Summary
Målet med denne artikel er at fremlægge en metode, der giver mulighed for en 3-dimensional rekonstruktion af cerebrovaskulær træet i mus efter mikro beregnet tomografi og fastlæggelsen af antallet af hele fartøjet segmenter, der kan bruges til at kvantificere cerebral vasospasme i murine modeller af subaraknoid blødning.
Abstract
Subaraknoidal blødning (SAH) er en undertype af hæmoragisk apopleksi. Cerebral vasospasme, der opstår i kølvandet på den blødning er en vigtig faktor patient resultat og er derfor ofte taget som en undersøgelse slutpunkt. Dog i lille dyreforsøg på SAH er kvantificering af cerebral vasospasme en stor udfordring. Her, præsenteres en ex vivo metode der giver mulighed for kvantificering af mængder af hele fartøjet segmenter, som kan bruges som et objektivt mål for at kvantificere cerebral vasospasme. I et første skridt, er endovaskulære støbning af cerebral Vaskulaturen udføres ved hjælp af en røntgenfast casting agent. Derefter, imaging tværsnitsdata er erhvervet af mikro computertomografi. Det sidste trin omfatter 3-dimensionelle genopbygning af den virtuelle vaskulær træ, efterfulgt af en algoritme til at beregne center linjer og mængder af de valgte fartøj segmenter. Metoden, der resulterede i en meget præcis virtuel rekonstruktion af cerebrovaskulær træet vist ved en diameter-baseret sammenligning af anatomiske prøver med deres virtuelle rekonstruktioner. Sammenlignet med fartøjet diametre alene, fremhæve fartøjer diskenhederne forskellene mellem vasospastisk og ikke-vasospastisk fartøjer vist i en serie af SAH og sham-drives mus.
Introduction
Aneurysmatic subaraknoid blødning (SAH), en undertype af hæmoragisk slagtilfælde, er en almindelig sygdom i neurointensive pleje enheder. Udover tidlig hjerneskade (EBI), som består af cerebrale skader forårsaget af hændelsen blødning, selv, en anden vigtig faktor patient resultatet er forsinket cerebral iskæmi (DCI), defineret ved klinisk forværring gennem nedsat cerebral perfusion eller cerebral infarkt ikke tilknyttet interventionel eller kirurgiske procedurer1,2,3. Vigtige mekanismer bidrager til DCI er vasospasms af store cerebral fartøjer på den ene side; på den anden side microcirculatory dysfunktion med vasospasme af microvessels og microthrombosis og iskæmi relateret til kortikale sprede depressioner spille en rolle (gennemgik i Madonald 20141). Derfor, diagnosticering af vasospasme af de store cerebrale fartøjer er afgørende i klinisk praksis og viser et vigtigt slutpunkt i mange kliniske og eksperimentelle undersøgelser.
Trods det faktum, at funktioner af vasospasme i murine SAH modeller ikke er direkte overføres til de menneskelige patient, murine modeller af SAH relaterede vasospasme har været voksende betydning i de sidste år. I disse modeller er SAH foranlediget af endovaskulære glødetrådens perforering4,5,6,7,8, transection af cisternal fartøjer9, eller indsprøjtning af blodet i CSF10 ,11,12. I modsætning til store animalske modeller af SAH, der traditionelt var designet til at studere vasospasme13, har murine modeller den store fordel, at mange Transgene mus stammer er tilgængelige. Dette gør dem en fremragende værktøj for at studere molekylære mekanismer fører til vasospasme og DCI. Bestemmelse af cerebral vasospasme i mus er imidlertid udfordrende. Dette skyldes, at i modsætning til store dyremodeller hvor vasospasme kan undersøges ved hjælp af kliniske Billeddannende teknikker, i vivo billeddannelse til at analysere cerebral vasospasme i mus ikke er endnu tilgængelige. Derfor bestemmes vasospasme sædvanligvis ved hjælp af enten histologiske afsnit10,11 eller mikroskopisk efter støbning af cerebral fartøjer7,9,12. Men disse teknikker har Ulempen, at fartøjet diametre er undersøgt på definerede punkter kun.
Baseret på en tidligere undersøgelse7, præsenterer dette manuskript en metode for mål og reproducerbare analyse af vasospasme i en murine SAH model. Metoden er baseret på perfusion og støbning af cerebral fartøjer, ex vivo mikro-CT scanning, digital genopbygning af træet fartøj, og efterfølgende evaluering af mængder af hele cerebral fartøjer.
Protocol
De dyreforsøg blev godkendt af den ansvarlige dyrs pleje (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) og udført i overensstemmelse med den tyske Animal Welfare Act (TierSchG). Alle gældende internationale, nationale og institutionelle retningslinjer for pleje og brug af dyr blev fulgt.
I denne undersøgelse, blev mandlige C57BL6 mus (alder 10-12 uger) brugt. Kort sagt, er subaraknoid blødning fremkaldt ved endovaskulære glødetrådens perforering under anæstesi med isofluran. Den venstre eksterne halspulsåren blev udarbejdet kirurgisk. Derefter blev en glødetråd indsat i den eksterne halspulsåren og avanceret intracranially gennem den interne halspulsåren, der var perforeret på carotis T, inducerende en subaraknoid blødning. En stigning i intrakranielt tryk blev taget som en indikator for vellykket endovaskulære perforering. En detaljeret protokol af en endovaskulære glødetrådens perforering model af SAH i mus har været udgivet af andre8,14.
1. perfusion og endovaskulære støbning
- I denne undersøgelse, var perfusion udført 72 timer efter induktion af SAH. Inducere anæstesi ved intraperitoneal injektion 5 µg/g organ vægt (bw) midazolam, 30 ng/g bw fentanyl og 0,5 µg/g bw medetomidin. Fortsat kun efter en tilstrækkelig anæstesi har været nået, hvilket bekræftes af manglende reaktioner på smerte stimuli.
- Åbne brystkassen, punktere den venstre ventrikel med en 21G kanyle, Åbn højre atrium og klemme den nedadgående aorta som beskrevet andetsteds15.
- Udføre en transcardiac perfusion ved hjælp af følgende løsninger: (i) Dulbecco phosphat bufferet saltvand indeholdende MgCl2 og CaCl2 ved pH 7,4 med 1 g/L glukose, og (ii) 4% PARAFORMALDEHYD løsning.
- Starte perfusion med løsning (i) i 2 minutter og fortsætte med løsning (ii) i 4 minutter.
- Indgyde løsninger ved en temperatur på 37 ° C og ved hjælp af en pres-kontrollerede pumpe med variabel perfusion sats til perfuse med et konstant tryk på 70 mmHg, som blev anset for at være optimal perfusion presset til at analysere vasospasme i mus16. Undgå tab af pres når du skifter fra løsning (i) til løsning (Ii).
- Efter perfusion med løsninger (i) og (ii), fortsætte perfusion i 20 minutter ved stuetemperatur med røntgenfast casting agent (Se Tabel af materialer) med en konstant rate på 0,2 ml/min.
- Giver mulighed for at kurere røntgenfast trykstøbning materialets ved 4 ° C natten over. Derefter fjerne hjernen fra kraniet som tidligere beskrevet17, overføre prøven til 4% PFA løsning og opbevares prøven ved 4 ° C indtil mikro CT scanning.
2. micro computertomografi
- Læg hjernen i midten af et plastik rør med en stump anatomisk pincet. Vælg et rør med en lidt større diameter end prøve at sikre, at objektet ikke bevæger sig under image erhvervelse. Bruge gaze til at lukke røret.
- Vedhæfte den plastikrør til den mikro-stepping motor på computer-navigerede-kontrol (CNC) positioning system i X-ray kabine, hvor objektet drejes omkring sin vandrette akse.
- Juster prøven i field of view under X-ray radiografi. For at opnå maksimal forstørrelse, placere objektet så tæt som muligt på røntgen kilden og maksimere afstanden til detektoren så vidt muligt.
- Bruge en trin-og-skyd billede erhvervelse protokol med følgende scanningsparametrene: indstillet eksponeringstid til 1 s for hver projektion at optimere signal-støj-forhold (SNR), tube spænding 80 kV (nuværende 38 µA), 360° rotation resulterer i 1.000 fremskrivninger.
- For genopbygningen af RAW-Data bruger en filtreret back projektion algoritmen anvender Shepp-Logan filteret med en matrix af 1024 x 1024 x 1024 voxels ved hjælp af genopbygning software (Se Tabel af materialer). For yderligere analyse importere de resulterende DICOM-data til 3D-visualisering software (Se Tabel af materialer).
3. 3-dimensionelle genopbygning af intrakraniel vaskulære træ og bestemmelse af fartøjer diskenhederne
Bemærk: Baggrundsinformation om funktionerne af visualisering software kan findes ved hjælp af funktionen Hjælp.
- Importere DICOM-data til visualisering software ved hjælp af funktionen Importer.
- Visualisere fartøj træet med funktionen Volren. Vælg visualisering tærskel, så de store cerebrale arterier er afbildet i skarpe konturer. Det er vigtigt at bruge den samme visualisering tærskel for alle datasæt tilhører den eksperimentelle serien.
- Næsten dissekere den basale cerebrale arterier (kredsen af Willis) med funktionen VolumeEdit af omkringliggende fartøjer med markøren. Derefter næsten dissekere fartøj segment skal analyseres. Derfor, rotere den 3-dimensionelle model af vaskulære træet for at netop adskille alle små grene fra de vigtigste arterie. Det er afgørende for den videre analyse til at slette alle fartøjer undtagen fartøj segment skal analyseres.
- Anvender funktionen Autoskeleton med tærskelværdi til visualisering tærskel, som genererer en center-line -baseret SpatialGraph.
- Derefter, anvende funktionen SpatialGraphToLineSet til at oprette en linje sæt. Opdele linjen sat i dens indre undersegmenter ved manuelt at vælge de enkelt undersegmenter med markøren og klikke på "split". Dette trin er afgørende for at beregne mængderne af de enkelt undersegmenter.
- Brug funktionen LineSetToSpatialGraph til at skabe en rumlig figur igen.
- Brug funktionen SpatialGraphStatistics til at afgøre, længde, volumen, og diameter på hver undersegment. Farvekodede visualisering repræsenterer løbet af fartøjet diameter, bruge funktionen SpatialGraphView. Indstille segment farve til "tykkelse", der korrelerer med fartøjet diameter. Det er vigtigt at vælge den samme farve kort for alle datasæt tilhører den eksperimentelle serien.
- Tilføje længder af undersegmenter til bestemme hvilke undersegmenter skal indgå i den videre analyse. I den foreliggende undersøgelse vurderet vi et fartøj segment består af 1 mm af den interne carotis arterie proksimale af carotis T og 2,5 mm af den midterste cerebral arterie distale af carotis T. Derefter tilsættes mængder for at bestemme fartøj volumen af definerede fartøj segment.
Representative Results
Virtuel rekonstruktion af den 3-dimensionelle intrakraniel vaskulære træ
De 3-dimensionsstabil rekonstruerede intrakraniel vaskulære træer fastsat en meget nøjagtig vaskulære anatomi (figur 1). For at vurdere nøjagtigheden, vi udførte en diameter-baseret sammenligning mellem fartøjet diameter bestemmes mikroskopisk og fra de 3-dimensionelle virtuelle rekonstruktioner på 2 Anatomisk defineret point (1: venstre midt cerebrale arterie (MCA) 1 mm distale af den carotis T; 2: lige MCA 1 mm distale af carotis T). For mikroskopiske bestemmelse af fartøjet diametre, blev en høj opløsning kamera (Infinity X-21, Deltapix) med DeltaPix indsigt softwareversion 2.0.1 kalibreret til en mikrometer skala brugt. For denne evaluering, blev 10 hjernen prøver (5 SAH, 5 sham) analyseret. Disse var fra en serie af 12 mus i 7 som en SAH blev induceret, mens 5 undergik sham operation (2 dyr af gruppen SAH døde på postoperative dage 1 og 2, henholdsvis). Der var ingen signifikant forskel mellem diameter bestemmes mikroskopisk og stort set, som angiver en korrekt virtuel rekonstruktion af intrakraniel vaskulære anatomi (mikroskopiske bestemmelse vs. virtuel rekonstruktion, betyde ± standardafvigelse: venstre MCA 150 ± 9 µm vs venstre MCA 150 ± 8 µm; lige MCA 153 ± 8 µm vs154 ± 9 µm, se figur 2).
Kvantificering af cerebral vasospasme i mus med SAH
For at kvantificere cerebral vasospasme, (i) volumen af et foruddefineret repræsentative 3,5 mm fartøj segment, bestående af 1 mm interne halspulsåren (ICA) og 2,5 mm MCA til venstre, og (ii) at fartøjet diametre på 2 Anatomisk defineret point (venstre og højre MCA) blev bestemmes i hjernen prøver fra SAH og sham-opererede dyr (n = 5). Fartøjet var betydeligt lavere i SAH sammenlignet med fingeret (36 ± 4 nL vs 71 ± 9 nL, p < 0,05). Fartøj diametre var lavere i SAH sammenlignet med fingeret (venstre MCA: 140 ± 11 µm vs 160 ± 10 µm, p = 0,11; lige MCA: 130 ± 16 µm vs 158 ± 13 µm, p < 0,05; jf. figur 3), mens niveauet af betydning var kun nået til analys er af den rigtige MCA.
Figur 1. Virtuel rekonstruktion af intrakraniel vaskulære træet. (A) viser en repræsentativ hjernen prøve; (B) viser de tilsvarende næsten rekonstrueret vaskulær træ. (C) farvekodede visualisering af diameteren af venstre MCA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Nøjagtigheden af digital genopbygningen af Vaskulaturen. Gennemsnitlig diameter måles fra 3D rekonstruerede hjernen prøver sammenlignet med dem bestemmes mikroskopisk. Data er vist som gennemsnit ± standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Fartøj volumen og fartøj diameter efter SAH. (A) sammenligning af MCA diametre måles fra 3D rekonstruerede Vaskulaturen i SAH og humbug mus. (B) skibet volumen i SAH og humbug mus. Data er vist som gennemsnit ± standard fejl af middelværdien. p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Murine SAH modeller er et vigtigt redskab for SAH grundforskning. Cerebral vasospasme bruges ofte som et slutpunkt i eksperimentelle studier undersøger de mekanismer, der fører til DCI efter SAH9,11. Dog er kvantificering af cerebral vasospasme i mus eller andre små dyremodeller af SAH udfordrende. Almindeligt, kvantificeres vasospasme ved ex vivo bestemmelse af fartøjet diametre på defineret anatomisk point efter endovaskulære perfusion og støbning7,9,12 eller ved bestemmelse af omkredsen af definerede fartøjer på histologiske sektioner10,11. Disse metoder har dog nogle ulemper: vasospasme vurderes kun på definerede anatomiske punkter; vasospasme i nabolandet fartøj segmenter kan undslippe evaluering. Histologiske artefakter præsentere en anden kilde til fejl. Desuden kan evaluering være temmelig subjektiv, fordi den nøjagtige position, hvor fartøjet diameter måles bestemmes af investigator.
Målet var derfor at etablere en metode, der kvantificerer cerebral vasospasme ved beregning af fartøjet volumen af hele cerebral fartøj segmenter fra tværsnits billeddiagnostiske data7. Den vigtigste fordel af den volumetriske metode præsenteres her er hele fartøjet segmenter kan undersøges. Dette undgår behovet for definition af et punkt, hvor fartøjet diameter måles. En yderligere fordel af evalueringen af hele fartøjet segmenter er at det formodentlig præsenterer en mere objektiv parameter for at kvantificere vasospasme end bestemmelse af fartøjet diametre på definerede punkter hvor vasospasme mere proksimale eller distale fartøjets kan undslippe evaluering. Digital repræsentation af fartøjet diameter ved hjælp af en farvekode giver en intuitiv vurdering af graden af vasospasme. Derudover fører volumetriske vurdering til større forskelle mellem vasospastisk fartøjer i forhold til evaluering af fartøjet diametre som vist i de repræsentative resultater. Den virtuelle genopbygning opnået med metoden præsenteres her afspejler den vaskulære anatomi. Det fremgår af evalueringen af den repræsentative serie, i hvilken fartøjet diametre måles mikroskopisk og fra de digitale rekonstruktioner var lighed, gengivelse observationer af en tidligere undersøgelse7. Men trods dens fordele er yderligere undersøgelser er nødvendige for at vurdere, hvorvidt metoden præsenteres her er overlegen i forhold til konventionelle analysemetoder vasospasme.
En begrænsning af den metode, der præsenteres her er, at det giver mere tid i forhold til mikroskopisk analyse af støbt hjernen prøver eller histologiske analyse (mikro CT-scanning tid 90 minutter pr. hjerne prøve, databehandling 45 min pr. hjerne prøve). Derudover kan tilgængeligheden af mikro CT scannere begrænse dens anvendelse. Antallet af dyr undersøges her var tilstrækkelig til at godtgøre muligheden af den protokol, der er beskrevet i dette håndskrift. Men hvis protokollen bør anvendes i undersøgelser, behandling, dyret tal skulle være beregnet baseret på de forventede virkninger på fartøjer diskenhederne og diametre. En anden begrænsning af denne og andre undersøgelser, murine SAH modeller er, at vasospasme er fastsat ex vivo. Dette gør longitudinelle studier umuligt at undersøger baseline værdier før SAH induktion og vasospasme på forskellige tidspunkter. Selv om undersøgelser har vist, at det er muligt at skildre anatomi af de store intrakraniel fartøjer af mus i vivo bruger magnetisk resonans tomografi18, CT angiografi19eller digital subtraktion angiografi20, disse metoder, at vores viden, har endnu ikke anvendes til at analysere cerebral vasospasme i murine SAH modeller in vivo. Af note er digital genopbygningen af den cerebrale kar med efterfølgende volumetriske evaluering af cerebral vasospasme præsenteres her ikke begrænset til brug på ex vivo micro CT data. Hvis høj opløsning vaskulære cross Sektional hjernen imaging i mus skulle blive tilgængeligt i fremtiden, kan det bruges til at udføre en volumetrisk analyse af vasospasme i vivo.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dele af denne undersøgelse er en del af ph.d.-afhandling af T. Pantel, præsenteret for det medicinske fakultet af Johannes Gutenberg-universitetet i Mainz. Undersøgelsen blev støttet af Friedhelm frigør Stiftung og ved Stiftung Neurochirurgische Forschung (tilskud til A.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medetomidin | Pfizer, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
| Midazolam | Ratiopharm, Ulm, Germany | n.a. | |
| Fentanyl | Curamed, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
| Venofix 21G | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | n.a. | 21G cannula |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4 | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | D8662 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | 100496 | |
| Microfil MV-122 | Flowtech Inc., Carver, MA, USA | n.a. | Radiopaque |
| Micro-CT system Y.Fox | Yxlon, Garbsen, Germany | n.a. | |
| Reconstruction Studio software version 1.2.8.1 | TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany | n.a. | Reconstruction software |
| Amira software version 5.4.2 | FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA | n.a. | Visualization software |
| PHD ultra syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3 | Pressure controlled pump |
| anatomical forceps (blunt) | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 160323_v | |
| Infinity X-21 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | high resolution camera |
| DeltaPix Insight software version 2.0.1 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | |
| C57BL6 mice | Charles River, Cologne, Germany |
References
- Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
- Dorsch, N. A clinical review of cerebral vasospasm and delayed ischaemia following aneurysm rupture. Acta Neurochirurgica Supplement. 110 (Pt 1), 5-6 (2011).
- Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: Proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Friedrich, B., et al. CO2 has no therapeutic effect on early microvasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), e1-e6 (2014).
- Friedrich, B., Muller, F., Feiler, S., Scholler, K., Plesnila, N. Experimental subarachnoid hemorrhage causes early and long-lasting microarterial constriction and microthrombosis: An in vivo microscopy study. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (3), 447-455 (2012).
- Terpolilli, N. A., et al. Nitric oxide inhalation reduces brain damage, prevents mortality, and improves neurological outcome after subarachnoid hemorrhage by resolving early pial microvasospasms. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (12), 2096-2107 (2016).
- Neulen, A., et al. A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data. PLoS One. 12 (2), e0172010 (2017).
- Schuller, K., Buhler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (81), e50845 (2013).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 136-140 (2009).
- Momin, E. N., et al. Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).
- Froehler, M. T., et al. Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic. Journal of Clinical Neurocience. 17 (9), 1169-1172 (2010).
- Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).
- Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm. British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).
- Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. Journal of Neuroscience Methods. 190 (2), 164-170 (2010).
- Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. Journal of Neuroscience Methods. 221, 70-77 (2014).
- Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurological research. 24 (5), 510-516 (2002).
- Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M.
- Marjamaa, J., et al. Mice with a deletion in the first intron of the Col1a1 gene develop dissection and rupture of aorta in the absence of aneurysms: High-resolution magnetic resonance imaging, at 4.7 T, of the aorta and cerebral arteries. Magnetic Resonance in Medicine. 55 (3), 592-597 (2006).
- Schambach, S. J., et al. Ultrafast high-resolution in vivo volume-CTA of mice cerebral vessels. Stroke. 40 (4), 1444-1450 (2009).
- Figueiredo, G., et al. Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice. Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).
