Summary
Ex vivo bukspottskörteln holme studier är viktiga för diabetesforskning. Befintliga tekniker för att studera odlade holmar i deras infödda 3-dimensionell arkitektur är tidskrävande, ineffektiv och används sällan. Detta arbete beskriver en ny, enkel och effektiv metod för att skapa högkvalitativa paraffin avsnitt av hela odlade holmar.
Abstract
Experiment med isolerade Langerhanska är viktiga för diabetesforskning, men holmar är dyra och begränsade överflöd. Holmar innehåller en blandad cell befolkning i en strukturerad arkitektur som påverkar funktion och mänskliga holmar är allmänt variabel i cellen typ sammansättning. Nuvarande vanliga metoder för att studera odlade holmar inkluderar molekylära studier utförs på hela holmar, bunta disparata islet celltyper tillsammans, eller mikroskopi eller molekylära studier på spridda cellöar, störa holme arkitekturen. För in-vivo studier i holme är paraffin-inbäddat bukspottkörteln snittning en kraftfull teknik för att bedöma-specifika resultat i native bukspottskörteln miljön. Studera efter kultur holmar av paraffin snittning skulle erbjuda flera fördelar: upptäckten av flera utfall på samma holmar (potentiellt även de exakta-samma holmar, använder seriell avsnitt), cell-typ-specifika mätningar och upprätthålla native Islet cell-cell och cell-underskikt interaktioner både under experimentell exponering och för analys. Dock isolerade befintliga tekniker för inbäddning Langerhanska efter kultur är ineffektiva, tidskrävande, benägna att förlust av material, och i allmänhet producera sektioner med otillräcklig holme nummer att vara användbar för att kvantifiera resultat. Klinisk patologi laboratorium för cell-block som förberedelse är otillgängliga och opraktiska för grundläggande forskningslaboratorier. Vi har utvecklat en förbättrad och förenklad bänk-metod som genererar sektioner med robust avkastning och distribution av holmar. Fast holmar är resuspended i varma histologiska agarosgel och pipetteras i en platt skiva på en vanlig glasskiva, sådan att holmarna är fördelade i ett plan. Efter standard dehydrering och inbäddning, kan flera (10 +) 4-5 µm avsnitt skäras från samma holme block. Med den här metoden kan histologiska och Immunofluorescerande analyser utföras på mus, råtta och människa holmar. Detta är en effektiv, billig, tidsbesparande metod att bedöma cell-typ-specifika, intakta arkitektur resultat från odlade holmar.
Introduction
Bukspottkörtelns Langerhanska öar, den enda källan av cirkulerande insulin, är en kritisk vävnad för utredarna studera diabetes mellitus. Från någon viss organism har holmar varierande storlek, cell typ frekvens och arkitektur1,2,3. Den konventionella strategin att studera i vivo struktur och endokrina cellen sammansättning av Langerhanska är av snittning bukspottkörteln vävnad4,5. Eftersom holmar utgör endast en liten del av totala bukspottskörteln cellulära innehåll, utförs molekylära studier på isolerade öar. Ex vivo holme kultur experiment testa svar på näringsämnen, ger gen modulering (transfection, transduktion) eller experimentella behandlingar viktig inblick mekanismer modulerande endokrina cellöverlevnad, spridning och funktion 5 , 6.
Ex vivo holme experiment analyseras ofta med molekylära studier av hela holmar eller histologiska eller molekylära studier av spridda cellöar som odlas i enskiktslager5,6. Molekylär analys av hela holmar introducerar allvarliga förbehållet blandningens celltyper, som kan ge falskt negativa eller falskt positiva resultat när extrapoleras till någon enskild celltyp. Cell spridning på coverslips för efter kultur mikroskopi kan cell-typ-specifika resultat mätning, men stör holme arkitektur, som kan förändra svar på intervention och utesluter identifiering av arkitektur-relaterade resultat. Dessutom kan generellt endast en enda resultatet mätas; exempelvis för att mäta beta cellproliferation och beta celldöd på samma villkor, behöver två separata experiment utföras. Dessa metoder är också blinda för Inter holme variabilitet, ett område av ökande intresse i fältet. Sortering cellöar av flödescytometri för cell-typ-specifika molekylära studier eller encelliga RNA studier är elegant men dyrt, tidskrävande, begränsat av vävnad överflöd, arkitektur-utrota, och inte väl lämpade för rutinmässig cell kultur analyser 5 , 7. confocal avbildning av hela-mount immunostained holmar ger hög kvalitet intakt-arkitektur data, men är arbetsintensivt, och uppgifter som erhålls från varje prov är begränsad till resultat identifieras i en enda immunfärgning8.
Förmågan att generera högkvalitativa paraffin avsnitt av efter kultur hela holmar skulle lösa många av dessa farhågor. Hög kostnad, låg-överflöd holme vävnad från unika genetiska modeller eller mänskliga organdonatorer, eller holmar status post i vivo eller in vitro- experimentell manipulation, är värdefulla. Att få flera paraffin avsnitt från samma holmarna skulle tillåta flera cell-typ-specifika, intakta arkitektur analyser från samma experiment.
Befintliga tekniker för att generera holme pellets för snittning är ofullkomliga. Histologi-optimerade agaros är en vattenlösning låg smältpunkt gel som används mycket i behandlingen av histologiska och cytologiska prover inklusive små eller fragmenterade vävnadsprover som är svåra att processen9. En holme inbäddning strategi är att upphäva holmarna i agaros i en mikrocentrifug rör, Centrifugera pellet materialet, Hämta agar kontakten, sedan bearbeta och bädda för snittning10,11. Utvinna stelnat provet från botten av röret är tidskrävande och svårt, vilket leder till tillfällig fragmentering av provet och risk för personskador. Holmarna är koncentrerade i spets i kontakten, vilket leder till otillräcklig holme distribution i sektioner som erhållits från denna metod. Den runda botten komplicerar inbäddning sådan att en holme-fattig region kan presenteras för snittning. Sammantaget leder denna metod till låg avkastning och klampade holme distribution i de resulterande avsnitten.
Denna nya metod är en förenklad och förbättrad metod för beredning av holme sektioner. Holmar koncentreras i en liten volym och sedan placeras på den släta ytan på ett objektglas att bilda en liten skiva, med kobbar och skär i ett enda plan. Histogel-Holmen skivan bearbetas därefter för paraffin inbäddning i en förkortad uttorkning och xylen infiltration protokoll. Det tidigare synsättet, som koncentrerar kobbar och skär längst ned i ett mikrofugrör, utförs också som jämförelse. Denna nya teknik förbättrar avkastningen av holmar per sektion, fördelningen av holmar i varje avsnitt, och tar kortare tid att överföra holme block till kassetter. Den här tekniken är användbar för holme biologer eller andra forskare som studerar små bitar av vävnad som vill maximera produktiv användning av en låg-överflöd vävnad genom att mäta flera utfall på ett enda prov infödda vävnad arkitektur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som involverar djur godkändes av UMass Medical School institutionella Animal Care och användning kommittén. Mänskliga holme studier bestämdes av UMass institutionella granska styrelsen inte berättigad till IRB granskning eller undantag eftersom de inte innebär användning av försökspersoner.
1. ö-isolering och kultur
- Isolera holmar och separat från att förorena exokrina och duktal vävnaden med hjälp av ditt val av metoden.
Obs: Denna metod var optimerad använder holmar isolerade av kollagenas duktal insufflation och Ficoll separation12 (gnagare) eller efter leveransen holmar från den integrerade Islet Distribution Program (IIDP13, mänskliga). Holmarna var handplockade med en P200 mikropipett. - För att optimera holme morfologi, tillåta kobbar att återhämta sig under natten i 10 mL komplett holme medium (RPMI med 10% FBS, penicillin/streptomycin och 5,5 mmol/L glukos) i en fuktig kammare som innehåller 5% CO2 vid 37 ° C. Även om detta steg inte är skyldig att inhämta sektioner, kobbar och skär är mer intakt efter en återhämtningsperiod (se figur 2).
2. holme fixering
- Använder en låg-bindande P200 spets, handplocka cirka 250 holme medel (IEQ)13 med hjälp av en kalibrerad rutnät under ett stereomikroskop i ett 1,5 mL låg bindande mikrofugrör. Låg-bindande tips och rör minska holme förlust.
- Tillåta holmar sedimentera till botten av mikrofugrör. Ta bort de flesta supernatanten med P200 Pipettera spets, utan att ta bort alla holmar.
- Tillsätt 1 mL PBS. Centrifugera röret i en svängande hink centrifug tills hastigheten når 200 x g och sedan stoppa snurrandet. Ta bort supernatanten. Upprepa PBS tvätta, för sammanlagt två tvättar.
- Tillsätt 500 µL 10% formalin lösning eller 4% nygjorda PARAFORMALDEHYD. Fixa i rumstemperatur i 30 minuter. För resultaten som testas i denna metod, var dessa fixering metoder att skilja. Kortare fixering kan också vara möjligt; Det rekommenderas att optimera fixering varaktighet för önskat resultat.
- Ta bort fixeringsvätskan med P200 spets.
- Tillsätt 1 mL PBS. Centrifugera röret tills hastigheten når 200 x g och sedan stoppa snurrandet. Ta bort supernatanten. Upprepa PBS tvätta, för sammanlagt två tvättar.
- Omedelbart gå vidare till nästa steg.
3. beredning av holme skiva (figur 1)
- Vid första användningen, smält gelen (t.ex. Histogel) vid 70 ° C och gör alikvoter i 1,5 mL microfuge rör för långtidsförvaring. Alikvotens volym är inte kritisk, eftersom alikvoter kan återanvändas.
- Värm gelen (ca 100 µL per prov) vid 70 ° C genom att placera mikrofugrör med gel alikvoten i en värme block inställd på 70 ° C.
- Överföra agaros blå pärlor (10 µL för varje prov) i ett 1,5 mL ren mikrofugrör. Grundligt resuspendera pärlorna före pipettering.
Obs: Blå pärlor blandas med holmarna att bistå i visuell identifiering av inbäddade materialet i knappen agaros och paraffin blocket. Antalet blå pärlor används är inte avgörande för resultatet, men undvika överdriven pärlor (> 5 x antalet holmar) att tillåta optimal fördelning av holmarna i sektioner. - Tvätta de blå pärlorna med 1mL PBS, två gånger. För varje tvätt, snurra pärlorna 1 min vid 800 x g. Efter den andra tvätten, Omsuspendera pärlorna i (n+ 2) x 10 µL PBS, där n är antalet provrör; till exempel för 2 provrör, skulle PBS volymen att lägga till pärlorna vara 40 µL.
- Centrifugera det mikrofugrör med holmar (kort snurra till 200 x g) och ta bort de flesta av supernatanten. Skär av spetsen på en 10 µL mikropipett spets med sax eller ett blad och tillsätt 10 µL pärlor i varje holme tube, använder en ren spets för varje prov. Blanda inte (för att undvika att förlora holmar).
- Centrifugera holmar och pärlor (kort snurra till 200 x g). Ta bort så mycket PBS som möjligt med en oklippt 10 µL mikropipett spets.
- Etikett på objektglas för identifiering av provet. Två till tre prover kan förberedas på varje bild. Placera bilden på bänken nära värme blocket med värmde gel. Skär tips av tre till fem 20 µL låg bindande mikropipett tips per prov med ett rakblad eller sax. Ladda två P20 Mikropipetter med skurna tips för att snabbt byta från ena till den andra.
- Den första mikropipett Lägg till 15-20 µL av varma gel till de holmar/pärlor mikrofugrör; Blanda genast, att undvika bubblor; och applicera flytande agar/holmar/pärlor blandningen i bilden att bilda en < 1 cm diameter skiva. Lägg i skivan nära kanten av bilden, lämnar utrymme för yttre gel ringen (nästa steg). Tryck på bilden försiktigt några gånger för att reglera kobbar och pärlor.
- Använder en andra mikropipett, tillsätt 20 µL av varma gel till provet röret. Använder den första mikropipett, mix nya gel med eventuella återstående holmar/pärlor, åter uppvärmningen i blocket värmen om det börjar stelna, applicera sedan denna blandning till bild, kring den ursprungliga skivan. Upprepa vid behov, med ytterligare färdigskurna tips, tills skivan är önskad storlek och tjocklek.
Obs: Hantering geléartad skivan är lättare om utanför ringen är något tjockare. 3 x 20 µL av gel är oftast tillräcklig. Detta steg minimerar förlust av holmar av tube tvättar och lägger holme-fattiga agaros till utsidan av skivan för att underlätta skiva hantering. - Förbereda varje skiva individuellt och hålla noggrann koll på prov beställning om att placera flera skivor på varje bild.
- Placera glasen på en plan yta av våt is, med ett omslag i 10 minuter eller tills gelen stelnar. Det är svårare att Skjut skivan utanför glaset om det torkar.
- Etiketten biopsi bearbetning/inbäddning vävnad kassetter med penna, en per prov. Torr på baksidan av bilden för att undvika vätning blåboken.
- Med hjälp av ett rakblad trubbig kant, tryck försiktigt skivan i varje riktning för att befria det från glaset. När den glider lätt, Tryck långsamt skivan från Mikroskop bilden på den blå silkespapper. Placera skivan, platta sidan nedåt, direkt på papper.
- Att hålla skivan platta, vik pappret runt skivan för att förhindra rörelser, placera skivan i vikta papper i kassett och Stäng kassett. Om skivan inte glider renlig av glaset, Lägg till mer gel eller tillbaka bilden till is för några minuter.
- Dränka kassetten i PBS i en bägare. Processen för paraffin inbäddning samma dag för optimal morfologi.
4. paraffin inbäddning
Obs: Processen holme gelen skivor till paraffinblock med hjälp av en förkortad uttorkning serie som beskrivs nedan. Denna teknik var optimerad med hjälp av en automatiserad processor, men manuell behandling bör ge liknande resultat.
- Sänk ner kassetter i 85% etanol i 15 minuter.
- Sänk ner kassetter i 95% etanol i 15 minuter.
- Sänk ner kassetter i 100% etanol i 15 minuter. Upprepa två gånger för totalt tre tvättar.
- Sänk ner kassetter i xylen i 15 minuter. Upprepa två gånger för totalt tre tvättar.
- Sänk ner kassetter i smält paraffin i 10 minuter.
- Överför kassettband till färska smält paraffin för 10-30 minuter.
- Försiktigt öppna kassetten och packa i blåboken. Ta bort skivan gel, att hålla koll på den plana ytan som motsattes till papper. Bädda in skivan i en liten mögel, med den plana (holme-innehållande) ytan ner, parallell till skärytan. För kontakten, försiktigt bort den från kassetten och bädda in den i en liten mögel med spetsen pekande mot skärytan.
5. paraffin snittning och färgning
- Märk diabilder sekventiellt om seriell avsnitt krävs.
- Har 5 µm paraffin avsnitt skär av en erfaren histotechnologist. För att maximera avkastningen, spara alla sektioner som innehåller material. Allmänhet, samla 20 sektioner kan fånga det mesta av materialet.
- Lagra sektioner vid rumstemperatur. Sektionerna är rutin histologiska fläckar (t.ex. H & E) och immunofluorescens (t.ex. insulin, glukagon och DAPI). Optimera fixering för andra antigener, om nödvändigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En illustrerad Schematisk av steg för att förbereda gel skivan visas i figur 1. Denna gel disc metod resultat i paraffin avsnitt som innehåller ett tillräckligt antal holmar som distribueras i ett enda plan att låta meningsfull kvantifieringen av resultat. Figur 2 visar låg förstoring bilder av de resulterande avsnitt för att illustrera antalet holmar fångas per sektion. I allmänhet > 35 holmar var synliga i varje avsnitt när 250 IEQ användes för förfarandet, och > 10 sektioner (4-5 µm) som innehåller holmar erhölls från varje prov. Öka antalet holmar användas för ökade antalet holmar i avsnitten. Holmarna i avsnitt var strukturellt varierande och i varierande storlekar, stödja konceptet att nya och intressanta data kan erhållas med sektioner i stället för tekniker blind för Inter holme skillnader. Metoden fungerade lika bra för gnagare holmar isolerade i laboratorium (råtta, mus) och för mänsklig holmar emot efter leverans av IIDP. Gnagare holmar hade märkbart mer intakt morfologi efter efter isolering återhämtning med övernattning i holme medium, med en mjuk rundad yta och kompakt sfärisk form (figur 2A). Mänskliga holme morfologi var liknande när inbäddade på ankomstdagen eller inbäddade efter efter sändning återhämtning under natten, kanske eftersom holmarna hade redan återhämtat sig från isolering stress före transporten. Mikrorör metoden gav en mindre vävnad tvärsnittsarea, med färre holmar per avsnitt, och tätt packade holmar och pärlor (figur 2B). Mikrorör bilderna visas i figur 2B var det bästa vi kunde få med denna metod; en av proverna hade skickas tillbaka till skära fler avsnitt eftersom ingen holmar hittades i den första uppsättningen av sektioner.
Denna teknik genererar hög kvalitet holme sektioner för histologiska och immunofluorescens färgning (figur 3). Insulin och glukagon färgning visade varierande sammansättning och heterogenitet för holme arkitekturen. Avsnitten tydligt återgetts kända arkitektur skillnader mellan människa, mus och råtta holmar, med mänskliga holmar består av rikliga α-cellerna samsas med beta-celler, medan mus och råtta holmar visade liknande arkitektur med en beta cellen kärnar ur och alfaceller i periferin. Seriell avsnitt var erhållas; panelerna i figur 3 visar seriell sektioner av samma holme färgas för H & E (vänster) och immunofluorescens (höger).
Figur 1 . Illustration av de kritiska steg för att göra skivan holme gel. Gel värmas till 70 ° C i en värme block (A) överförs till den låga bindande mikrofugrör med holme/pärla pelleten (B). Holmarna är resuspended i varma gel och överförs till en glasskiva, sprida materialet i en skiva form (C-D). Extra ren gel överförs till mikrofugrör, då alla kvarvarande material tas bort och sprida maskrad runt inledande holme pärla som innehåller/skivan i glas bilden (E-F). Efter gelbildande på is, är skivan överförda, platta sidan nedåt, till histologi papper (G), som viks och placeras i en kassett (H) för bearbetning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Paraffin avsnitt på gel-skivor innehåller ett stort antal väl distribuerade holmar. (A) låg förstoring paneler (40 X, 3 x 3 bilder sys ihop, med 15% överlappning) av mus, råtta eller mänskliga holme sektioner färgad med H & E visar att många holmar syns i varje avsnitt. Hög förstoring inläggningar (200 X) visar representativa holmar. Vänstra paneler Visa avsnitt av holmar inbäddade omedelbart efter isolering (mus, råtta) eller utleverans (mänskliga); rätt panelerna visar holmar inbäddade efter övernattning återhämtning i kultur. Blek blå cirklar ses i 40 X bilder är pärlorna ingår för visualisering under inbäddning och snittning. Dessa särskilda prover är från en C57BL/6N mus (1 år gammal) och BBDR råtta (4 veckor gamla), holmar som isolerats av duktal kollagenas injektion och Ficoll-separering och mänskliga T2D holmar fick från IIDP. (B) 250 IEQ av mänskliga holmar inbäddade per den gamla microfuge tube tekniken för jämförelse. Låg förstoring paneler (40 X; en enda unstitched bilden fångas allt material) och hög mag inläggningar (200 X) visar representativa sektioner. Odlingsmedium var RPMI med 10% FBS, penicillin/streptomycin och 5,5 mmol/L glukos. Skala barer för låg förstoring paneler är 1000 µm; skala barer för hög förstoring paneler är 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 . Representant histochemical och immunofluorescens färgning på seriell holme sektioner. Delar av mus, råtta och människa holmar inbäddade efter övernattning kultur var färgas för H & E och fotograferad av brightfield mikroskopi (200 X; vänster). En angränsande avsnitt var färgas för insulin (röd), glukagon (grön), monterad i DAPI-innehållande media (blå) och avbildas med hjälp av fluorescerande mikroskopi (200 X, höger). Skala barer: 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modifierade gel-skivbaserade inbäddning metoden ger en enkel, billig, och effektivt sätt att generera en hög avkastning av holmar per sektion. Att konstruera gel skivan på en planglas yta underlättar fördelande holmar i en jämn fördelning över ett väldefinierat område. Sprida holmarna i en platt skiva erbjuder fördelen av att placera många holmar i Plant av delar, optimera avkastningen och möjliggör färre kobbar att användas. Skivans tjocklek kan justeras för att möta utredarnas behov. Eftersom flera avsnitt kan erhållas, kan seriell sektioner av samma holmarna analyseras, öka antalet distinkta resultat som kan mätas på samma experimental prov. Även om optimerad här för Langerhanska, skulle tekniken kunna tillämpas på andra låg-överflöd material, inklusive de med små bitar, spröda karaktär eller viskösa prover som annars skulle vara svåra att bearbeta. Denna metod är optimerad för färsk-fasta holmar och har inte testats för andra typer av material, såsom tidigare frysta holmar. Dessa sektioner kan också vara användbara för i situ hybridisering analyser att upptäcka DNA eller RNA. Tillägg av extra gel tjänar två syften: att maximera holme samling och för att skydda stadens holme-rika skiva från störningar under hantering/överföring. Tunn gel skivan stelnar snabbt och låter förkortad uttorkning och xylen infiltration steg för inbäddning av paraffin. Bildar skivan på en plan yta i stället för i en sekundär behållare (microfuge tube eller kultur plattan väl) gör det lättare att fysiskt överföra skivan till kassett för bearbetning. Jämfört med skivan teknik resultaten, mikrorör tekniken hade minskat holme avkastning och klumpgranulat holme distribution, även om icke-plana vävnad arrangemanget kunde generera ett högre antal holme-innehållande sektioner.
De kritiska steg i protokollet omfatta vävnad fixering, bildandet av gel skivan, paraffin inbäddning och snittning. När det gäller fixering, som testats av H & E och immunofluorescens för insulin och glukagon, upptäcktes ingen skillnad mellan PFA och formalin eller fixering behandlingsduration från 10-30 minuter (visas inte). Dock bör fixering intensitet och varaktighet optimeras för slutanvändarens behov. Den viktigaste innovationen i detta protokoll är utarbetandet av gel holme skivan; kritiska steg sammanfattas i figur 1. Viktiga steg har med hjälp av en liten mängd gel för att koncentrera vävnad i ett litet område och bildar skivan på en plan yta att ordna vävnaden i ett enda plan för snittning. Användning av låg-bindande microfuge rör och tips och en svängande hink centrifug för alla spins förbättrar vävnad avkastning; holmar hålla sig till plast efter fixering. Tillägg av väl synlig pärlor bistår med skivan bildandet, inbäddning och snittning. Ta bort så mycket PBS som möjligt innan du lägger till gelen är avgörande för att undvika att späda Agarens, vilket leder till dålig stelning och svårigheter att överföra skivan till papperet. Hålla den tunna skivan intakt medan skjuta den från glasskiva på papperet kan vara utmanande. Om en rynka uppstår i skivan, gör det möjligt att återgå till den ursprungliga positionen, lägga till mer gel och åter chill i bilden. Med avseende på paraffinvax inbäddning är det viktigt att skivan bäddas platt-nedåt och parallellt med skärande plan. En histotechnologist som upplevt med skärande paraffin avsnitt är viktig för framgången av detta förfarande, eftersom materialet är koncentrerad på framkanten av blocket. Överdriven vänd bort av blocket kan leda till förlust av provet. Det rekommenderas att börja samla sektioner så snart de blå pärlorna är synliga.
Fixering intensitet och varaktighet bör optimeras för slutanvändarens specifika vävnad och behov. Antalet skär som används per prov kan ändras vid behov. men genererar att minska utgångsmaterial sektioner med färre holmar. Tjockare eller större skivor kan skapas med denna teknik; uttorkning och xylen infiltration steg kan behöva förlängas och bör optimeras. Om resulterande avsnitten innehåller endast en partiell skiva form, överväga möjligheten att skivan inte var inbäddade parallell till skärytan. Om för få avsnitt erhålls, kan teknikern ha förlorat material under första blocket beredning.
Metoden genererar sektioner som innehåller fasta holme vävnad och, som sådan, kan endast användas för histologiska utfall. För att få ett stort antal holmar per sektion, 200-250 IEQ användes utgångsmaterial, som är utmanande för att generera för vissa experiment. Hög kvalitet delar är beroende av att ha en erfaren histotechnologist.
Förmågan att generera 10 + sektioner som innehåller många holmar från ett enda experimentella villkor gör att kvantifiering av flera utfall på samma material, förbättra experimentell effektivitet. Rutinanalys av intakt holmar kan leda till framsteg i förståelsen i vävnad heterogenitet, inte bara på en cellulär nivå, men också på islet nivå, om vilken föga är för närvarande förstås. Tillämpa denna teknik till andra limited-överflöd vävnadsprover kan erbjuda fördelar till andra områden också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt gruppen Beta Cell biologi vid UMass Diabetes Center of Excellence för användbara råd och diskussioner. Mänskliga Langerhanska tillhandahölls av den NIDDK-finansierade integrerad Islet Distribution Program (IIDP) på City of Hope. Detta arbete finansierades av NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) och av American Diabetes Association bevilja nr 1-15-BS-003 (LCA) i samarbete med ordningen på Amarant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
References
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
- Da Silva Xavier, G.
- Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).
- Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).
- Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).
- La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).
- Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. , Available from: http://iidp.coh.org/ (2018).
