Sondering celle mekanik med perle-fri Optisk pincet i Drosophila Embryo
Summary
Vi præsenterer en opsætning af optiske tweezers koblet til en lys ark mikroskop, og dens gennemførelse at sonde celle mekanik uden perler i Drosophila embryo.
Abstract
Morfogenese kræver koordinering mellem genetiske mønstre og mekaniske kræfter håndfast forme celler og væv. Derfor er en udfordring at forstå morfogenetiske processer direkte måle cellulære styrker og mekaniske egenskaber i vivo under embryogenese. Vi præsenterer her, en opsætning af optiske tweezers koblet til en lys ark mikroskop, som tillader direkte anvende styrker på celle-celle kontakter af den tidlige Drosophila embryo, mens imaging med en hastighed på flere billeder per sekund. Denne teknik har den fordel, at det ikke kræver indsprøjtning af perler i embryo, normalt bruges som mellemliggende sonder som optisk styrker er udøvet. Vi detaljeret trin for trin gennemførelsen af opsætningen, og foreslå værktøjer til at udtrække mekaniske oplysninger fra forsøgene. Ved at overvåge fordrivelse af celle-celle kontakter i realtid, kan man udføre spænding målinger og undersøge celle kontaktpersoners reologi.
Introduction
Fosterudviklingen er en yderst reproducerbar proces hvor celler og væv deformere for at forme det fremtidige dyr. Disse deformationer har vist sig at kræve den aktive generation af styrker på celle niveau1,2. For at forstå morfogenetiske processer, hvorunder celler og væv ændre deres form, er det derfor nøglen til at vurdere de mekaniske egenskaber af celler involveret og måle kræfter i vævet under processen3,4 . Epitel lag, især i Drosophila, er blevet meget studeret deres kvasi-2D-geometri og deres let manipulation.
En række teknikker har således udviklet af os og andre til at vurdere epitelial mekanik i vivo under udvikling. Vi vil give et hurtigt overblik over de tre vigtigste teknikker, der anvendes i epitel væv. Laser ablation, en meget udbredt metode, giver mulighed for at afsløre den lokale mekanisk stress på celle vejkryds5,6,7,8 eller større skala9,10,11 ved at udføre lokale nedskæringer, der forstyrrer den mekaniske integritet af målet. Dynamikken i åbningen efter snittet giver oplysninger både om stress forudgående ablation og på reologi væv12,13. En ulempe ved laser ablation er, at det er invasive, da det kræver de lokale forstyrrelser af celle cortex. Derfor kan man kun udføre et begrænset antal ablations hvis man ønsker at bevare vævet intakt. En anden ulempe er, at ablations kun give relative skøn af spænding i celle kontakter, idet den indledende hastighed er afhængig af tyktflydende friktion, som ikke er kendt. Magnetiske manipulation er også blevet udviklet og anvendt i Drosophila, der involverer enten brugen af ferrofluids14 eller ultramagnetic Liposomer15. De kan give absolutte målinger16,17, men er også invasive i den forstand, at de kræver indsprøjtning af sonder på den ønskede placering. Dette kan være meget vanskelig afhængigt af systemet, som ikke altid er indstillet til præcise injektioner. En tredje teknik, fuldstændig ikke-invasiv, er kraft inferens18,19,20. Kraft inferens bygger på en antagelse om mekanisk ligevægt på triple point (tricellular vejkryds eller vertices), og gør det muligt for at udlede spændinger på alle celle-celle kontakter (og eventuelt pres i alle celler) ved at løse en invers problem. For spændinger giver hver vertex to ligninger (X og Y). Dette giver et stort system af lineære ligninger, som kan vendes på visse betingelser at vurdere spænding på alle celle kontakter. Mens denne metode er meget attraktiv, da det kun kræver en segmenteret billede og ingen ekstra eksperiment eller setup, dets nøjagtighed er endnu til at bestemme, og igen det kun indeholder relative værdier, medmindre en absolut kalibrering måling udføres.
For at overvinde nogle af disse begrænsninger, vi indfører i denne artikel en opsætning af optiske tweezers koblet til en lys ark mikroskop til at anvende kontrollerede styrker på celle skala i Drosophila melanogasterembryonale epitel. Optisk pincet har været brugt til mange biologiske applikationer herunder målinger på enkelt proteiner og manipulation af organeller og celler21. Her rapporterer vi anvendte kræfter i rækken af et par dusin pN, som er små endnu tilstrækkelig til at fremkalde lokale deformationer af celle kontakter og udføre mekaniske målinger i vivo. Vi bruger typisk vinkelrette afbøjning af celle kontakter, overvåget gennem en analyse af kymographs, skal vedrøre deformation kraft. Vigtigere, kræver vores setup ikke indsprøjtning af perler på den ønskede placering i væv, som Optisk pincet er i stand til direkte lægge kræfter på celle-celle kontakter. Kobling af den optiske pincet til en lys ark mikroskop gør det muligt at udføre hurtige imaging (flere billeder pr. sekund), som er meget mærkbar for en mekanisk analyse på kort tidsskalaer, og med reducerede fototoksicitet, siden belysningen af den prøven er begrænset til flyet i imaging22.
Samlede, Optisk pincet er en non-invasiv måde at anvende kontrollerede styrker på celle kontakter in vivo i Drosophila embryo og udtrække mekaniske oplysninger såsom stivhed og spænding i celle kontakter23, rheologiske egenskaber 24, og gradueringsfyld eller anisotropy spænding23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optisk pincet gør det muligt for at udføre absolutte mekaniske målinger direkte i det udviklende embryonale epitel i en ikke-invasiv måde. I henseende præsenterer det fordele frem for andre metoder såsom laser ablation, som er invasive og giver relativ målinger, magnetiske kræfter, som kræver injektioner, eller tvinge inferens, som bygger på stærke antagelser og også give relative målinger.
Protokollen indeholder et par kritiske trin. Først, da formålet objektivet kan vise kroma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (til P.-F.L.). Vi erkender Frankrig-BioImaging infrastruktur støttet af det franske nationale forskning agentur (ANR-10-INBS-04-01, «Investeringer for fremtiden»). Vi takker Brice Detailleur og Claude Moretti fra PICSL-FBI infrastruktur for teknisk bistand.
Materials
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
References
- Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
- Heisenberg, C. -. P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), 186-196 (2016).
- Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
- Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
- Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).
- Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
- Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
- Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
- Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Mitrossilis, D., Röper, J. -. C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883 (2017).
- Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
- Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
- Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).
- Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
- Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).
- Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
- Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
- Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
- Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).
