Summary
Her presenterer vi en protokoll for å studere DNA-protein interaksjoner av total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM) bruker en site-specifically endret λ DNA substrat og en kvante-prikk merket protein.
Abstract
Fluorescens mikroskopi har gjort store bidrag i dissekere mekanismer for komplekse biologiske prosesser på ett molekyl nivå. I ett molekyl analyser for å studere DNA-protein interaksjoner, finnes det to viktige faktorer for vurdering: DNA underlaget med nok lang for enkel observasjon og merking et protein med en egnet fluorescerende sonde. 48.5 kb λ DNA er en god kandidat for DNA underlaget. Kvante prikker (Qdots), tillate som en klasse med fluorescerende sonder, mangeårige observasjon (minutter timer) og høy kvalitet bilde. I dette papiret presenterer vi en protokoll for å studere DNA-protein interaksjoner på enkelt-molekylet nivå, som inkluderer forbereder en site-specifically endret λ DNA og merking et mål protein med streptavidin-belagt Qdots. En konseptbeviskode vi velger ORC (opprinnelse gjenkjennelse komplekse) i spirende gjær som et protein av interesse og visualisere dets interaksjon med en ARS (selvstendig etterligner sekvens) ved hjelp av TIRFM. Sammenlignet med andre fluorescerende sonder, Qdots har åpenbare fordeler i ett molekyl studier på grunn av dens høy stabilitet mot photobleaching, men det bør bemerkes at denne egenskapen begrenser anvendelsen i kvantitative analyser.
Introduction
Samspillet mellom protein og DNA er avgjørende for mange komplekse biologiske prosesser, som utryddelse, DNA-reparasjon og transkripsjon. Selv om konvensjonelle metoder har kaste lys over egenskapene til disse prosessene, er mange viktige mekanismer fortsatt uklart. Nylig, med rask utvikling enkelt molekyl teknikker, noen de har vært adressert1,2,3.
Anvendelsen av enkelt-molekylet fluorescens mikroskopi på å synliggjøre protein-DNA interaksjoner i sanntid hovedsakelig avhenger av utviklingen av fluorescens gjenkjenning og fluorescerende sonder. For en enkelt molekyl studie er det viktig å merke protein rundt med en egnet fluorescerende sonde siden fluorescens oppdagingssystemer er mest tilgjengelig kommersielt.
Fluorescerende proteiner brukes ofte i molekylærbiologi. Imidlertid begrenser lite lysstoffrør lysstyrken og stabilitet mot photobleaching anvendelsen i mange ett molekyl analyser. Kvante prikker (Qdots) er små lys-emitting nanopartikler4. Deres unike optiske egenskaper, Qdots er 10 - 20 ganger lysere og flere tusen ganger mer stabilt enn de brukte organisk fargestoffer5. Videre har Qdots en stor Stokes Skift (forskjellen mellom plasseringen av eksitasjon og utslipp topper)5. Qdots kan dermed brukes til mangeårige observasjon (minutter timer) og anskaffelse av bilder med høy signal-til-støy-forhold, mens de ikke kan brukes i kvantitative analyser.
Dato det er to tilnærminger til å merke et mål protein med Qdots site-specifically: merking ved hjelp av Qdot-konjugerte primær eller sekundær antistoffer6,7,8; eller merking målet protein med Qdots direkte, som er basert på den sterke vekselvirkningen mellom biotin og streptavidin9,10,11,12,13. Streptavidin-belagt Qdots er kommersielt tilgjengelig. I vår siste undersøkelse, site-specifically biotinylated proteiner i spirende gjær med høy effektivitet renset ved co-overuttrykte BirA og Avi-merket proteiner i vivo10. Følgende og optimalisere de single-molekyl analyser14,15,16,17, observerte vi samspillet mellom Qdot-merket proteiner og DNA på ett molekyl nivå ved TIRFM10.
Her, vi velger spirende gjær opprinnelse-anerkjennelse komplekse (ORC), som kan spesielt gjenkjenner og binder til selvstendig etterligner sekvensen (ARS), som vår protein av interesse. Følgende protokollen presenterer en fremgangsmåte å visualisere samspillet av Qdot-merket ORC Ars bruker TIRFM. Utarbeidelse av site-specifically endret DNA underlaget, DNA-biotinylation, dekkglassvæske rengjøring og functionalization, samlingen flyt-celle og enkelt-molekylet avbilding er beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av λ-ARS317 DNA substrat
- DNA substrat bygg og emballasje
- Fordøye innfødt λ DNA ved å bruke Xhojeg enzym; forsterke 543 bp DNA fragment betydning ARS317 fra genomisk DNA av spirende gjær bruker primer som inneholder 20 bp homologe sekvenser av oppstrøms og nedstrøms Xhojeg enzym område på lambda DNA. Legg 100 ng av Xhojeg fordøyd λ DNA og 10 ng DNA fragment til 10 µL av homologe rekombinasjon reaksjonssystemet og ruge reaksjonen på 37 ° C i 30 min.
- Hvis du vil pakke rekombinasjon λ DNA, legger 25 µL av lambda emballasje ekstrakter i rekombinasjon produktet og ruge reaksjonen på 30 ° C i 90 min. Deretter legge til en ekstra 25 µL av lambda emballasje ekstrakter inn i reaksjon røret. Fortsette å ruge reaksjonen på 30 ° C i 90 min.
- Legg til 500 µL av sterile fortynning buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) i reaksjonssystemet, og bland forsiktig ved å slå røret opp ned flere ganger. Legge til 25 µL av kloroform, bland forsiktig og lagre på 4 ° C.
- Legge til 100 µL av pakket phage og 100 µL av bakterier LE392MP (kultivert på 0,8 - 1.0 ved hjelp av LB medium legge med 10 mM MgSO4) inn i et nytt rør. Ruge på 37 ° C i 15 minutter.
- Legge til 200 µL av phage-bakterie blanding i 4 mL oftop agar (LB medium + 0,7% agar + 10 mM MgSO4, avkjølt 48 ° c). Bland umiddelbart ved å slå røret opp ned flere ganger og helle den på en forvarmes (37 ° C) LB tallerken.
- Inkuber platen på 37 ° C over natten og skjermen λ ARS317 plakk bruker PCR og sekvensering.
- DNA substrat rensing flytende lysates11,18
- Velg en plakett i 200 µL av sterile ddH2O med 10 mM MgCl2 og 10 nM CaCl2. Bland med 200 µL av bakterier LE392MP (kultivert overnatting i LB medium), og ruge på 37 ° C i 15 min.
- Legg phage-bakterie blandingen i 100 mL NZCYM (10 g/L NZ-Amin, 5 finans gjær ekstrakt, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino hydrolyse og 2 g/L MgSO4·7H2O) medium og kultur for 7 h på 37 ° C. Legge til 250 µL av kloroform i kulturen og riste for en annen 10 min.
- Overføre kulturen i en 200 mL kolbe. Legge til 5,8 g av NaCl (1 M siste konsentrasjon), røre for å oppløse for hånd og ruge på is 30 min.
- Sentrifuge 12.000 x g i 10 min på 4 ° C fjerne celle rusk. Samle nedbryting i en 200 mL kolbe og legge 10% pinne8000 (m/V). Rør for å oppløse av magnetiske gripende apparater og ruge på isen i 30 minutter eller lenger.
- Sentrifuge 12.000 x g i 10 min på 4 ° C til å fremkalle bacteriophage. Fjerne nedbryting.
- Resuspend bunnfall i 2 mL phage fortynning bufferen. Overføre den til en 15 mL tube og legge 10 µL av RNase (siste konsentrasjon er 20 µg/mL) og 40 µL av DNase (siste konsentrasjon er 5 µg/mL). Ruge på 37 ° C i 30 min.
- Legge til 2 mL 0,3 M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + 1,25% SDS, 15 µL proteinasen K (siste konsentrasjonen er 10 µg/mL). Inkuber ved 65 ° C i 10 min.
- Legg 2 mL av pre-avkjølt kalium acetate (3 M, pH 4.8), og ruge røret på is 10 min.
- Sentrifuge 8000 x g i 10 min på 4 ° C fjerne uløselig materialer.
- Legge til 0,7 x antall isopropanol i nedbryting. Bland ved å slå røret opp ned flere ganger, og ruge i 2 minutter ved romtemperatur (RT).
- Sentrifuge 8000 x g i 10 min på RT å utløse DNA. Fjerne nedbryting.
- Vask DNA når med 70% etanol med sentrifugering 8000 x g for 10 min. fjerne nedbryting.
- Elute DNA bruker 500 µL TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) forsiktig, og overføre DNA til 1,5 mL tube.
- Ekstra DNA to ganger med fenol: kloroform med sentrifugering 8000 g i 10 min.
- Utløse med 0,7 x volum isopropanol. Bland ved å slå røret opp ned forsiktig og sentrifuge 8000 x g i 10 min.
- Vask en gang med 70% etanol, resuspend i 200 µL av TE. Måle DNA konsentrasjonen og lagre på 20 ° C i 12.5 µg dele.
2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
- Til phosphorylate biotinylated oligonucleotides (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-Biotin-3 ") utfyllende til venstre ende av innfødte λ DNA, Legg 1 µL (100 µM) oligonucleotides, 7,5 µL av ddH2O, 1 µL av 10 x ligase buffer og 0,5 µL av T4 PNK. Inkuber reaksjonen på 37 ° C 3 h.
- Phosphorylate λ-ARS317, legge til 12,5 µg av λ-ARS317, 3 µL av 10 x ligase buffer, 1 µL av T4 PNK og ddH2O til totale volumet av 30 µL. ruge reaksjonen på 37 ° C 3 h.
- For å anneal oligonucleotides med λ-ARS317, Legg 0,5 µL av fosforylert oligonucleotides, 195 µL ddH2O, 25 µL av 10 × ligase buffer i røret fosforylert λ-ARS317. Bland forsiktig ved å slå røret opp ned og ruge ved 65 ° C i 5 min. tur utenfor blokken varmeapparatet og la utvalg kult å under 33 ° C i blokk.
- For å ligate oligonucleotides med λ-ARS317, Legg 1 µL av T4 DNA ligase og 0.63 µL ATP (200 mM). Bland forsiktig ved å slå røret opp ned og ruge ved romtemperatur for 2t eller 4 ° C over natten. Lagre på 4 ° C for 1 måned.
Merk: For å unngå å bryte opp DNA, alle blande trinnene bør gjøres ved å dreie forsiktig røret opp ned, i stedet for å blande bruker pipetter.
3. dekkglassvæske rengjøring og Functionalization
- Dekkglassvæske rengjøring
- Sted 20 coverslips i 4 flekker krukker (5 coverslips/jar), sonicate i 30 minutter i etanol, og skyll coverslips med ultrapure H2O 3 ganger.
- Sonicate i 30 minutter med 1 M kaliumhydroksid (KOH), og skyll coverslips med ultrapure H2O 3 ganger. Gjenta etanol og KOH sonication en gang.
- Sonicate med aceton i 30 minutter, og skyll med ultrapure H2O grundig (minst 3 ganger).
Merk: Aceton må fjerne grundig skylling med ultrapure H2O, fordi det kan forårsake en eksplosjon når organisk løsemiddel (for eksempel aceton) blandet med piranha løsningen feilaktig14. - Legg til coverslips i piranha løsning (3:1 blanding av H2SO4 og 30% H2O2) og Inkuber ved 95 ° C i 1 time.
Merk: Piranha løsningen er svært energiske og erosive, så bruk med forsiktighet. Når du forbereder piranha løsning, legge 50 mL av H2O2 først i et 500 mL glass beaker, og deretter legge 150 mL av H2så4 sakte i begeret. - Skyll coverslips med ultrapure H2O 5 ganger. Deretter vaske hver dekkglassvæske med ultrapure H2O grundig med 3 kanner fylt med ultrapure H2O og tørr dekkglassvæske bruke papir fra kanten av dekkglassvæske. Sted i dekkglassvæske i flekker glasset og tørre dekkglassvæske grundig i 110 ° C ovn i 30 minutter.
- Skyll dekkglassvæske med metanol og plassere flekker glasset i 110 ° C ovnen igjen å tørke dekkglassvæske godt.
Merk: Tørke dekkglassvæske grundig er svært viktig, fordi APTES har massevis av mulig overflate strukturer når den er i nærvær av vann19.
- Skyll dekkglassvæske med metanol og plassere flekker glasset i 110 ° C ovnen igjen å tørke dekkglassvæske godt.
- Dekkglassvæske functionalization
- Legge til 70 mL silane løsning (93% metanol, 5% eddiksyre og 2% APTES) i hver jar, skru korken og la glasset i romtemperatur over natten.
- Vask og tørk coverslips som beskrevet i trinn 3.1.5, bortsett fra tørr coverslips grundig med nitrogen gass i stedet for å plassere dem i ovnen.
- Oppløses 150 mg av mPEG (metoksy-polyetylenglykol) og 6 mg biotin-pinne (biotin-polyetylenglykol) i 1 mL av 0.1 M fersk-laget NaHCO3 (pH 8.2) grundig. Deretter sentrifuge 17, 000 x g for 1 min fjerne uløselig pinnene.
Merk: Nystekte NaHCO3 er klare; Det er ikke nødvendig å justere sine pH. - Plasser silanized coverslips i boksene, og satt to små coverslips på to endene av silanized coverslips. Pipetter 100 µL av PEG løsning på midten av silanized dekkglassvæske, og plassere en annen silanized dekkglassvæske på toppen.
- Legg noen ultrapure H2O i for å holde det fuktig, og ruge coverslips med PEG løsning for minst 3 h i mørket. En overnatting inkubasjon kan arbeide også.
- Skille dekkglassvæske parene og følge functionalized overflaten ansiktet, skyll coverslips bruker ultrapure H2O omfattende og tørk dem med nitrogen gass.
- Merk den functionalized siden av coverslips på et av hjørnene bruke markør penn, holde functionalized siden vendt opp, plassere dem i bokser og lagre boksene i vakuum desiccator for 1 måned.
- For å lagre coverslips i lengre tid, plassere en dekkglassvæske i en 50 mL tube boret med ett hull på sin lua, så legge røret i en plastpose, og forsegl posen med et vakuum forsegler. På denne måten kan coverslips lagres på 20 ° C om 3 måneder.
4. flyt celle montering
- Skjær en 15 mm × 2 mm kanal i sentrum av et stykke dobbeltsidig tape (30 mm × 12 mm) bruker et puncher.
- Løsner papir siden av dobbeltsidig tape og lim den på objektglass med to hull. Trykk for å fjerne luftbobler. Basert på vår erfaring, er det lettere å fjerne luftbobler ved peeling av papir siden enn plast siden av dobbeltsidig tape.
- Skjær et functionalized dekkglassvæske (60 mm × 24 mm) i fire biter (30 mm × 12 mm) bruke en diamant-tipped glass skriftlærde, og fjerne rusk bruker nitrogen gass. Husk å holde den functionalized siden møter.
- Løsner plast siden av dobbeltsidig tape, og lim lysbildet på den functionalized dekkglassvæske. Trykk forsiktig for å fjerne luftbobler mellom dekkglassvæske og båndet. Fjerne luftbobler grundig kan beskytte flyt cellen lekker mens buffere ble pumpet inn i den.
- Sett innløp og utløp rør inn små og store hull, henholdsvis. Fastsette slangen med epoxy.
- Pumpe 20 µL av streptavidin (0,2 mg/mL) i flyt cellen med en sprøyte manuelt og ruge på RT i 10 min. Deretter pumpe blokkerer buffer10 i flyt cellen for å erstatte streptavidin og holde det ved romtemperatur.
5. ett molekyl visualisering
- Få fokus justering av rødt og langt rødt med A5 lysbildets fluorescens mikroskop test #1 ved samtidige eksitasjon bruker en 532 nm laser og en 640 nm laser. Produsere doble bølgelengde bilder med deling optikk (se Tabell for materiale).
- Plasser flyt cellen på mikroskopet og koble sin stikkontakt rør til en lengre slange koble med 10 mL våren installert på en automatisert infusjon/uttak programmerbare pumpe.
Merk: Pumping buffere i flyt cellen nevnt nedenfor betyr uttak buffere fra innløpet slangen flyt cellen til sprøyten. - Pumpe blokkerer buffer på 500 µL/min i flyt cellen å fjerne luft raskt og sikre at bufferen i flyt cellen er avblokkert. Deretter pumpe blokkerer bufferen på 200 µL/min inn i flyten cellen og vende stikkontakt slangen for å fjerne luftbobler fra innløpet slangen og flyt cellen grundig.
Merk: Alle buffere pumpes inn i flyten cellen skal være degassed i et vakuum desiccator i minst 15 minutter før bruk. - Legg til 0,5 µL av biotinylated λ-ARS317 DNA i 80 µL blokkerer bufferen, og pumpe det inn i flyten cellen i 25 µL/min i 2 minutter. Deretter skylle λ-ARS317 DNA bruker 200 µL blokkerer bufferen med en hastighet på 50 µL/min.
- Pumpe 200 µL av bindende buffer10 med en hastighet på 50 µL/min fjerne blokkering bufferen i flyt-cellen.
- Legge til 0,2 µL av streptavidin-belagt Qdot705 (1 µM) og 0,2 µL av biotinylated ORC (1,2 µM) inn i et rør, og Inkuber ved romtemperatur for 5 min. Deretter legger 20 µL av bindende buffer inn i røret, og plassere den på is. Siste konsentrasjonen av ORC-Qdot705 er ca 10 nM.
- Legge til 2 µL av ORC-Qdot705 (10 nM), 1 µL av DTT (100 mM), 1 µL ATP (200 mM) i 96 µL bindende bufferen. Siste konsentrasjonen av ORC-Qdot705 er 0,2 nM.
- Pumpe 20 µL av 0,2 nM ORC-Qdot705 frekvensen av 10 µL/min i flyt cellen. Tømme av overdreven ORC-Qdot705 bruker 200 µL bindende bufferen ved hastighet på 100 µL/min. Pumpe bindende buffer med 30 nM SYTOX oransje i flyt cellen stain DNA underlag med en hastighet på 100 µL/min.
- Opphisse ORC-Qdot705 signalet og SYTOX oransje flekker DNA signalet med en 405 nm laser og 532 nm laser, henholdsvis. Observere signalene samtidig med 100 µL/min flyt med en Quad-band båndpassfilter (FF01-446/510/581/703-25) og registrere bildene av EM-CCD med 100 ms per bilde. Samle 20 bildestakker fra ulike felt.
6. dataanalyse
- Beskjære bildene ved hjelp av Fiji programvare med en ny plugin, som endres av oss basert på bildet plugin (OI_cut_RGBmerge) utviklet av Dr. Ron Vale lab ved University of California, San Francisco.
- Beskjære en bunke med bilder (512 × 512 piksler) i to stabler av bilder (256 × 256 piksler). En er en 532 nm laser spennende resultat, og den andre er en 405 nm laser spennende resultater.
- Behandle 61 sekvensielle bilder bruker Fiji-Image-stabler-Z-prosjektet (gjennomsnittlig intensitet).
- Måle lengden på DNA (LDNA) og avstanden fra webområdet ORC-Qdot705 (LORC) bindingen på DNA til DNAS bundet slutten manuelt.
- Beregne resultatet av LORC/LDNA ved hjelp av excel, analysere dataene ved hjelp av bootstrap metoden av R, og deretter opprette histogrammet og passer Gaussian distribusjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å visualisere samspillet mellom Qdot-merket ORC og ARS, bygget vi første λ-ARS317 DNA underlaget. En DNA fragment som inneholder ARS317 ble integrert i Xhojeg området (33,5 kb) native λ DNA av homologe rekombinasjon (figur 1A). Rekombinasjon produktet ble pakket bruker ekstrakter og pakket phage partikler ble kultivert på LB plater (figur 1B). En positiv phage plakett ble vist av PCR og bekreftet av sekvensering (figur 1 c). Λ-ARS317 DNA var renset fra den flytende lysates (figur 1 d).
Single-molekylet tenkelig analyser ble utført på mål-type TIRFM oppsett (figur 2). Ved merking biotinylated ORC med molar forholdet nesten 1:1 streptavidin-belagt Qdots raskt, Qdot-merket ORC ble pumpet inn i λ-ARS317 bundet flyt cellen. DNA ble farget bruke SYTOX oransje. Signalene fra Qdot-merket ORC og SYTOX-Orange-farget DNA ble fotografert samtidig med TIRFM (figur 3A-3 C). For å fastslå fordelingen av ORC på λ-ARS317, bildebehandling stabelen var delt inn i to stabler: en bunke med DNA signal og andre papirbunken ORC signal som beskrevet i trinn 6.1 (figur 3B). Basert på formelen, posisjon (kb) = (LORC/LDNA) × 50 kb (figur 3D), 273 bindende posisjoner ORC-Qdot705 molekyler på 168 DNA underlag var quantitively analysert. Dataene viser at ORC-Qdot705 spesielt binder på ARS317 settes inn på engelsk med en selvfølgelig høy overflod (figur 3E) . I mellomtiden binder ORC-Qdot705 også på AT-rike områder i midten og gratis slutten av λ DNA, som er i samsvar med resultatene av tidligere studier10.
Høy kvalitet oppkjøpet avhenger av molar forholdet mellom protein og Qdots i merking analysen. Overdreven Qdots kan være bra for protein merking effektivitet, men de kan lage bakgrunnsstøy. Som vist i Figur 4, mens merking biotinylated ORC med streptavidin-belagt Qdots på 1:3 molar forholdet, økt bakgrunnsstøy. Derfor er det viktig å velge riktig molar forholdet mellom biotinylated proteiner til streptavidin-belagt Qdots.
Figur 1: klargjøring av λ-ARS317 DNA substrat. (A) illustrasjon av λ-ARS317. Et DNA fragment bærer ARS317 var integrert i λ DNA av homologe rekombinasjon. (B) plaketter på LB solid medium. Tre av dem ble merket med svarte piler. (C) en λ-ARS317 plakett ble identifisert bruker PCR. (venstre) Markør, (midten) native λ DNA, (høyre) en plakett av λ-ARS317. (D) Purified λ-ARS317 DNA ble oppdaget av 0,6% agarose gel geleelektroforese. (venstre) Markør, (midten) native λ DNA (høyre) renset λ-ARS317. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk oversikt over mål-type TIRF og flyt cellen. Ett molekyl tenkelig analyser ble utført basert på TIRFM kombinere med flyt cellen systemet. Våre TIRFM ble utført på en invertert mikroskop med en 60 X oljeobjektiv (numerisk blenderåpning = 1,49). DNA (grå linje) var bundet på dekkglassvæske i flyt cellen gjennom biotin-streptavidin sammenhengen, og strukket av strømmen fra venstre til høyre. En protein binding på bundet DNA ble angitt med en rød-oval prikk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Qdot705-merket ORC (1:1 molar ratio) bindende λ-ARS317. (A) ORC og λ-ARS317 DNA ble observert samtidig. (øverst) SYTOX oransje flekker DNA var glade bruker en 532 nm laser og observert med 550-613 nm overføring båndet kvadrant-bånd bånd-pass filter. (nederst) Qdot705-merket ORC var spent med en 405 nm laser og observert med 663-743 nm overføring båndet kvadrant-bånd bånd-pass filter. (B) to 256 × 256 sub stabler ble beskåret fra opprinnelige 512 × 512 stakken. (C) bilder anskaffes ved hjelp av 61 sekvensiell rammer i de tilsvarende bunkene. (venstre) SYTOX oransje flekker DNA, (midten) Qdot705-merket ORC, (høyre) sammenslåtte bildet; tre Qdot705-merket ORC bindende på ARS317 nettsted på λ-ARS317 DNA underlag ble merket med svarte piler. (D) illustrasjon av beregningen av ORC bindende posisjon på DNA. LDNA betyr DNA lengden, LORC betyr avstanden fra ORC bindende område på DNA til bundet slutten av DNA. (E) Histogram av ORC bindende distribusjon på λ-ARS317 DNA. Gaussian passer til dataene ble angitt ved hjelp av den røde heltrukne linjen. Feilfelt viser et 95% konfidensintervall basert på 1000 bootstrap prøver. N betyr antallet ORC molekyler. ARS317 satt inn området ble angitt med en svart pil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Qdot-merket ORC bindende (3:1 molar ratio) for λ-ARS317. ORC og λ-ARS317 DNA ble observert på samme måte som i figur 3A. (venstre) SYTOX oransje flekker DNA var glade bruke en 532 nm laser. (midten) Qdot-merket ORC var glade med en 405 nm laser. (høyre) flettede bilder. To Qdot-merket ORC bindende på ARS317 nettsted på λ-ARS317 DNA underlag ble merket med svarte piler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en protokoll for å observere samspillet mellom Qdot-merket protein og site-specifically endret λ DNA ved hjelp av TIRFM i en flyt-celle. Fremgangsmåten er områdespesifikke endring av DNA substrat, DNA biotinylation, dekkglassvæske rengjøring og functionalization, flyt-celle forberedelse og enkelt-molekylet bildebehandling. Det er to viktige punkter som bør bemerkes. Først alle trinnene involvert med λ DNA skal manipuleres forsiktig for å redusere mulig skade, f.eksunngå blanding av pipettering opp og ned flere ganger. Det andre, er det svært viktig å sikre at dekkglassvæske er rent nok til å redusere sine bakgrunnsstøyen. Under dekkglassvæske rengjøring og functionalization, vann bør nå ultrapure nivå, og luften skal støvfritt. Det er bedre å utføre den dekkglassvæske functionalization og flyt-celle montering på en ren benk.
I ett molekyl analyser for å studere protein-DNA samhandling, er λ DNA en passende underlaget med flere fordeler20. Λ DNA er lenge nok til å lett observeres og tillate registrering protein bevegelse på det i et eneste molekyl eksperiment. Videre tillate ssDNA overheng mange design tethering λ DNA på et glass dekkglassvæske. I denne studien presenterer vi en metode for å sette inn et eksogene DNA-fragment på et bestemt område av λ DNA. Ulike brukerdefinerbare DNA fragmenter kan derfor integreres i λ DNA. Endret λ DNA kan bli praktisk renset fra flytende lysates i store mengder for ett molekyl studier.
Det er vanskelig å vurdere merking effektiviteten nøyaktig i streptavidin-belagt Qdot merking analysen fordi det er ca 5-10 streptavidins per Qdot nanocrystal. Derfor skal riktig molar forholdet mellom streptavidin-belagt Qdots og biotinylated proteiner være optimalisert i forsøkene. 1:1 molar forholdet kan være en referanse.
Det bør bemerkes at Qdot ikke kan brukes i nøyaktig kvantitative analyser siden dens høy bilde-stabilitet er uegnet for foto-bleking analysen. Selv om høy stabilitet Qdots begrenser anvendelsen i de kvantitative analyser, innrømmer den lett observasjon og lang tid sporing5. Med økende anvendelser av enkelt-molekylet fluorescens mikroskopi i biologi, protokoll beskrevet i dette dokumentet vil sterkt bidra til unraveling mekanismer for DNA stoffskiftet i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Hasan Yardimci og Dr.Sevim Yardimci av Francis Crick Institute for type i enkelt-molekylet eksperimentene, Dr. Daniel Duzdevich fra Dr. Eric C. Greenes lab ved Columbia University, Dr. Yujie Sun Peking University og Dr. Chunlai Chen hos Tsinghuauniversitetet for nyttig diskusjon. Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China 31371264, 31401059, CAS tverrfaglig innovasjon Team og Newton avansert brorskapet (NA140085) fra Royal Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S.
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
