Summary
El objetivo de esta técnica es preparar una cultura altamente enriquecida de primarias motoneuronas (MNs) de murine de la médula espinal. Para evaluar las consecuencias de las mutaciones que causan enfermedades de MN, Describimos aquí el aislamiento de estos aislados MNs y su transfección por magnetofection.
Abstract
Neurodegeneración de espinales motoneuronas (MNs) está implicada en un amplio espectro de los trastornos neurológicos como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, atrofia muscular, que son asociados con atrofia muscular. Cultivos primarios de MNs espinales se han utilizado extensamente para demostrar la implicación de genes específicos en este tipo de enfermedades y caracterizar las consecuencias celulares de sus mutaciones. Esta cultura de modelos un MN primaria protocolo deriva de la obra seminal de Henderson y colegas hace más de veinte años. En primer lugar, detalle un método de disección de los cuernos anteriores de la médula espinal de un embrión de ratón y aislar el MNs de los vecinos las células utilizando un gradiente de densidad. A continuación, presentamos una nueva forma de transferencia eficiente MNs con plásmidos de expresión utilizando magnetofection. Finalmente, ilustramos cómo solucionar y immunostain primaria que mns mediante mutaciones de neurofilamentos que causan la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo 2, este protocolo muestra un enfoque cualitativo a la expresión de proteínas de interés y estudiar su participación en MN el crecimiento, mantenimiento y supervivencia.
Introduction
Enfermedades neuromusculares abarcan una gran variedad de patologías clínicamente y genéticamente distintos que se caracterizan por la alteración del músculo o del sistema nervioso. Debido a los avances en tecnologías de secuenciación, se han identificado cientos de genes responsables de estas enfermedades raras durante la última década (lista disponible en el centro de enfermedad Neuromuscular, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). La variedad de mutaciones identificadas indica que diferentes mutaciones en un solo gen pueden producir diferentes fenotipos y enfermedades1,2,3 y que las mutaciones en distintos genes pueden producir fenotipos similares 4 , 5. en este contexto, hay esfuerzos para el desarrollo de modelos celulares que pueden convertirse en poderosas herramientas para el análisis de las consecuencias de la mutación y mecanismos patológicos.
MNs espinales tienen grandes somas en los cuernos ventrales de la médula espinal, axones largos forma a las fibras de músculo esqueléticas y permitir movimientos voluntarios a través de la liberación de acetilcolina en uniones neuromusculares. Desde MNs están afectados por enfermedades neuromusculares como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT), y la atrofia muscular espinal, Dr. Henderson y colegas desarrollaron el primer protocolo6 que permitió para el cultivo de in vitro espinales MNs y el descubrimiento de neurotrophic del factor GDNF7 (factor neurotrófico derivado de células gliales). Ajustes técnicos desde entonces han permitido la purificación más precisa de MNs espinales y sus subtipos utilizando FACS8y enriquecimiento por gradiente de densidad sigue siendo potente y ampliamente utilizado en laboratorios trabajando con MNs espinales primarias 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. posteriormente, también es posible obtener un mayor grado de purificación de MN a través de immunopanning tomando ventaja del marcador superficial p75(NTR)15,16,17.
La médula espinal contiene diferentes subtipos de MNs cervicales, torácicas y lumbares, así como columnas motor medianas y lateral que difieren según su ubicación en el cuerno anterior en un eje dorsoventral y entre los blancos inervan8, 18. las culturas MN primaria pueden recuperar todos estos subtipos de MN en proporciones fisiológicas. La principal limitación de esta técnica es el bajo número de MNs obtenidos al final del procedimiento. de hecho, puede esperarse obtener alrededor de 105 MNs de seis embriones, que es conveniente para microscopía pero limitante para experimentos de bioquímica. Para llevar a cabo experimentos con subtipos más estandarizados y MNs abundante (> 106 células), embrionario MNs derivados de la célula de vástago deben ser considerados18.
Transfección de transgenes salvaje-tipo/mutante o precipitación genes endógenos en MNs primarias es una herramienta rápida y útil para descifrar las vías fisiopatológicas, especialmente cuando no están disponibles modelos de ratón. Magnetofection es una técnica de transferencia primaria las neuronas, similares a lipofection sin la neurotoxicidad relacionada. Además, transfección puede realizarse en neuronas maduras, después de varios días en vitro, a diferencia de técnicas de electroporación9. Sin embargo, una desventaja de esta técnica es que los granos unen los ácidos nucleicos en la cultura, causando ruido en el etiquetado de DAPI. Infección viral es probablemente la técnica más eficaz para transfectar MNs; sin embargo, magnetofection no requiere de ciertos procedimientos de seguridad necesarios para la producción viral y la infección celular.
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Protocol
Todos los procedimientos que involucran animales fueron aceptados por el Comité de ética de la institución.
1. preparación de la solución
- Preparar 10 mL de BSA dializaron en medio L-15 el 4%.
- Albúmina de suero bovino en polvo al 4% (w/v) se disuelven en 10 mL de medio de L-15.
- Añadir la solución en una casete de diálisis 20 mL con corte 20 kDa. Dializan contra 500 mL de medio de L-15 durante 3 días en agitación a 4 ° C. Cambiar el medio L-15 cada día.
- Filtrar la solución a través de 0,22 μm membrana y Alicuotar en tubos de 15 mL. Almacenar los tubos a-20 ° C.
Nota: Este protocolo usa las siguientes referencias: medio de L-15 raw sin modificar = L-15 medio, ácido L-15 = pH L-15 y medio de L-15 base = L-15 bicarbonato.
- Preparar 200 mL de pH L-15.
- Ajustar el pH del medio L-15: en primer lugar, llenar una botella de lavado con algunos pedazos de hielo seco. Inyectar gas (CO2) en el medio de L-15 hasta que el color vuelve naranja (~ presiones pH 6.4 y ~ 40). El pH puede ajustarse también con un medidor de pH estándar.
- Filtrar el medio a través de un 0,22 μm membrana y almacenar a 4 ° C durante un mes.
- Preparar 100 mL de bicarbonato L-15.
- Añadir 2,5 mL de bicarbonato de sodio 7% a 97,5 mL de medio de L-15 y almacenar a 4 ° C.
- Preparar los suplementos de IPCS (insulina Putrescin Conalbumin selenita).
- Disolver 2,5 mg de insulina de 0,5 mL de 0.1 M HCl. agregar 4,5 mL de agua destilada doble.
- Disolver 8 mg de putrescina en 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Disolver 100 mg de conalbumin en 10 mL de PBS.
- Disolver 1 mg de selenito de sodio en 19,3 mL de agua, ajustar el pH a 7.4 y la solución diluida 10 veces.
- Mezclar 1 mL de solución de insulina, 1 mL de solución de putrescina, 1 mL de conalbumin y 0,1 mL de solución de selenito de sodio para obtener 3,1 mL de solución de suplemento de IPCS. La solución a-20 ° C.
- Preparar una solución de 0,02 mM progesterona.
- Disolver 1 mg de progesterona en 1,6 mL de etanol al 80%.
- Diluir la solución 100-fold en 100% de etanol y almacenar a-20 ° C.
- Preparar 100 mL de medio completo L-15.
- Agregue 1.8 mL de D-glucosa solución 200 mg/mL a 92 mL de pH L-15 para obtener una concentración final de 3,5 mg/mL glucosa.
- Combinar 1 mL de 100 x penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL), 2 mL de suero de caballo inactivado con calor, 3,1 mL de mezcla IPCS y 0,1 mL de solución de progesterona (2 x 10-5 M).
- Filtrar el medio de una membrana de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C.
- Preparar 5 mL de solución de gradiente de densidad (concentración final de 5,5%) por experimento.
- Añadir 476 μl del medio de gradiente de densidad 60% comercial a 4524 μl de L-15 (si es posible, sin rojo fenol para aumentar el contraste visual en la interfase; relación de dilución de 1:10. 5).
- Almacenar la solución a 4 ° C durante 2 semanas o congelar a-20 ° C.
- Preparar 10 mL de medio de cultivo.
- Añadir 200 μL de medio de suplemento a 9,6 mL de medio de cultivo celular de la neurona.
- Añadir 200 μL de suero de caballo inactivado con calor (que tiende a distinguir trabajos contra la proliferación y precursores de células gliales) en 25 μl de glutamina y 10 μl de 2-Mercaptoetanol.
- Filtro de los medios de comunicación a través de un filtro de 0,22 μm.
- Agregar los siguientes factores neurotróficos: factor neurotrófico ciliar (CNTF) a una concentración final de 10 ng/mL y el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) y el factor neurotrópico derivado de células gliales (GDNF) en concentraciones finales de 1 ng/mL.
- Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C.
- Preparar 50 mL de medio de disección.
- Añadir 2.25 mL de glucosa (200 mg/mL) a 47,05 mL de HBSS. Añadir 700 μl de 1 M HEPES con pH 7,4. Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C.
- Preparar una solución PFA 4%.
- Disolver 20 g de PFA en 500 mL de PBS.
- Debajo de una campana química, calentar la solución a 60 ° C y añadir unas gotas de 1 M NaOH hasta que la solución sea clara.
- La solución a través de un filtro de papel del filtro y ajustar el pH a 7.2. Almacenar a-20 ° C.
Nota: Alternativamente, otras soluciones comerciales de PFA pueden ser utilizados y diluidos al 4% en PBS.
- Limpiar las herramientas de disección como el fórceps, tijeras y silicona platos con etanol al 70% antes de su uso y con jabón y agua limpia después del uso.
2. poly-ornitina/laminina (Po/L) plato capa
Nota: Volúmenes están adaptados para cubrir una placa de 24 pozos.
- Si es necesario, poner un cubreobjetos estéril 12 m m en el pozo.
- Cubrir los pocillos con 500 μl de solución de μg/mL Poly-L-ornitina 10 disuelto en agua.
- Que los pozos reposar 1 h a temperatura ambiente.
- Retirar la solución de la polivinílico-L-ornitina y deje secar al aire durante 30 minutos.
- Cubrir los pocillos durante la noche a 37 ° C con 500 μl de 3 μg/mL laminina en bicarbonato L-15.
Nota: Pozos pueden almacenarse a 37 ° C por 7 días en la incubadora. Para incubaciones largas, añadir PBS estéril entre los pocillos puede ayudar a evitar la evaporación media.
3. disección
- Sacrificar un ratón embarazado cuando los embriones están en fase embrionaria E12.5. Limpiar el vientre con etanol al 70%.
- El útero cortando los dos oviductos y la vagina y colocarlos en una placa de Petri con PBS frío (sin Ca2 + Mg2 +).
- Recoger todos los embriones y transferirlos al fresco, PBS frío (sin Ca2 + Mg2 +) en una placa Petri.
- Poner un embrión en un plato cubierto con silicona y lleno de medios de disección (con HBSS, glucosa de 4.5 g/L y 7 mM HEPES pH 7.4).
Nota: Disección de embriones se realiza bajo el microscopio utilizando tijeras y pinzas limpias bien. Alternativamente, puede utilizarse un plato de Petri regular sin silicona para disección. - Quitar la cabeza, cola y vísceras, con unas pinzas como tijeras.
- Mantener el embrión con el vientre contra la silicona con el fórceps.
- Con un segundo par de pinzas, inserte uno de los consejos en el canal central de la médula espinal rostral.
- Cerrar las pinzas para romper el tejido dorsal unos milímetros.
- Repetir esta operación hacia el lado caudal hasta la médula espinal entera (figura 1B).
- Separar la parte rostral de la médula espinal (tronco cerebral) del cuerpo.
- Gire el embrión para mantener la médula espinal abierta contra la silicona.
- Pellizque la parte rostral de la médula espinal y tirando la cabeza para extraer la médula espinal del embrión.
Nota: Meninges y ganglios de raíz dorsal (GRD) deben permanecer pegados al embrión. De lo contrario, cuidadosamente separe cualquier resto de meninges y GRD todavía unido a la médula espinal. En este paso, GRD también se recaudaban para cultura sensible neurona (ver discusión). - Aplanar la médula espinal en la silicona y sacar la mitad dorsal de la médula por el corte a lo largo de cada lado con un bisturí. Corte la parte media en 10 trozos con un bisturí y transferir las piezas a un tubo nuevo.
4. médula espinal células suspensión
- Repita este procedimiento de disección en médulas espinales de 6 a 8.
- Que la médula espinal recoge en la parte inferior del tubo y reemplazar la HBSS con 1 mL de medio de jamón-F10.
- Añadir 10 μl de la tripsina (2.5% p/v; 0.025% de concentración final). Incubar los tubos durante 10 min a 37 ° C.
- Para detener la digestión enzimática, transferencia de los fragmentos a un nuevo tubo de 15 mL que contiene 800 μl de medio completo L-15, 100 μl de 4% (w/v) BSA y 100 μl de DNasa (1 mg/mL en medio L-15).
- Triturate aspirando dos veces 1 mL con una pipeta P1000. Que los fragmentos reposar 2 minutos recoger el sobrenadante en un nuevo tubo 15 mL.
- A los fragmentos, agregar 900 μl de medio completo L-15, 100 μl de 4% (w/v) BSA y 100 μl de DNasa (1 mg/mL en medio L-15).
- Triturate 6 veces aspirando 1 mL con una pipeta P1000. Que los fragmentos reposar 2 minutos añadir el sobrenadante en el tubo de 15 mL obtenido en el paso 4.5.
- A los fragmentos, agregar 900 μl de medio completo L-15, 100 μl de 4% (w/v) BSA y 100 μl de DNasa (1 mg/mL en medio L-15).
- Triturate 10 veces por aspirar 1 mL con una pipeta P1000. Que los fragmentos reposar 2 minutos añadir el sobrenadante en el tubo de 15 mL obtenido en el paso 4.5. Proceder con el sobrenadante.
- Utilizando una pipeta P1000, Coloque suavemente un cojín de 4% (w/v) 2 mL BSA en la parte inferior del tubo flotante. Centrifugue a 470 x g durante 5 minutos.
- Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células con 2 mL de medio completo L-15.
5. MN enriquecimiento por gradiente de densidad
- La suspensión de células se dividió en dos tubos de 15 mL (1 mL). Luego, agregar 2 mL de medio completo L-15. Si a partir de 6 embriones, utilizar el equivalente de 3 embriones por tubo en 3 mL de medio.
- Añadir 2 mL de solución de gradiente de densidad agregando lentamente la solución a la parte inferior de cada tubo para obtener una interfaz de sharp.
- Centrifugue a 830 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Después de este paso, pequeñas células deben ser en la parte inferior del tubo, que conviene células grandes como MNs en la interfaz de media solución gradiente de densidad.
- Recoger las células en la interfase por aspiración 1 o 2 mL y transferir a un nuevo tubo 15 mL. Ajustar el volumen a 10 mL con medio de pH L-15.
- Añadir 2 mL de la almohadilla de BSA de 4% a los fondos del tubo y centrifugar a 470 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 3 mL de medio completo L-15.
- Repita el paso 5.5.
- Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 2 mL de medio de cultivo completo. Cuenta el numero de celular y viabilidad bajo un microscopio de contraste de fase con un hemocitómetro.
Nota: Para 6 cables de espinal, el número de células se espera que sea alrededor de 1 x 105 MNs.
6. MN cultura
- Diluir el MNs a la densidad adecuada, generalmente de 5.000 a 10.000 células en 500 μl de medio de cultivo por pozo en una placa de 24 pozos.
Nota: Densidad de siembra es alrededor 1.500 y 30.000 células para placas de 6 y 96 pocillos, respectivamente. - Retirar la solución de laminina con una P1000.
- Transferir inmediatamente el MNs diluidos en medio de cultivo en las placas de revestimiento para evitar que se sequen.
- Incubar el cultivo durante 2 días a 37 ° C.
7. Magnetofection de MNs
Nota: En los pasos siguientes, las cantidades utilizadas sirven para la transfección de un pozo de una placa de 24 pocillos. Consulte el protocolo del fabricante para otro formato.
- Para la preparación de ADN, resuspender 1 μg de ADN en 50 μl de medio de cultivo neuronal y de vortex durante 5 s.
- Para la preparación del tubo de grano, resuspender 1,5 μl de granos en 50 μl de medio de cultivo neuronal.
- Añadir la solución de grano 50 μl de la solución de ADN de 50 μl e incubar por 20 min a temperatura ambiente (volumen total = 100 μL).
- Durante la incubación, retirar 100 μl de medio de cultivo del pozo que se transfectadas.
Nota: Coloque la placa magnética en la incubadora para calentar a 37 ° C. - Transferir 100 μl de la mezcla de ADN/tira al pozo e incubar la placa 20-30 min en la placa magnética a 37 ° C.
- Espere al menos 24 h antes de la detección de la expresión de cDNA.
8. fijación y tinción
- Lave la cultura 2 veces con PBS.
- Incubar el cultivo por 20 min a temperatura ambiente en 4% PFA/PBS.
- Lave la cultura 2 veces con PBS.
- Incubar el cultivo en 500 μl de solución amortiguadora de bloqueo (PBS BSA 4%, 2% de suero normal, 0,3% Tritón X-100, 0,1 M glicina) por 1 h a temperatura ambiente.
Nota: Suero Normal debe derivarse de la misma especie que el anticuerpo secundario (p. ej., suero de cabra Normal). - Incubar el cultivo durante la noche a 4 ° C con anticuerpo primario diluido en 250 μl de solución amortiguadora de bloqueo.
Nota: por ejemplo, TUJ1 se utiliza en 1/1000, SMI32 se utiliza en 1/1.000 y Lc3b se utiliza a 1/200. - Lave la cultura 3 veces con PBS.
- Incubar el cultivo con anticuerpos secundarios conjugados fluoróforo diluidos en 250 μl de solución amortiguadora de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lave la cultura 3 veces con PBS.
- Montar en portaobjetos de vidrio con medio de montaje.
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Representative Results
Después de 24 horas en la cultura, motoneuronas (MNs) ya deben mostrar un crecimiento axonal importante (por lo menos 6 veces más que el tamaño del soma). En los días siguientes, axones deben seguir creciendo y la exhibición de ramificación (figura 2). Habrá diferentes morfologías debido a las especificidades del subtipo. Por ejemplo, media columna MNs que inervan los músculos axiales tienen axones más cortos y más ramificadas que columna lateral motor MNs que inervan los músculos de extremidades18.
Estos aislamiento y técnicas de cultivo descritas recientemente se han utilizado para caracterizar una nueva mutación en el gene del neurofilament NEFH que causa una forma axonal autosómica dominante de CMT13. En este caso, dos días después de la galjanoplastia, MNs purificadas fueron transfectadas con los plásmidos que codifican una forma mutante de NEFH fusionado a eGFP o la forma de tipo salvaje fundido a eGFP. Dos días más tarde, mutante NEFH-eGFP formado agregados a lo largo de la red citoesquelética. Cuatro días después de magnetofection, estos agregados evolucionaron en un aggresome perinuclear prominente que contiene el marcador de autofagia LC3b (figura 3). Este enfoque nos permitió demostrar que la forma mutante de NEFH induce la formación de agregados que están asociados a vías autofagia en MNs primarias.
Figura 1: Resumen de los pasos principales del procedimiento. Embriones de ratón (A) E12.5 se disecan para extraer el cuerno ventral de la médula espinal. Entonces, las neuronas de las células del cuerno ventral son disociadas y MNs son purificadas por gradiente de densidad antes de la galjanoplastia. Por último, MNs son transfectadas por magnetofection y analizados después de algunos días. (B) el primer paso en la disección de la médula espinal es cuando la placa del techo de la médula espinal se abre a lo largo del eje rostro caudal con fórceps. Luego, la médula espinal se separa del cuerpo tirando el tronco cerebral. En este punto, meninges y ganglios de raíz dorsal (GRD) permanecen en el cuerpo embrionario. La parte dorsal de la médula espinal se corta longitudinalmente con un bisturí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: cultura MN representante. (A) MNs morfología después de 4 días de la cultura revelada por la coloración de la cadena pesada de neurofilamentos fosforilados no endógena (SMI32). Barra de escala = 100 μm. (B) MNs morfología después de 4 días en vitro y transfectadas para eGFP transgén por magnetofection en el día 2. MNs fueron contratinción con el marcador SMI32 o el marcador neuronal pan Tuj1. Las flechas muestran los somas de las neuronas. Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes confocales de magnetofected MNs que expresan eGFP-NEFH tipo salvaje o mutante construye (en verde) y teñido por el marcador de autofagia LC3b (en rojo). Las flechas muestran mutante eGFP-NEFH agregados proteicos que son también LC3b positivo. Barra de escala = 10 μm. las imágenes se modifican de Jacquier et al 2017, Acta Neuropathologica comunicación13.
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Discussion
Uno de los puntos críticos de este protocolo es que se disecan los embriones de ratón en una ventana de tiempo preciso durante el desarrollo (E12.5) para optimizar la cantidad de MNs obtenida al final. Además, para un rendimiento óptimo, la disección debe realizarse por la mañana o temprano por la tarde. Antes de E12.5 (por ejemplo, en E11.5), la disección es difícil, especialmente con respecto a la eliminación de las meninges. Después de E12.5, el número de MNs obtenidas cae significativamente. Para controlar la etapa embrionaria de desarrollo, machos y hembras adultas primero colocan juntos al final del día. A la mañana siguiente, los adultos se separan, y las hembras se comprueban de la presencia de un tapón vaginal. Si un enchufe está presente, embriones en este punto se consideran estar en E0.5 día de desarrollo. Para estos experimentos, se utiliza típicamente una línea de ratón que es vigorosa y productiva. Progenitores procedentes de una colonia en Missouri fueron utilizados en el presente Protocolo, y la cepa fue nombrada CF1 (granjas de Carworth cepa 1). Esta variedad fue introducida en Francia de Charles River Laboratories en 1967, y adquirió el nombre 1 (Oncins Francia 1).
Un segundo punto crítico es los pasos de centrifugación que influyen grandemente en la pureza de la cultura. MNs representan un bajo porcentaje de las células de la médula espinal (alrededor del 1%), y el objetivo es obtener una cultura que contiene 40 a 50% MNs entre otras células neuronales espinales y progenitores de células gliales de menos de 5%. Para monitorear la eficacia de los centrifugados, celular de las muestras de suspensión adquiridas antes y después de cada paso puede ser plateado en medio MNs durante 24 horas, seguido de fijación y tinción para la expresión de marcadores de motoneurona Hb9 (81.5C10, DSHB) o islote/isla 1-2 (ISL1 / 40.2D6 2, /39.4D5, DSHB), cuyas combinaciones definen diferentes MNs subpoblación19. En MNs más maduros, otros marcadores como la colina acetil transferasa (CHAT, Ab144P) o neurofilamentos H no-phosphorylated (SMI - 32 P) pueden usarse para estimar la calidad de la cultura. Una buena alternativa para supervisar rápidamente la eficacia de la purificación es con ratones transgénicos que expresan la proteína fluorescente verde (GFP) específicamente en MNs. Por ejemplo, Wichterle y sus colegas previamente desarrollaron ratones transgénicos que expresan GFP bajo el control del ratón Hb9 (también llamado Hlxb9 o Mnx1) promotor18. Ratones transgénicos Hb9::GFP mostrarán la distinta expresión de GFP en las dendritas, axones y somas de MNs espinales del día embrionario 9.5 a día postnatal 10.
MNs requieren crecimiento sobre un sustrato permisivo por Poly-L-ornitina y capa de laminina. Dependiendo de las condiciones experimentales, se puede utilizar una variedad de plástico, polímeros y envases de vidrio (por ejemplo, 6-24, placas de 96 pocillos, cubreobjetos de cristal o compartimiento de diapositivas). Entre estas opciones, dispositivos microfluídicos pueden ser de interés para abordar cuestiones específicas con respecto a la formación de sinapsis o de guía y transporte axonal20. MNs son conocidos por ser sensibles a los cambios en su microambiente que patrones, factores de concentración, cambios mecánicos en el sustrato (por ejemplo, rigidez), pura tensión y señales gradiente espacio-temporal (p. ej., levantamiento topográfico características, patrones de superficies con sustancias de diferentes afinidades celulares). Plataformas de microfluidos son sistemas que pueden integrar condiciones multifactoriales, lo que permite la determinación del óptimo microambientes celulares.
Desde el descubrimiento de supervivencia effects7 de GDNF, está creciendo el número de factores neurotróficos en crecimiento inicial MN y supervivencia, orientación y desarrollo de axones, inducción de la plasticidad sináptica. Curiosamente, cada factor actúa en una subpoblación específica de MNs8. Por ejemplo, CNTF se ha descrito para proteger la columna motor mediana (MMC) que inerva la musculatura axial, mientras que el HGF actúa sobre la columna lateral de motor (LMC) que inerva los músculos de la extremidad. Por otro lado, GDNF y BDNF Mostrar la actividad más fuerte de la pro-supervivencia en poblaciones enteras de MNs. Por último, la combinación de CNTF, GDNF y BDNF es suficiente para la protección de más del 70% de una población de MN y es de uso general en laboratorios.
En condiciones de cultivo estándar, MNs pueden mantenerse in vitro 14 días sustituyendo la mitad de los medios de cultivo con medio fresco cada 3 días, a partir de la quinta jornada de la cultura. Durante la maduración en vitro , pueden ser transfectadas MNs por magnetofection en cualquier momento utilizando este protocolo. Eficacia y toxicidad de esta técnica pueden ser moduladas por la naturaleza de los plásmidos y los partes movibles. En nuestro caso, cuando el magnetofection fue realizado en la cultura de MN después de 2 días en vitro usando un plásmido de 9 kb con un promotor CAGGS (pCAGEN21) control de cDNA del neurofilament, observamos una media de 31.48% ± 9.94 (desviación estándar) de transfected MNs transfección después de 48 horas. Sin embargo, para otras construcciones, un diverso cociente de granos de la DNA debe ser evaluado como se describe en el protocolo del fabricante. Otro parámetro que puede influir en la eficacia nivel de transfección es la maduración del SNE en el tiempo. De hecho, durante los 3 primeros días de la cultura, crecimiento de los axones y la ampliación de somas ocurrirá, que aumenta el área superficial donde penetran los granos. Este parámetro puede aumentar eficacia de transfección de MN en el tiempo durante la maduración.
Por último, en comparación con las culturas MN, sería interesante cultivar neuronas sensoriales22,23,24. En particular, la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth es una neuropatía motora sensorial caracterizada por atrofia muscular distal relacionadas con la degeneración de los MNs espinales y las neuronas sensoriales de DRGs. Curiosamente, GRD se encuentra a ambos lados de la médula espinal y puede ser recogidas durante el mismo procedimiento de la disección para obtener MNs. En este sentido, es posible comparar los mecanismos patofisiológicos en el trabajo en estos dos tipos celulares pertinentes, motoneuronas y neuronas sensibles DRG.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a la "Association pour le développement de la neurogénétique" para la beca Dr. Jacquier y AFM Telethon por su apoyo a través del plan estratégico MyoNeurAlp. También nos gustaría agradecer al Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul y Dr. Georg Haase, que participaron en el desarrollo y mejora de la técnica y difundir sus conocimientos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
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