, således at miR-181-svamp sekvens ikke er en del af den kodende sekvens for en forbedret grøn fluorescerende proteiner (EGFP).
  4. Syntese af svamp DNA for kloning
    1. Bruge en DNA synthesizer eller ansætte en kommercielt tilgængelig kilde til at syntetisere den endelige miRNA svamp sekvens med begrænsning nukleasen genkendelsessekvenser i sted for kloning. Svampen er afsendt på en plasmid, som kan indeholde valgbare markører for en forstærkning i bakterier. Yderligere, svampen kan forstærkes af en Polymerasekædereaktionen (PCR) til kloning eller simpelthen droppet ud donor vektor benytter de restriktion steder beskrevet i trin 1.3 (Se også trin 3.1).

2. kloning den modtagende vektor til at omfatte en væv-specifikke promotor

Bemærk: Brug pEGFP-C1 vektor som det modtagende vektor for udtryk kassette af miRNA svamp. PEGFP-C1 vektor indeholder en læsning ramme for en EGFP, drevet af en cytomegalovirus (CMV) promotor. CMV promotor er constitutively aktive i pattedyrsceller. Hvis der kræves en væv-specifikke promotor, kan CMV initiativtageren fjernes ved fordøjelse af AseI og NheI enzymer (Se trin 2.1). Plasmidet indeholder et omfattende flere kloning websted (MCS) samt (Kan) kanamycin og neomycin (G418) markører for et udvalg i bakterier og en stabil udtryk i pattedyrceller, henholdsvis.

  1. At fjerne CMV promoter fra pEGFP-C1
    1. Gøre 50 μL af fordøjelsen reaktion indeholdende 1 x kommercielt tilgængelige udtog buffer foreslået af fremstilling af restriktionsenzymer anvendes, 5 μg af plasmid DNA (i vand) og 5 μl af AseI og NheI enzymer. Tilføje alle komponenter til et microcentrifuge rør og forsigtigt bland dem ved at bladre det. Spin tube for 10 s i en microcentrifuge at indsamle reaktion i bunden. Inkuber reaktion i et 37 ° C vandbad i 15 min.
    2. Rense den fordøjede lineariseret plasmid. Tilføj 5 x reaktion volumen af kolonne binding buffer (en navnebeskyttet blanding af passende binding buffer til fremstilling af DNA oprensning kolonner bruges) og rense reaktion med en kolonne med DNA oprensning som beskrevet af fabrikanten. Elueres med 25 μL eluering buffer (vand) tilføjet omhyggeligt til midten af kolonnen.
    3. Gel rense den fordøjede plasmid på 0,5% agarosegel som følger: Tilsæt 5 μl for at indlæse buffer (50% glycerol-3 x lastning farvestof) til det eluted plasmid. Indlæse hele prøven i 1 godt på 0,5% agarosegel. Omfatter en separat lane med 500 ng af uslebne vektor. Kør det i 30-40 min. indtil en passende adskillelse af snit og uncut plasmider er opnået.
    4. Rense den lineariseret plasmid som følger: visualisere DNA i agarosegel på en UV lys boks. Med en ren barberblad, omhyggeligt Punktafgifter bandet svarende til den lineære plasmid.
      Bemærk: Den lineære plasmid bør køre lavere end de uslebne plasmid og vises som en enkelt band på ca. 4,2 kb. Skåret CMV initiativtageren vil fremstå som en lys band på ca. 500 nukleotider (nt).
    5. Uddrag af DNA fra gel skive ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit og elueres DNA fra kolonnen med 25 μl vand.
  2. Kloning en hjerte-specifikke promotor i pEGFP-C1
    Bemærk: Alpha-myosin heavy chain (α-MHC) selskabet har været tidligere karakteriseret og påvist direkte robust niveauer af hjertestop-begrænset udtryk som beskrevet i de følgende Molkentin, Jobe og Markham16. De næste afsnit beskriver hvordan til at forstærke promotor af vektor for kloning.
    1. Klon α-MHC promotor mellem elementer +420 til-2934 i forhold til transskription startsted til p40 plasmid16 af første designe PCR-primere, der flankerer denne region og derefter plasmidet som en skabelon til PCR. Forstærke promotor-regionen ved hjælp af PCR primere tidligere beskrevet5. Frem og bak PCR primere indeholder sekvenser af overlap i fordøjet enderne af pEGFP-C1 (trin 2.1) at tillade i Fusion instrueret kloning. Se In-Fusion manualen en omfattende forklaring af primer design for In-Fusion kloning. Primer sekvenser findes i tabel 1.
    2. Forberede en 50 μl PCR reaktion, som indeholder 1 μM af hver primer og 10 ng af DNA-template. Tilføje en passende mængde af PCR enzym og dNTP'er afhængigt af fremstilling af PCR-reagenser valgt. Udføre PCR på en standard DNA cykling blok. Udføre en 3 min 98 ° C denaturering skridt, efterfulgt af 35 cyklusser af denatureringen, udglødning og udvidelse for 5, 30 og 120 s hver, henholdsvis. Omfatte en endelige udvidelse af 10 min på 72 ° C.
    3. Rydde op i PCR og gel udvinding. Efter afslutningen af PCR cyklus, tilføje 5 x reaktion volumen af kolonne binding buffer til PCR reaktion og rense det med en kolonne med DNA oprensning som beskrevet af fabrikanten. Elueres blanding med 25 μL eluering buffer (vand) tilføjet omhyggeligt til midten af kolonnen.
      1. Tilsættes 5 μl for at indlæse buffer [50% glycerol (3 x) indlæsning farvestof] til elueret plasmid. Indlæse hele prøven i 1 godt på 1% agarosegel. Køre det for 30-40 min; visualisere og punktafgifter PCR produktet som beskrevet ovenfor (trin 2.1.5).
    4. Ligate α-MHC promotor med pEGFP-C1 som følger: tilføje 10 μL ligatur reaktion indeholdende 1 x kommercielt tilgængelige ligatur buffer, 2 μl af oprenset PCR og 1 μL lineariseret vektor. Udføre ligatur ved 50 ° C i 15 min og derefter afkøles det på is.
    5. Udføre en bakteriel transformation som følger: transfect 50 μL af kompetente celler med 2,5 μL-Fusion ligatur mix ved at tilføje komponenter. Hvile Eppendorf tube på isen i 20 min., læg dem i et 42 ° C vandbad for 40 s, og derefter placere røret på is i 2 min.
      1. Efter omdannelsen, tilføje 350 μl af SOC medier og dyrke celler ved 37 ° C i 45 min. plade 200 μl af udvækst løsning på LB plader med Kan. udføre en koloni PCR til at identificere Kan resistente celler, der indeholder α-MHC promotor ligatur.
        Bemærk: Screening primere var designet til PCR på tværs af ligatur krydset.
    6. Udvid PCR positive kloner i LB-Kan bouillon og plasmider renset ved hjælp af standard mini prep plasmid rensning protokoller, som beskrevet af fabrikanten.

3. kloning svamp

  1. Fordøje det modtagende vektor
    1. Gøre α-MHC-pEGFP plasmid lineær for kloning med EcoRI og KpnI, og rense gel som beskrevet ovenfor (trin 2.1).
  2. PCR forstærke og fordøje svamp DNA
    1. Brug af miR-181-svamp og tilsvarende 284 nt lange scramble shipping vektorer som skabelon for PCR. Forstærke svamp regionen ved hjælp af tidligere beskrevet PCR primere5. Bemærk, frem og bak PCR primere indeholde begrænsning enzym sekvenser for at tillade ligatur i α-MHC-pEGFP-C1. Udføre PCR, som beskrevet ovenfor (trin 2.2.2). Rense PCR produkter før fordøjelsen som beskrevet (trin 2.2.3) og elueret dem med vand for fordøjelsen. Primer sekvenser, se bord 1.
    2. Fordøje svamp DNA for ligatur. En 50 μL fordøjelsen reaktion indeholder 1 x udtog buffer, gel-renset PCR reaktionen fra trin 3.2.1 og 5 μl af både EcoRI og KpnI enzymer. Tilføje alle komponenter til et microcentrifuge rør og forsigtigt bland dem ved at bladre det. Spin tube for 10 s i en microcentrifuge at indsamle reaktion i bunden. Inkuber reaktion i et 37 ° C vandbad i 15 min.
    3. Rense den fordøjede PCR svamp ved hjælp af en PCR oprydning kolonne, som tidligere beskrevet (trin 2.2.1).
  3. Ligate miR-181-svamp til α-MHC-pEGFP-C1 vektor
    1. Oprette en 21 μL ligatur reaktion, som indeholder 1 x ligatur buffer, 3 μL af fordøjet og renset miR-181-svamp PCR, 1 μL lineariseret α-MHC-pEGFP-C1 vektor, 1 x DNA buffer og 1 μL af DNA ligase. Udføre ligatur ved stuetemperatur i 5 min og derefter placere den på is.
    2. Omdanne 50 μL af XL1-blå kompetente celler med 2 μl af ligatur mix. Bruge transformationen og plating protokoller, som beskrevet ovenfor (trin 2.2.5). Udføre en koloni PCR til at identificere Kan resistente bakterier, som indeholder de korrekte α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge sekvens. Design screening primere til PCR på tværs af ligatur krydset. Se tabel 1 for primer sekvenser.
    3. Forstærke og sekvens vektoren. Udvid PCR positive kloner i LB-Kan bouillon og plasmider renset ved hjælp af standard mini prep plasmid rensning protokoller. Udføre en DNA sekvens for at kontrollere plasmid udtrykker de ønskede DNA-sekvenser.

4. generation af stabile H9c2 miR-181-svamp at udtrykke celler

  1. Vækst og vedligeholdelse af H9c2 celler
    1. Kultur H9c2 celler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) der indeholder føtal bovint serum (FBS) til en slutkoncentration på 10%. Sub kultur cellerne bruger standardprotokoller og dyrke dem ved 37 ° C i 5% kuldioxid.
  2. Transfektion og udvælgelse af H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge, udtrykker celler
    1. Udføre en elektroporation af H9c2 celler for de bedste resultater. Transfect rat myoblasts (H9c2) med enten en klatre svamp (en 284 nt lange scramble sekvens, som erstatter miR-181-svamp-sekvens) eller den α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge konstruktion med en electroporator.
      1. Kort, transfect 4 x 10-5 celler med 2 μg af plasmid DNA (i 5 µL af H2O) og 100 µL af en løsning, der er kompatibelt med enheden elektroporation. Bruge en elektroporation program af DS-120 til transfect H9c2 celler.
      2. Inkuber de transfected celler i kuvette i 10 min ved stuetemperatur. Tilføje 500 µL af DMEM direkte til kuvette. Forsigtigt overføre samlede kuvette indhold til et godt af en 6-godt plade.
    2. Vælg for normal god landbrugspraksis positive celler efter 48 timer efter Transfektion af FACs. Plade kun udtryk for normal god landbrugspraksis celler ind i en 6-godt plade med tilføjelse af neomycin (G418) (400ng/mL) til komplet vækst medier.
      Bemærk: Før G418 udvalg, en kill kurve bør fastsættes til stoerrelsen af neomycin kræves for udvælgelse. Til H9c2 celler, 400 ng/mL af G418 resulterede i en cirka 80% dødelighed af ikke-plasmidet transfekteret H9c2 celler efter 24 timer og blev anset for at være den ønskede arbejde koncentration af G418 for disse celler. Cellelinie blev betragtet som stabil, efter vækst blev fastholdt i G418 for 16 dage.
    3. Udføre FACs sortering af G418 stabil celler ved hjælp af udtryk for normal god landbrugspraksis som markør for et positivt valg af svamp. Seed 5-10 celler i hvert hul i en 96-brønd plade af flow-sortering. Udvide de monoklonale celler fra 96-brønd plade til 24-godt plader over flere passager. Brug fryser bestande af celler fra passage 3 (P3) celler som udgangspunkt for efterfølgende forsøg.
    4. Udføre alle celle-linje-baserede eksperimenter med lav-passage celler mellem P5 og P10.

5. Sammenfatning og rensning af svamp-nanopartikler (miR-181-svamp nanopartikler)

  1. Forberede den liposomal nanopartikler ved at opløse kationiske amphiphile (DOTAP) og co lipider, kolesterol og DSPE-PIND-OMe, i forholdet 5:5:0.1 mM, henholdsvis i en blanding af kloroform og methanol i et hætteglas.
  2. Fjerne den organisk opløsningsmiddel på 44-45 ° C, under et vakuum ved hjælp af en rotationsfordamper, efterfulgt af en blid flow fugtfri kvælstof. Holde den resterende tørrede film af lipid under højt vakuum for 8 h.
  3. Forbered en blanding ved at tilføje 5% glukose til vakuum-tørret lipid film. Lad det natten over for at tillade denne blanding til at fugte filmen. Vortex hætteglas til 2-3 min. ved stuetemperatur for at producere multilamellar vesikler med en lejlighedsvis omrystning i en 45 ° C vandbad.
    1. Læg instrumenterne i ultralydsbad i multilamellar vesikler for at forberede små unilamellar vesikler i isbad i 3-4 min. indtil klarhed kan observeres, på en 100% intermittens og 25 W udgangseffekt.
  4. Bland enten en klatre sekvens eller en miR-181-svamp sekvens klonet i pEGFP(α-MHC) vektorer og Liposom 1:3 afgift forhold for at danne nanovector4.
    Bemærk: En elektrostatisk kompleks af positivt ladede liposomal nanopartikler og negativt ladede plasmid DNA er kendt som en nanovector.

6. systemisk levering af svamp-nanopartikler og validering af In Vivo effekter

  1. Systemisk levering af svamp-nanopartikler i rotter
    1. Bruge Sprague-Dawley (SD) rotter. Injicere rotter intravenøst med miR-181-svamp nanovector eller scramble nanovector gennem halen vene. Bruge SD mandlige rotter, som er ca. 200 g i kropsvægt.
    2. Udføre hale vene injektion ved hjælp af en dosis af 4 mg nanovector pr. kg kropsvægt og Gentag dette ved hjælp af et regime af 6 hale vene injektioner over 2 uger. Efter gentagne nanovector levering, Tillad en 1-ugers periode (dage 15-21) udtryk for vektor in vivo.
    3. Bekræfte optimeringen af imaging normal god landbrugspraksis signal før, under og efter nanovector levering. Analysere normal god landbrugspraksis signal ved tomografisk billedbehandlingsprogrammer, som genererer semi-kvantitative data.
  2. Validering af i vivo miR-181 hæmning af miR-181-svamp
    1. Udføre vestlige skamplet for at demonstrere udtryk for en funktionel miR-181-svamp i hjertet væv.
      Bemærk: For denne undersøgelse, mt-COX1 udtryk blev undersøgt.
  3. Funktionelle konsekvenser i vivo miR-181-svamp udtryk i hjertet
    1. Udføre en todimensional, M-mode og Doppler ekkokardiografi, under og efter nanovector levering til at analysere hjertefunktion og morfologiske ændringer. Til en bedre scanning kapacitet i den gnaver hjerter, bruge en ultralyd system udstyret med en 15 MHz lineær array transducer.
    2. Anæstesi kan påvirke det hjertets kontraktilitet; Derfor Udfør levering af miR-181-svamp nanovector eller scramble nanovector til dyr, der bevidst og uden nogen bedøvelsesmiddel reagens ved ekkokardiografi. Se Das, mfl. 4 for yderligere afklaring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I stabilt transfected pEGFP-miR-181-svamp-udtrykker H9c2 celler (fra trin 4.2), var udtryk for hele miR-181 familien (miR-181a, miR-181b, miR - 181c og miR - 181d) moderat nedsat i forhold til pEGFP-scrambled-udtrykker H9c2 celler. MiR-181-svamp fungerer som en kompetitiv inhibitor af familien hele miR-181, så vi forventede at målrette udtryk af miR - 181c mitokondrie gen, mt-COX1, ville stige. Western blot data tyder på, at mt-COX1 udtryk blev forøget i de pEGFP-miR-181-svamp-udtrykker H9c2 celler i forhold til de pEGFP-scramble-udtrykt H9c2 celler. Derudover blev ingen udtryk ændringer for enten mt-COX2 eller mt-COX3 opdaget via immunblot i pEGFP-miR-181-svamp-udtrykker H9c2 celler. Vi brugte α-tubulin som kontrolelementet normalisering for immunoblotting analyse. Normal god landbrugspraksis signaler blev hovedsagelig observeret i lever og nyrer op til 2 uger efter systemisk levering af miR-svamp nanovector (figur 1A). Men udtrykket normal god landbrugspraksis var betydeligt højere i hjertet væv efter 3 uger af miR-181-svamp nanovector levering (figur 1A og 1B). Af note, der var en normal god landbrugspraksis signal registreret i levervævet i nogle dyr 3 uger efter den systemiske levering; der var dog ingen funktionelle virkninger af miR-181-svamp i leveren på dette tidspunkt.

Den vestlige skamplet viste en betydelig stigning i mt-COX1 udtryk i miR-181-svamp nanovector-indsprøjtning rotter sammenlignet med scramble nanovector grupper (figur 2). Højere mt-COX1 tyder på der er en lavere miR - 181c udtryk i hjertet efter 3 uger af miR-181-svamp nanovector levering, som mt-COX1 er det direkte mål for miR - 181c. Vi brugte α-tubulin som kontrolelementet normalisering for immunoblots.

Ekkokardiografi viste ingen ændring i hjertefunktion af miR-181-svamp nanovector-indsprøjtning rotter, før, under og ved slutningen af behandlingsregime, sammenlignet med scramble nanovector gruppe af dyr.

Figure 1
Figur 1. In vivo analyse af nanovector levering af miR-181-svamp. (A) dette panel viser protokollerne optimeret 3-ugers behandling med 6 intravenøse injektioner gennem halen vene. Den gule farvelægningsmetode i epifluorescensmikroskop billedet viser udtryk for pEGFP vektor. Den maksimale intensitet af den gule farvelægningsmetode er observeret uge 3 tidspunkt. (B) α-MHC promotor sekvens i pEGFP vektor udtrykker selektivt enten miR-181-svamp eller den kodede rækkefølge i hjertet i dag 21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Validering af effekten af miR-181-svamp nanovector på miR - 181c udtryk. Det er western blot analysen af mt-COX1 udtryk i hjertet lysates fremstillet af pEGFP-scramble og pEGFP-miR-181-svamp nanovector-indsprøjtning rotter. Hele-hjerte homogeniseret var probed med de angivne antistoffer. Vi brugte α-tubulin som lastning kontrol. Band-densitometri er vist i søjlediagrammet nedenfor. Student's t-test blev udført, og standard fejlen var afbildet i søjlediagrammet som fejllinjer. p < 0,05 vs. pEGFP-scramble gruppe. n = 4.

Primer navn Sekvens TM Noter Brug Target
SAM3-1F ATGCATTAGTTATTAATGCTT
GACACACTTGACAATTTCT		 58,4 Rotte MHC initiativtageren til klon i EGFP PCR MHC promotor
SAM3-2R GACCGGTAGCGCTAGCTG
ACTCACTGGGAGATTGCTT		 59.8 Rotte MHC initiativtageren til klon i EGFP PCR MHC promotor
SAM3-3F CGAACGACCTACACCGAACT 64 Skærmen EGFP-F Koloni PCR Positive promotor kloner
SAM3-4R CGCTAGTCCTTGACCCTCTG 63,9 Skærmen MHC-Rasmussen Koloni PCR Positive promotor kloner
SAM5-1F CCTGTCTCCAACACACAAGC 59.3 Sekvens MHC promotor Sekventering MHC promotor
SAM5-2R CAGACTGCAGGGCTGGTT 60 Sekvens MHC promotor Sekventering MHC promotor

Tabel 1. Primer sekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikel beskrives design og syntese af en miRNA-svamp og demonstreret hvordan væv-specifikke udtryk af svampen er et kraftfuldt værktøj til at hæmme væv-specifikke miRNA familie udtryk.

Vi har vist, at en miR-181 familie rettet mod svamp kan klones til et udtryk plasmid med et hjerte-specifikke promotor. Plasmidet kan effektivt pakket ind i en nanovector partikel for levering både in vitro- og i vivo ved hjælp af elektroporation eller en hale vene injektion, henholdsvis (figur 1). MiR-181 svamp kan hæmme en hjerte-specifikke udtryk af miR-181 familie og kan påvirke udtryk af miR-181 target gener (figur 2). Normal god landbrugspraksis i plasmidet er en ekstra fordel, der kan visualisere levering og udtryk-profil af nanovector uden at ofre dyr.

Kort, en miRNA-svampen består af en serie af miRNA antisense sekvenser placeret efter en reporter gen at handlinger som en lokkedue miRNA målrette mRNA. Naturligt har forekommende miRNA-svampe vist sig at være endogent udtrykt i planter og dyrs celler som længe ikke-kodende RNA'er (lncRNAs)17. I den foreliggende undersøgelse, har vi udnyttet en svamp tilgang for at hæmme den hele miR-181 familie i hjertet. Selv om metoden miR-181-svamp er en fysiologisk relevante metode at nedregulere familien miR-181 i kulturperler celler, kan i vivo ansøgning af miR-181-svampe være skadelig. For eksempel, har flere undersøgelser vist en beskyttende rolle af miR-181a og miR-181b i forskellige celler/væv typer18,19,20. MiR-181-svamp udtryk bør derfor målrettes specifikt til hjertet væv.

Lille oligonukleotider har påvist for at blokere funktionen miRNA gennem udglødning til modne miRNA guide strand og forhindre en ordentlig ladning ind i RNA-induceret silencing complex (RISC). Et problem i forbindelse med denne tilgang er at oligonukleotider skulle blive leveret i en mætte dosis tilstrækkelig til at blokere cellulære puljer af modne miRNAs. Oligonukleotider lider også af udfordringer, der involverer transport over cellemembraner og en generel stabilitet af molekylet. Genialt, har det vist sig at et eksogent medfølgende miRNA mål kan fungere som en lokkedue for dens beslægtet miRNA21. I kraft af flere bindingssteder bindes sammen i et pseudo 3' UTR konstruere, decoy mål eller miRNA-svamp, er købedygtig stabilt interagere med dens mål miRNAs og udskille miRNA i microribonucleoprotein komplekser (miRNPs), således effektivt forhindrer funktionen miRNA. Den såkaldte "miRNA-svamp" er en effektiv anti-sense teknologi, som effektivt kan nedregulere miRNA både in vitro- og in vivo. Anvendelsen af en miRNA-svamp kan derfor bruges til at studere miRNA tab af funktion fænotyper.

Forestillingen om, at RNA-interferens (RNAi) kunne føre til en ny klasse af therapeutics fangede mange efterforskere snart efter dens opdagelse. Inden for anvendt RNAi therapeutics er flyttet meget hurtigt fra laboratoriet til sengen. I øjeblikket, miRNA therapeutics er en af de hurtigt voksende terapeutiske indgreb i onkologi og er i øjeblikket i fase 1 kliniske forsøg. Antisense oligonukleotider eller antagomirs, er en af de mest udbredte miRNA hæmmende tilgange. Ma et al. 22 anvendes miR-10b antagomir, både in vitro- og vivo, til tavshed upregulated miR-10b i en solid tumor.

In vivo, den effektive hæmning af upregulated miRNAs kræver en kemisk modifikation af antagomirs at forbedre bindingsaffinitet, biostability og farmakokinetiske egenskaber. For at øge duplex smeltende temperatur (Tm) og forbedre nukleasen modstanden af antagomirs, kan kemiske modifikationer udføres som 2 '-O-methyl (2 '-O-mig), 2 '-O-methoxyethyl (2 '-MOE) 2′-fluoro og bicykliske-låst nukleinsyre ( LNA)23,24,25,26,27,28,29,30,31. For en bedre effektivitet i vivo levering, kan antagomir ændres ved phosphorothioate (PS) forbindelser, som har øget nukleasen modstand28. Derudover øge PS rygraden ændringer også bindingen til plasmaproteiner reducere urin udskillelse. Således viser PS-modificerede antagomirs en betydelig forbedring af farmakokinetiske egenskaber, at lette deres systemiske levering32. Det har også vist sig at bruge peptid nukleinsyre (PNA) eller morpholino oligomerer, designet til at målrette en bestemt miRNA, kan bruges til at studere miRNA tab af funktion fænotyper33,34,35, 36 , 37 , 38 , 39. Polylysine-konjugeret og nanopartikel-kompleksbundet PNA antagomirs effektivt hæmmer miRNA fungere både i in vitro og i vivo36,37,38, 39. trods de seneste fremskridt, en effektiv og væv-specifikke levering af miRNA-derivater er fortsat en udfordring. Disse omfatter potentiale for off-target effekter, udløser medfødte immunrespons og, vigtigst, at opnå en bestemt levering i cellerne i målrettede organer/væv.

Derudover miRNA udtryk niveauer variere meget afhængigt af cellen og væv Skriv40. Derudover kan miRNA udtryk forhøjes eller nedsættes i sygdom. Konsekvensen af et ændret miRNA udtryk og indvirkning på cellulære og væv funktion med svamp-inhiberet miRNA udtryk skal være valideret og bestemt empirisk. Omfattende prækliniske undersøgelser i dyr sygdomsmodeller er nødvendige for at fastslå det optimale niveau af hæmning for en given miRNA mål.

Interessant, udstiller miR - 181c miRNA subcellulært opdelingen3,4,5. Specifikt, som forventet, er miR-181s kodet i kernen og transkriberet som lange-pri-miRNA afskrifter, som behandles i cytoplasma af terninger maskinen og indarbejdet i RISC. Men i modsætning til kanoniske miRNAs, der fungerer i cytoplasmaet, modne form af miR - 181c translocates i mitokondrierne og funktioner i reguleringen af mitokondrie-specifikke gener3. Vi har demonstreret at miR-181-svamp kan binde de modne form af miR - 181c i cytoplasmatisk fraktion, hvilket forhindrer translokation til mitokondrier. Derfor kan en opregulering af mt-COX1 observeres i mitokondrierne betingelser af en downregulation af miR - 181c udtryk.

Vi har rapporteret den metode, der kræves til at designe en miRNA-svamp til at banke ned udtryk for enhver miRNA og skitseret en protokol for programmet på vivo af miRNA-svamp. Væv-specifikke miRNA hæmning er i øjeblikket en underudviklet teknik i feltet miRNA. Betydningen af downregulation eller funktionelle hæmning af upregulated miRNAs i sygdom hos mennesker tyder på, at det kan være muligt at udnytte miRNA biologi for terapeutisk intervention.

Denne undersøgelse fremhævet en strategi for at sænke en miRNA, der med held kan anvendes i et væv-specifik måde in vivo. MiRNA-svampe udnytte antisense rækkefølgen af miRNA "frø" sekvens. Derfor, miRNA-svampe kan nedregulere alle de miRNAs, der deler samme "frø" sekvens, dvs, hele miRNA familie. I denne undersøgelse, vi har observeret en betydelig downregulation af hele miR-181-familien (miR-181a, miR-181b, miR - 181c og miR - 181d) med et udtryk af miR-181-svamp, både in vitro- og in vivo. Hvis et familiemedlem giver beskyttelse, mens et andet familiemedlem har skadelige virkninger inden for samme organ, ville ved hjælp af miRNA-svamp teknologi ikke være den ideelle fremgangsmåde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Anthony K. L. Leung Institut for biokemi og molekylær biologi, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University for hans tekniske hjælpe med at designe miR-181-svamp konstruktion. Vi takker også Polina Sysa-Shah og Kathleen Gabrielson Institut for molekylær og sammenlignende Pathobiology, Johns Hopkins Medical institutioner for deres tekniske bistand af i vivo billeddannelse leveringssted miRNA-svamp.

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH, HL39752 (til Charles Steenbergen) og af en videnskabsmand udvikling tilskud fra American Heart Association 14SDG18890049 (til Samarjit Das). Rotte cardio-specifikke promotor blev generøst leveret af Jeffery D. Molkentin på Cincinnati children's Hospital.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEGFP-C1 vector Addgene 6084-1
In-fusion Clontech 121416
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
miR-181-sponge synthesis Introgen GeneArt custome made
PCR primers Integrated DNA Technologies custome
EcoRI enzymes New Endland Biolabs R0101S
KpnI enzymes New Endland Biolabs R0142S
Rapid DNA Ligation Kit Sigma-Aldrich 11635379001
H9c2 cells ATCC CRL-1446
DMEM Media Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082139
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) Lonza VCA-1005
G418, Geneticin Thermo Fisher Scientific 11811023
FACSAria II Flow cytometer BD Bioscience 644832
Branson 450 sonifier Marshall Scientific EDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device Caliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibody Abcam ab14705
α-tubulin antibody Abcam ab7291
Sequoia C256 ultrasound system Siemens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
  2. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
  3. Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
  4. Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
  5. Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
  6. Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
  7. Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
  8. Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
  9. Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
  10. Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
  11. Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
  12. Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
  13. Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
  14. Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
  15. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  16. Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
  17. Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
  18. Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
  19. Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
  20. Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
  21. Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
  22. Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
  23. Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
  24. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  25. Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
  26. Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
  27. Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
  28. Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
  29. Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
  30. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
  31. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  32. Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
  33. Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
  34. Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
  35. Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
  36. Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2'-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
  37. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  38. Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
  39. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  40. Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).

Tags

Biologi sag 136 mikroRNA miRNA miRNA-svamp miRNA hæmning nanopartikel nanovector miR-181 hjerte mitokondrie miRNA
<em>In Vivo</em> Nanovector levering af en hjerte-specifikke MicroRNA-svamp
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kent, O. A., Steenbergen, C., Das,… More

Kent, O. A., Steenbergen, C., Das, S. In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge. J. Vis. Exp. (136), e57845, doi:10.3791/57845 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter