Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at studere DNA-protein interaktioner af total interne reflection Fluorescens mikroskopi (TIRFM) ved hjælp af en site-specifically modificerede λ DNA substrat og en kvante-dot mærket protein.
Abstract
Fluorescens mikroskopi har gjort store bidrag i dissekere mekanismerne af komplekse biologiske processer på enkelt-molekyle niveau. I enkelt molekyle assays for at studere DNA-protein interaktioner, der er to vigtige faktorer i betragtning: DNA substrater med nok længde til nem observation og mærkning et protein med en egnet fluorescerende sonde. 48.5 kb λ DNA er en god kandidat til DNA substrat. Quantum dots (Qdots), tillade som en klasse af fluorescerende sonder, mangeårige observation (minutter til timer) og høj kvalitet image erhvervelse. I dette papir præsenterer vi en protokol for at studere DNA-protein interaktioner på enkelt-molekyle niveau, som omfatter forbereder en site-specifically modificerede λ DNA og mærkning en target protein med streptavidin-belagt Qdots. For en proof of concept, vi vælge ORC (oprindelse anerkendelse komplekse) i spirende gær som et protein af interesse og visualisere dets interaktion med en ARS (selvstændigt replicerer sekvens) ved hjælp af TIRFM. Sammenlignet med andre fluorescerende sonder, Qdots har åbenlyse fordele i enkelt-molekyle studier på grund af dets høje stabilitet mod photobleaching, men det skal bemærkes, at denne egenskab begrænser dets anvendelse i kvantitative assays.
Introduction
Interaktioner mellem proteiner og DNA er afgørende for mange komplekse biologiske processer, såsom DNA-replikation, DNA reparation og transskription. Selv om konventionelle tilgange har kastet lys over egenskaberne af disse processer, er mange vigtige mekanismer stadig uklare. For nylig, med de rivende udvikling enkelt molekyle teknikker, nogle af mekanismerne, der har været behandlet1,2,3.
Anvendelsen af enkelt-molekyle Fluorescens mikroskopi på visualisere protein-DNA interaktioner i real-time hovedsagelig afhænger af udviklingen af fluorescens påvisning og fluorescerende sonder. For et enkelt molekyle undersøgelse er det vigtigt at mærke protein af interesse med en egnet fluorescerende sonde, da fluorescens detektionssystemer er for det meste tilgængelige kommercielt.
Fluorescerende proteiner er almindeligt anvendt i Molekylærbiologi. Men lav fluorescerende lysstyrke og stabilitet mod photobleaching begrænse dens anvendelse i mange enkelt molekyle assays. Quantum dots (Qdots) er bittesmå lysemitterende nanopartikler4. På grund af deres enestående optiske egenskaber, Qdots er 10 - 20 gange lysere og flere tusinde gange mere stabil end den udbredte organiske farvestoffer5. Qdots har desuden en stor Stokes Skift (forskel mellem placeringen af excitations- og toppe)5. Således kan Qdots bruges til lang tid observation (minutter til timer) og erhvervelse af billeder med høj signal-støj-forhold, mens de ikke kan udnyttes i de kvantitative assays.
Til dato, der er to tilgange til at mærke en target protein med Qdots site-specifically: mærkning ved hjælp af Qdot-konjugeret primære eller sekundære antistoffer6,7,8; eller mærkning target proteinet med Qdots direkte, som er baseret på stærke samspillet mellem biotin og streptavidin9,10,11,12,13. Streptavidin-belagte Qdots er kommercielt tilgængelige. I vores undersøgelse for nylig, site-specifically biotinylated proteiner i spirende gær med høj effektivitet blev renset af co-overekspression af BirA og Avi-tagged proteiner i vivo10. Af følgende og optimering af enkelt-molekyle assays14,15,16,17, observerede vi samspillet mellem Qdot-mærket proteiner og DNA på enkelt-molekyle niveau bruger TIRFM10.
Her, vi vælger en spirende gær oprindelse anerkendelse komplekse (ORC), som kan specifikt genkender og binder sig til den selvstændigt replicerer sekvens (ARS), som vores protein af interesse. Følgende protokol præsenterer en trinvis vejledning i at visualisere samspillet mellem Qdot-mærket ORC med ARS ved hjælp af TIRFM. Udarbejdelse af site-specifically modificerede DNA substratet, DNA-biotinylation, coverslip rengøring, functionalization, flow-celle forsamling og enkelt-molekyle imaging er beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af λ-ARS317 DNA substrat
- DNA substrat konstruktion og emballage
- Fordøje indfødte λ DNA ved hjælp af Xhojeg enzym; forstærke 543 bp DNA fragment indflydelse ARS317 fra spirende genomisk DNA gær ved hjælp af primere, der indeholder 20 bp homologe sekvenser af opstrøms og nedstrøms for Xhojeg enzym site på lambda DNA. Tilføj 100 ng af Xhojeg fordøjet λ DNA og 10 ng af DNA fragmentere til 10 µL af homologe rekombination reaktion system, og Inkuber reaktion ved 37 ° C i 30 min.
- Hvis pakken rekombination λ DNA, tilsæt 25 µL af lambda emballage ekstrakter til rekombination produkt, og der inkuberes reaktion ved 30 ° C til 90 min. Derefter skal du føje en ekstra 25 µL af lambda emballage uddrag ind i reaktion rør. Fortsat at udruge reaktion ved 30 ° C til 90 min.
- Tilføje 500 µL sterilt fortynding buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) ind i reaktion systemet, og bland forsigtigt ved at dreje røret på hovedet flere gange. Tilsæt 25 µL chloroform, blandes forsigtigt og opbevares ved 4 ° C.
- Tilsæt 100 µL af emballerede phage og 100 µL af bakterier LE392MP (kulturperler på 0,8 - 1,0 ved hjælp af LB medium tilføje med 10 mM MgSO4) ind i et nyt rør. Der inkuberes ved 37 ° C i 15 minutter.
- Tilføje 200 µL af phage-bakterien blanding til 4 mL oftop agar (LB medium + 0,7% agar + 10 mM MgSO4, afkøles til 48 ° C). Bland straks ved at dreje røret op og ned flere gange og hæld det på en pre varmede (37 ° C) LB tallerken.
- Inkuber plade ved 37 ° C natten over og skærmen λ-ARS317 plaque ved hjælp af PCR og sekvensering.
- DNA substrat rensning fra flydende lysates11,18
- Vælge en mindeplade i 200 µL sterilt ddH2O med 10 mM MgCl2 og 10 nM CaCl2. Bland med 200 µL af bakterier LE392MP (kulturperler overnatning i LB medium), og der inkuberes ved 37 ° C i 15 min.
- Tilføje phage-bakterien blanding i 100 mL af NZCYM (10 g/L NZ-Amin, 5 g/L gær extract, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino hydrolysat og 2 g/L MgSO4·7H2O) medium og kultur i 7 timer ved 37 ° C. Tilsæt 250 µL chloroform i kultur og ryst for en anden 10 min.
- Overføre kulturen i en 200 mL målekolbe. Tilføje 5,8 g NaCl (1 M endelige koncentration), rør til at opløse i hånden, og der inkuberes i isbad i 30 min.
- Der centrifugeres ved 12.000 x g i 10 min. ved 4 ° C for at fjerne celle debris. Indsamle supernatanten til en 200 mL målekolbe og tilføje 10% PLØK8000 (m/V). Rør til at opløse af magnetiske omrøring apparater og Ruger på is i 30 min eller længere.
- Der centrifugeres ved 12.000 x g i 10 min. ved 4 ° C at udfælde bacteriophage. Fjern supernatanten.
- Resuspend bundfaldet i 2 mL af phage fortynding buffer. Overføre det ind i en 15 mL rør og tilsæt 10 µL af RNase (endelig koncentration er 20 µg/mL) og 40 µL af DNase (endelig koncentration er 5 µg/mL). Der inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
- Der tilsættes 2 mL 0,3 M Tris-HCl (pH 9,0), 100 mM EDTA + 1,25% SDS, 15 µL proteinase K (endelig koncentration er 10 µg/mL). Der inkuberes ved 65 ° C i 10 min.
- Der tilsættes 2 mL pre afkølede kalium acetat (3 M, pH-værdi 4.8), og Inkuber i røret i isbad i 10 min.
- Der centrifugeres ved 8.000 x g i 10 min. ved 4 ° C for at fjerne de uopløselige materialer.
- Tilføje 0,7 x mængde isopropanol i supernatanten. Bland ved at vende røret op og ned flere gange, og der inkuberes i 2 min. ved stuetemperatur (RT).
- Der centrifugeres ved 8.000 x g i 10 min. ved RT at udfælde DNA. Fjern supernatanten.
- Vask DNA, når med 70% ethanol ved centrifugering ved 8.000 x g i 10 min. Fjern supernatanten.
- Elueres DNA bruge 500 µL TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) forsigtigt, og overføre DNA i 1,5 mL tube.
- Uddrag DNA to gange ved hjælp af phenol: chloroform ved centrifugering ved 8.000 g i 10 min.
- Bundfald med 0,7 x rumfangsdele isopropanol. Blandes ved at vende røret på hovedet ned forsigtigt, og der centrifugeres ved 8.000 x g i 10 min.
- Vask en gang med 70% ethanol, resuspend i 200 µL af TE. Måle DNA koncentration, og opbevares ved-20 ° C i 12,5 µg delprøver.
2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
- Til phosphorylate biotinylated oligonukleotider (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-Biotin-3') supplerer den venstre ende af indfødte λ DNA, tilføje 1 µL (100 µM) af oligonukleotider, 7,5 µL af Hedeselskabet2O, 1 µL af 10 x ligase buffer og 0,5 µL af T4 PNK. Inkuber reaktion ved 37 ° C til 3 h.
- Phosphorylate λ-ARS317 ved at tilføje 12,5 µg for λ-ARS317, 3 µL af 10 x ligase buffer, 1 µL af T4 PNK, og Hedeselskabet2O til samlede volumen af 30 µL. Inkuber reaktion ved 37 ° C til 3 h.
- For at anneal oligonukleotider med λ-ARS317, tilsæt 0,5 µL af fosforyleres oligonukleotider, 195 µL af Hedeselskabet2O, 25 µL af 10 × ligase buffer ind i fosforyleres λ-ARS317 røret. Bland forsigtigt ved at vende røret på hovedet og inkuberes ved 65 ° C i 5 min. Turn off blok varmelegeme og lad Prøven afkøles til under 33 ° C i blokken.
- For at ligate oligonukleotider med λ-ARS317, tilføje 1 µL af T4 DNA ligase og 0.63 µL af ATP (200 mM). Bland forsigtigt ved at vende røret på hovedet og inkuberes ved stuetemperatur for 2 h og 4 ° C natten over. Opbevares ved 4 ° C i 1 måned.
Bemærk: For at undgå at bryde op DNA, alle trinene blanding bør gøres ved forsigtigt at dreje røret op og ned, i stedet for blanding ved hjælp af pipetter.
3. Coverslip rengøring og Functionalization
- Coverslip rengøring
- Sted 20 coverslips i 4 farvning krukker (5 coverslips/jar), Læg instrumenterne i ultralydsbad i 30 minutter i ethanol, og skyl coverslips med laves H2O 3 gange.
- Læg instrumenterne i ultralydsbad i 30 minutter med 1 M kaliumhydroxid (KOH) og skyl coverslips med laves H2O 3 gange. Gentag ethanol og KOH sonikering én gang.
- Læg instrumenterne i ultralydsbad med acetone i 30 minutter og skyl derefter grundigt med laves H2O (mindst 3 gange).
Bemærk: Acetone skal fjernes omhyggeligt ved at skylle med laves H2O, fordi det kan forårsage en eksplosion, når organisk opløsningsmiddel (f.eks. acetone) blandet med piranha løsning fejlagtigt14. - Opstille coverslips i piranha løsning (3:1 blanding af H2SO4 og 30% H2O2) og inkuberes ved 95 ° C i 1 time.
Bemærk: Piranha løsning er meget energisk og erosive, så brug med forsigtighed. Når du forbereder piranha løsning, tilsættes 50 mL H2O2 først i en 500 mL glas bægerglas, og derefter tilføje 150 mL H2så4 langsomt i bægerglasset. - Skyl coverslips med laves H2O 5 gange. Derefter vask hver coverslip med laves H2O grundigt ved hjælp af 3 bægre fyldt med laves H2O, og tør coverslip ved hjælp af papir fra kanten af coverslip. Placere coverslip i farvning krukken og tør coverslip grundigt i en 110 ° C ovn i 30 minutter.
- Skyl coverslip med methanol og Placer farvning krukken ind i 110 ° C ovnen igen til at tørre coverslip grundigt.
Bemærk: Tørring af coverslip grundigt er meget vigtigt, fordi APTES vil have masser af mulige overfladen strukturer, når det er i tilstedeværelse af vand19.
- Skyl coverslip med methanol og Placer farvning krukken ind i 110 ° C ovnen igen til at tørre coverslip grundigt.
- Coverslip functionalization
- Tilsættes 70 mL silan (93% methanol, 5% eddikesyre og 2% APTES) i hver krukke, Skru hætten og forlader krukke ved rumtemperatur natten over.
- Vask og tør coverslips, som beskrevet i trin 3.1.5, bortset fra kemisk coverslips grundigt ved hjælp af nitrogen gas i stedet for at placere dem i ovnen.
- Opløses 150 mg af mPEG (methoxy-polyethylen glycol) og 6 mg biotin-PEG (biotin-polyethylen glycol) i 1 mL af 0,1 M frisk-lavede NaHCO3 (pH 8,2) grundigt. Derefter centrifugeres på 17, 000 x g i 1 min. at fjerne uopløselige pløkker.
Bemærk: Frisklavet NaHCO3 er klar; der er ingen grund til at justere dens pH-værdi. - Placer TOT silaniseret coverslips i kasser, og sætte to små coverslips på toppen af to ender af TOT silaniseret coverslips. Der afpipetteres 100 µL af PIND løsning på midten af TOT silaniseret coverslip, og placere en anden tot silaniseret coverslip på toppen.
- Tilføje nogle ultrarent H2O i boksen for at holde det fugtigt, og der inkuberes coverslips med PIND løsning i mindst 3 timer i mørke. En natten inkubation kan arbejde så godt.
- Adskille coverslip par og holde functionalized overflade ansigt, skyl coverslips bruger ultrarent H2O omfattende, og tør dem med nitrogen gas.
- Markere den functionalized side af coverslips på et af hjørnerne ved hjælp af en tusch, holde den functionalized side opad, placere dem i kasser og gemme felterne i vacuum-ekssikkator til 1 måned.
- Placere en coverslip i en 50 mL tube boret med et hul på fælles landbrugspolitik, for at gemme coverslips i længere tid, så lægge røret i en plasticpose, og Forsegl posen ved hjælp af en vakuum sealer. På denne måde, kan coverslips opbevares ved-20 ° C ca. 3 måneder.
4. flow celle forsamling
- Skær en 15 mm × 2 mm kanal på midten af et stykke dobbeltsidet tape (30 mm × 12 mm) med en puncher.
- Skrælle papir siden af den dobbeltklæbende tape og indsætte det på glas dias med to huller. Tryk for at fjerne luftbobler. Baseret på vores erfaring, er det nemmere at fjerne luftbobler ved skrælning off papir side end plastik side af den dobbeltklæbende tape.
- Skær en functionalized coverslip (60 mm × 24 mm) i fire stykker (30 mm × 12 mm) ved hjælp af en diamant spids glas skriver, og fjerne resterne med nitrogen gas. Husk at holde den functionalized side opad.
- Skrælle den plast side af den dobbeltklæbende tape, og indsætte dias på den functionalized coverslip. Tryk forsigtigt for at fjerne luftbobler mellem coverslip og båndet. At fjerne luftbobler grundigt kan beskytte cellen flow fra utætte mens buffere blev pumpet ind i den.
- Indsætte indløb og outlet rør i små og store huller, henholdsvis. Fastgør slangen ved hjælp af epoxy.
- Pumpe 20 µL af streptavidin (0,2 mg/mL) i flow celle ved hjælp af en sprøjte manuelt og inkuberes ved RT i 10 min. Derefter pumpe blokerende buffer10 i flow celle til at erstatte streptavidin, og opbevare det ved stuetemperatur.
5. enkelt molekyle visualisering
- Opnå den fokale justering af rød og far-red med A5 på fluorescens mikroskop test slide #1 af samtidige excitation ved hjælp af en 532 nm laser og en 640 nm laser. Producere dobbelt bølgelængde billeder med opdeling optik (Se Tabel af materialer).
- Placere cellen flow på mikroskopet og forbinde sin outlet rør til en længere slange tilslutning med en 10 mL foråret installeret på en automatiseret infusion/tilbagetrækning programmerbare pumpe.
Bemærk: Pumpe buffere i cellen flow nedennævnte betyder tilbagetrækning buffere fra fjorden slangen af cellen flow til at sprøjte. - Pumpe blokerende buffer på 500 µL/min i cellen flow til at fjerne luft hurtigt og sikre, at buffer i cellen flow er blokeret. Derefter pumpe det blokerende buffer på 200 µL/min i cellen flow og flip outlet slangen for at fjerne luftbobler fra inlet-slangen og flow-celle grundigt.
Bemærk: Alle buffere pumpes ind i cellen flow bør være afgasses i et vakuum ekssikkator i mindst 15 minutter før brug. - Tilsæt 0,5 µL af biotinylated λ-ARS317 DNA i 80 µL blokerende buffer, og pumpe det ind i cellen flow 25 µL/min. for 2 min. Derefter skylle λ-ARS317 DNA ved hjælp af 200 µL blokerende buffer med en hastighed på 50 µL/min.
- Pumpe 200 µL af bindende buffer10 med en hastighed på 50 µL/min til at fjerne den blokerende buffer i cellen flow.
- Tilføje 0.2 µL af streptavidin-belagte Qdot705 (1 µM) og 0,2 µL af biotinylated ORC (1,2 µM) ind i et rør, og der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. Derefter tilsættes 20 µL af bindende buffer ind i røret, og placere den på is. Den endelige koncentration af ORC-Qdot705 er omkring 10 nM.
- Tilføj 2 µL af ORC-Qdot705 (10 nM), 1 µL af DTT (100 mM), 1 µL af ATP (200 mM) i 96 µL af binding buffer. Den endelige koncentration af ORC-Qdot705 er 0,2 nM.
- Pumpe 20 µL af 0,2 nM ORC-Qdot705 med en sats på 10 µL/min i cellen flow. Skylle ud af overdreven ORC-Qdot705 bruger 200 µL af binding buffer til en rentefod på 100 µL/min. Derefter pumpe binding buffer med 30 nM SYTOX Orange i cellen flow at plette DNA substrater med en hastighed på 100 µL/min.
- Excite ORC-Qdot705 signal og SYTOX Orange farvede DNA signal med en 405 nm laser og 532 nm laser, hhv. Iagttage signalerne samtidig med 100 µL/min. flow ved hjælp af en Quad-band bandpass filter (FF01-446/510/581/703-25) og optage billeder af EM-CCD med 100 ms pr. ramme. Indsamle 20 billedstakke fra forskellige felter.
6. dataanalyse
- Beskær billederne ved hjælp af Fiji software med et nyt plugin, som er ændret af os baseret på billedet plugin (OI_cut_RGBmerge) udviklet af Dr. Ron Vale's lab ved University of California, San Francisco.
- Beskære en stak billeder (512 × 512 pixel) i to stakke af billeder (256 × 256 pixels). En er en 532 nm laser spændende resultat, og den anden er en 405 nm laser spændende resultat.
- Behandle 61 sekventielle billeder ved hjælp af Fiji-billede-stakke-Z projekt (gennemsnitlig intensitet).
- Mål længden af DNA (LDNA) og afstanden fra webstedet af ORC-Qdot705 (Lork) bindende på DNA til DNAS tøjret ende manuelt.
- Beregne resultatet af LORC/lDNA ved hjælp af excel, analysere data ved hjælp af metoden bootstrap af R, derefter oprette histogrammet og passe Gaussisk distributioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at visualisere samspillet mellem Qdot-mærket ORC og ARS, opbygget vi først λ-ARS317 DNA substrat. En DNA-fragment, indeholdende ARS317 blev integreret i Xhosite jeg (33,5 kb) af indfødte λ DNA af homologe rekombination (figur 1A). Rekombination produktet blev pakket ved hjælp af ekstrakter og pakkede phage partikler blev kulturperler på LB plader (figur 1B). Positive phage plaque blev screenet ved PCR og bekræftet af sekventering (figur 1 c). Λ-ARS317 DNA blev renset fra den flydende lysates (figur 1 d).
Enkelt-molekyle imaging assays blev udført på mål-type TIRFM set-up (figur 2). Ved mærkning biotinylated ORC med forholdet næsten 1:1 molar streptavidin-belagte Qdots hurtigt, Qdot-mærket ORC blev pumpet ind i cellen λ-ARS317 tøjret flow. DNA var plettet, ved hjælp af SYTOX Orange. Signalerne fra Qdot-mærket ork og SYTOX-Orange-farvede DNA blev afbildet samtidigt ved hjælp af TIRFM (figur 3A-3 C). For at fastlægge fordelingen af ORC på λ-ARS317, imaging stakken var opdelt i to stakke: en stak af DNA signal og andre stakken af ORC signal som beskrevet i trin 6.1 (figur 3B). Baseret på formel, Position (kb) = (L/lorkDNA) × 50 kb (figur 3D), 273 bindende positioner af ORC-Qdot705 molekyler på 168 DNA substrater var kvantitativt analyseret. Data viste, at ORC-Qdot705 specielt binder på ARS317 indsat site med en naturligvis høj overflod (figur 3) . I mellemtiden, ORC-Qdot705 også binder på ATT-rige områder ligger i midten og den frie ende af λ DNA, som er i overensstemmelse med resultaterne af den tidligere undersøgelse10.
Høj kvalitet image erhvervelse afhænger det molære forholdet mellem protein og Qdots i den mærkning assay. Overdreven Qdots kan være godt for protein mærkning effektivitet, men de kan skabe baggrundsstøj. Som vist i figur 4, mens mærkning biotinylated ORC med streptavidin-belagte Qdots på 1:3 molære forhold, øget baggrundsstøjen. Det er således afgørende for at vælge den passende molære forhold af biotinylated proteiner til streptavidin-belagt Qdots.
Figur 1: forberedelse af λ-ARS317 DNA substrat. (A) Illustration af λ-ARS317 konstruktion. En DNA-fragment, der er forsynet med ARS317 blev integreret i λ DNA af homologe rekombination. (B) Plaques på LB fast medium. Tre af dem blev markeret ved hjælp af sorte pile. (C) mindepladen λ-ARS317 blev identificeret ved hjælp af PCR. (venstre) Markør, (i midten) native λ DNA, (højre) en plade af λ-ARS317. (D) renset λ-ARS317 DNA var opdaget af 0,6% Agarosen gelelektroforese. (venstre) Markør, (i midten) native λ DNA (højre) renset λ-ARS317. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk oversigt over mål-type JOHANNAS og flow celle. Enkelt molekyle imaging assays blev gennemført baseret på TIRFM kombinere med flow celle systemet. Vores TIRFM blev udført på en inverteret mikroskop udstyret med en 60 X olieobjektiv (numerisk blænde = 1,49). DNA (grå linje) var tøjret på coverslip i cellen flow gennem tilknytningen af biotin-streptavidin og strækkes ved flow fra venstre mod højre. Et protein binding på tøjret DNA blev anført af en rød oval dot. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Qdot705-mærket ORC (1:1 molar ratio) bindende for λ-ARS317. (A) ORC og λ-ARS317 DNA blev observeret samtidigt. (top) SYTOX Orange farvede DNA var ophidset ved hjælp af en 532 nm laser og observeret ved hjælp af 550-613 nm transmission band af quad-band sporgruppe-pass filter. (nederst) Qdot705-mærket ORC var glade ved hjælp af en 405 nm laser og observeret ved hjælp af 663-743 nm transmission band af quad-band sporgruppe-pass filter. (B) to 256 × 256 sub stakke blev beskåret fra den oprindelige 512 × 512 stak. (C) billederne anskaffes ved hjælp af 61 sekventielle rammer i de tilsvarende stakke. (venstre) SYTOX Orange farvede DNA, (i midten) Qdot705-mærket ORC, (højre) flettede billede; tre Qdot705-mærket ORC bindende på ARS317 websted på λ-ARS317 DNA substrater blev markeret ved hjælp af sorte pile. (D) Illustration af beregningen af ORC bindende stilling på DNA. LDNA betyder DNA længde, Lork betyder afstanden fra ORC bindende site på DNA i tøjret slutningen af DNA. (E) Histogram af ORC bindende distribution på λ-ARS317 DNA. Gaussisk passer til dataene, der blev angivet ved hjælp af den røde streg. Fejllinjer angiver et 95% konfidensinterval baseret på 1000 bootstrap prøver. N svarer til antallet af ORC molekyler. ARS317 indsatte hjemmeside blev angivet ved hjælp af en sort pil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Qdot-mærket ORC bindende (3:1 molar ratio) for λ-ARS317. ORC og λ-ARS317 DNA blev observeret på samme måde som i figur 3A. (venstre) SYTOX Orange farvede DNA var ophidset ved hjælp af en 532 nm laser. (i midten) Qdot-mærket ORC var ophidset ved hjælp af en 405 nm laser. (højre) fusionerede billeder. To Qdot-mærket ORC bindende på ARS317 websted på λ-ARS317 DNA substrater blev markeret ved hjælp af sorte pile. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer her, en protokol for at observere samspillet mellem den Qdot-mærket protein og site-specifically modificeret λ DNA ved hjælp af TIRFM i en flow-celle. De nødvendige skridt omfatter lokationsspecifikke ændring af DNA substrat, DNA biotinylation, coverslip rengøring og functionalization, flow-celle forberedelse og enkelt-molekyle billeddannelse. Der er to centrale punkter, der bør bemærkes. Første, alle trinene involveret med λ DNA skal manipuleres forsigtigt for at mindske eventuelle skader, f.eks., at undgå blanding af pipettering op og ned flere gange. For det andet er det meget vigtigt at sikre, at coverslip er rent nok til at minimere dens baggrundsstøj. Under coverslip rengøring- og functionalization, vandet skal nå ultrarent niveau, og luften skal være støvfri. Det er bedre at udføre coverslip functionalization og flow-celle forsamling på en ren bænk.
I enkelt molekyle assays til at undersøge protein-DNA interaktion, er λ DNA et passende underlag med flere fordele20. Λ DNA er længe nok til at være let observeret og tillade optagelse protein bevægelse på det i et enkelt molekyle eksperiment. Desuden tillade ssDNA udhæng mange designs for tøjring λ DNA på et glas coverslip. I denne undersøgelse præsenterer vi en metode for at indsætte en eksogen DNA-fragment på en bestemt lokalitet af λ DNA. Således kan forskellige bruger-definerbare DNA fragmenter integreres i λ DNA. Modificerede λ DNA kan være bekvemt renset fra flydende lysates i store mængder til enkelt-molekyle studier.
Det er vanskeligt at vurdere den mærkning effektivitet præcist i den streptavidin-belagte Qdot mærkning assay, fordi der er ca 5-10 streptavidins pr. Qdot nanocrystal. Derfor, passende kindtand forholdet mellem streptavidin-belagte Qdots og biotinylated proteiner bør optimeres i eksperimenter. Forholdet 1:1 molar kan være en reference.
Det skal bemærkes, at Qdot ikke kan bruges i præcis kvantitativ assays, da dens høje foto-stabilitet er uegnet til den foto-blegning assay. Selvom Qdots høj stabilitet begrænser dets anvendelse i de kvantitative analyser, det giver mulighed for nem observation og lang tid tracking5. Med stigende programmer enkelt-molekyle Fluorescens mikroskopi i biologi, protokollen beskrevet i denne hvidbog vil bidrage væsentligt til optrevling mekanismer af DNA metabolisme i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Hasan Yardimci og Dr.Sevim Yardimci af Francis Crick Institut for art hjælpe i enkelt-molekyle eksperimenter, Dr. Daniel Duzdevich fra Dr. Eric C. Greene's lab ved Columbia University, Dr. Yujie Sun af Peking University og Dr. Chunlai Chen fra Tsinghua University for nyttig drøftelse. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China 31371264, 31401059, CAS tværfaglig Innovation Team og den Newton avanceret Fellowship (NA140085) fra Royal Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S.
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
