Summary
Målet med denne artikkelen er å presentere en metode som gjør at en 3-dimensjonal rekonstruksjon av cerebrovascular treet i mus etter mikro beregnet tomografi og besluttsomhet volumer av hele fartøyet segmenter som kan brukes å kvantifisere cerebral vasospasme i murine modeller av Hjernehinneblødning.
Abstract
Hjernehinneblødning (SAH) er en undertype av hemoragisk hjerneslag. Cerebral vasospasme som oppstår i kjølvannet av blødningen er en viktig faktor å bestemme pasient utfall og er derfor ofte tatt som en studie endepunkt. Men i små dyrestudier på SAH er kvantifisering av cerebral vasospasme en stor utfordring. Her presenteres en ex vivo metode som lar kvantifisering volumer av hele fartøyet deler, som kan brukes som et objektivt mål for å kvantifisere cerebral vasospasme. I et første skritt utføres endovascular støping av i hjerne blodkar med en kan lett identifiseres casting agent. Deretter er cross-sectional bildebehandling data kjøpt av mikro beregnet tomografi. Det siste trinnet innebærer 3-dimensjonale rekonstruksjon av virtuelle vaskulær treet, etterfulgt av en algoritme for å beregne center linjer og mengder valgte fartøyet segmentene. Metoden resulterte i en svært nøyaktig virtuelle rekonstruksjonen av cerebrovascular treet vist av en diameter-baserte sammenligning av anatomiske prøver med deres virtuelle rekonstruksjoner. Fartøyet volumene sammenlignet med fartøyet diameter alene, og Uthev forskjellene mellom vasospastic og ikke-vasospastic fartøy vises i en rekke SAH og humbug-opererte mus.
Introduction
Aneurysmatic Hjernehinneblødning (SAH), en undertype av hemoragisk hjerneslag, er en vanlig sykdom i neurointensive omsorg enheter. Foruten tidlig hjerneskade (EBI), som omfatter hjerne skader forårsaket av blødning begivenheten selv, en annen viktig faktor å bestemme pasient utfall er forsinket cerebral iskemi (DCI), definert av klinisk forringelse gjennom svekket cerebral perfusjon eller hjerneinfarkt ikke er tilknyttet intervensjonsradiologi eller kirurgiske prosedyrer1,2,3. Viktig mekanismer bidra til DCI er vasospasms av store cerebral fartøy på den ene siden; på den annen side, microcirculatory dysfunksjon med vasospasme microvessels og microthrombosis og ischemia knyttet til kortikale spre depresjoner spille en rolle (omtalt i Madonald 20141). Derfor diagnosen vasospasme av store cerebral fartøyene er avgjørende i klinisk praksis, og viser et viktig sluttpunkt i mange kliniske og eksperimentelle studier.
Tross for at funksjonene for vasospasme murine SAH modeller ikke er direkte overførbar til menneskelig tålmodig, murine modeller av SAH relaterte vasospasme har vært økende betydning i de siste årene. I disse modellene er SAH indusert av endovascular filament perforering4,5,6,7,8, transection av cisternal fartøy9eller injeksjon av blod i CSF10 ,11,12. I motsetning til store dyr modeller av SAH som ble tradisjonelt utformet å studere vasospasme13, har murine modellene den store fordelen at det finnes mange transgene mus stammer. Dette gjør dem et utmerket verktøy for å studere molekylære mekanismer fører til vasospasme og DCI. Men er bestemmelse av cerebral vasospasme i mus utfordrende. Dette er fordi i motsetning til store dyr modeller der vasospasme kan undersøkes med klinisk Bildeteknikker, i vivo for å analysere cerebral vasospasme i mus ikke er ennå tilgjengelig. Derfor bestemmes vasospasme vanligvis bruker enten histologiske deler10,11 eller mikroskopisk etter avstøpning cerebral fartøy7,9,12. Men har disse teknikkene ulempen at fartøyet diameter undersøkes på definerte steder bare.
Dette manuskriptet basert på en tidligere studie7, og presenterer en metode for mål og reproduserbar analyse av vasospasme i murine SAH modell. Metoden er basert på perfusjon og støping av cerebral fartøy, ex vivo mikro-CT skanner, digital rekonstruksjon av fartøyet treet, og påfølgende evaluering av mengder hele cerebral fartøy.
Protocol
Det dyreforsøkene ble godkjent av ansvarlig dyr omsorg (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) og utført i samsvar med det tyske dyr velferd gjerning (TierSchG). Alle gjeldende internasjonale, nasjonale og institusjonelle retningslinjer og bruk av dyr ble fulgt.
I denne studien ble mannlige C57BL6 mus (alder 10-12 uker) brukt. I korte trekk, ble Hjernehinneblødning indusert ved endovascular filament perforering under anestesi med isoflurane. Venstre eksterne arteria carotis ble utarbeidet surgically. Deretter ble en filament satt inn i den eksterne arteria carotis og avansert intracranially gjennom de interne arteria carotis som var perforert på carotis T, indusere en Hjernehinneblødning. En økning i intrakranielt trykk ble tatt som en indikator på vellykket endovascular perforering. En endovascular filament perforering modell av SAH i mus detaljert protokollen er publisert av andre8,14.
1. perfusjon og Endovascular støping
- I denne studien, var perfusjon utført 72 timer etter induksjon av SAH. Indusere anestesi ved å injisere intraperitoneally 5 µg/g kroppen vekt (bw) midazolam, 30 ng/g bw fentanyl og 0,5 µg/g bw medetomidin. Fortsette etter at et tilstrekkelig anestesi nivå er nådd, som er bekreftet av fravær av reaksjoner på smerte stimuli.
- Åpne thorax, punktering venstre ventrikkel med en 21G kanyle, åpne riktig atrium og klemme synkende aorta som beskrevet andre steder15.
- Utføre en transcardiac perfusjon bruker følgende: (i) Dulbeccos fosfat bufret Saline inneholder MgCl2 og CaCl2 ved pH 7.4 med 1 finans glukose og (ii) 4% paraformaldehyde løsning.
- Starte av perfusjon løsning (i) i 2 minutter og fortsette med løsning (ii) i 4 minutter.
- Tilfører løsningene ved en temperatur på 37 ° C og benytter en trykk-kontrollerte pumpe med variabel perfusjon rate til perfuse med en konstant press for 70 mmHg, som ble funnet for å være optimalt perfusjon presset til å analysere vasospasme i mus16. Unngå tap press når du bytter fra løsning (i) å løsning (Ii).
- Etter perfusjon med løsninger (i) og (ii), fortsetter perfusjon i 20 minutter ved romtemperatur med kan lett identifiseres casting agent (se Tabell for materiale) med en konstant hastighet på 0,2 ml/min.
- Tillate herding av kan lett identifiseres støping materialet 4 ° C over natten. Fjern deretter hjernen fra skallen som beskrevet tidligere17, overføre prøven til 4% PFA løsning og lagre prøven på 4 ° C til mikro CT skanning.
2. micro-tomografi
- Plass hjernen i midten av et plastrør med en stump anatomiske tang. Velg et rør med en litt større diameter enn prøve å sikre at objektet ikke flytte under bildeopptak. Bruk gauze lukke røret.
- Fest plastrør til mikro-stepping motor på datamaskinen-navigert kontroll (CNC) posisjoneringssystem i X-ray hytta, der objektet roteres rundt den vannrette aksen.
- Justere utvalget i feltet-av-visningen under X-ray røntgen. For å oppnå maksimal forstørrelse, plassere objektet så nært som mulig til x-ray kilden og maksimere avstanden til detektoren så langt som mulig.
- Bruke en trinn-og-shoot bilde oppkjøpet protokoll med følgende skanning parametere: angitt eksponeringstid til 1 s for hver projeksjon å optimalisere signal-til-støy-forhold (SNR), rør spenning 80 kV (gjeldende 38 µA), 360° rotasjon resulterer i 1000 anslag.
- Gjenoppbygging av RAW-Data bruker en filtrert tilbake projeksjon algoritme filteret Shepp-Logan med en matrise av 1024 x 1024 x 1024 voxels med gjenoppbygging programvare (se Tabell for materiale). For videre analyse importere DICOM resultatdataene til 3D-visualisering programvare (se Tabell for materiale).
3. 3-dimensjonale rekonstruksjon av intrakranielt Vascular Tree og fastsettelse av fartøyet volumer
Merk: Bakgrunnsinformasjon om funksjonene av visualisering programvare kan finnes ved hjelp av funksjonen hjelpe.
- Importere Dicom data i visualisering programvare ved hjelp av funksjonen Importer.
- Visualisere fartøyet treet med funksjonen Volren. Velge visualisering terskelen slik at store cerebral arteriene er avbildet i skarpe disposisjoner. Det er viktig å bruke samme visualisering terskelen for alle datasett for eksperimentell.
- Nesten dissekere basale cerebral arteriene (sirkel av Willis) med funksjonen VolumeEdit ved omgir fartøyene med markøren. Så nesten dissekere fartøyet segmentet som skal analyseres. Derfor rotere 3-dimensjonal modell av vaskulær treet for å skille nøyaktig alle små greiner fra hovedpulsåren. Det er viktig for videre analyse slette alle skip unntatt fartøyet segmentet som skal analyseres.
- Bruke funksjonen Autoskeleton med grensen angitt visualisering terskelen, som genererer en center-line -basert SpatialGraph.
- Bruk deretter funksjonen SpatialGraphToLineSet å lage en linje sett. Dele linjen sette dens enkelt Undersegmenter ved manuelt å velge de enkelt segmentene med markøren og klikke på "split". Dette trinnet er avgjørende for å beregne volumet av de enkelt segmentene.
- Bruk funksjonen LineSetToSpatialGraph for å opprette en romlig graf igjen.
- Bruk SpatialGraphStatistics -funksjonen til å bestemme lengde, volum og diameteren på hver undersegmentet. Fargekodede visualisering representerer løpet av fartøyet diameter, bruk funksjonen for SpatialGraphView. Angi segmentet coloring til "tykkelse", som korrelerer med fartøyet diameter. Det er viktig å velge samme farge kart for alle datasett for eksperimentell.
- Legg lengdene av de segmentene til å bestemme hvilke Undersegmenter skal inkluderes i den videre analysen. Studien vurdert vi et fartøy segment bestående av 1 av interne arteria subclavia proksimale av carotis T og 2,5 av arterien cerebri distale av carotis T. Deretter Legg volumene for å fastslå fartøyet volumet av definerte fartøyet segmentet.
Representative Results
Virtuelle rekonstruksjonen av 3-dimensjonale intrakranielt vaskulær treet
3-med rekonstruert intrakranielt vaskulær trærne gitt en svært nøyaktig vascular anatomi (figur 1). For å vurdere nøyaktigheten, vi utført en diameter-baserte sammenligning fartøyet diameter bestemt mikroskopisk og de 3-dimensjonale virtuelle rekonstruksjoner på 2 anatomisk definerte poeng (1: venstre arteria cerebri (MCA) 1 mm distale av den carotis T; 2: rett MCA 1 mm distale av carotis T). For mikroskopiske fastsettelse av fartøyet diameter, ble et høyoppløselig kamera (uendelig X-21, Deltapix) med DeltaPix innsikt programvareversjon 2.0.1 kalibrert til en mikrometer skala brukt. For denne evaluering, ble 10 hjerne prøver (5 SAH, 5 humbug) analysert. Dette var fra en rekke 12 mus, i 7 som en SAH ble indusert, mens 5 gjennomgikk humbug kirurgi (2 dyr av gruppen SAH døde postoperativ dager 1 og 2, henholdsvis). Det var ingen betydelige forskjeller mellom diameter mikroskopisk og nesten, som angir en nøyaktig virtuelle rekonstruksjonen av intrakranielt vascular anatomi (mikroskopisk besluttsomhet vs virtuelle rekonstruksjonen, mener ± standardfeil: venstre MCA 150 ± 9 µm vs venstre MCA 150 ± 8 µm; akkurat MCA 153 ± 8 µm vs154 ± 9 µm, se figur 2).
Kvantifisering av cerebral vasospasme i mus med SAH
For å kvantifisere cerebral vasospasme, (i) volumet av en forhåndsdefinert representant 3,5 fartøyet segment, bestående av 1 mm interne arteria carotis (ICA) og 2,5 MCA til venstre, og (ii) fartøy diameter på 2 anatomisk definerte poeng (venstre og høyre MCA) var i hjernen prøver fra SAH og humbug-opererte dyr (n = 5). Fartøyet volumet var betydelig lavere i SAH sammenlignet med humbug (36 ± 4 nL vs 71 ± 9 nL, p < 0,05). Fartøyet diameter var lavere i SAH sammenlignet med humbug (venstre MCA: 140 ± 11 µm vs 160 ± 10 µm, p = 0,11; rett MCA: 130 ± 16 µm vs 158 ± 13 µm, p < 0,05; se Figur 3), mens nivå av betydning var bare nådd for analysere er høyre MCA.
Figur 1. Virtuelle rekonstruksjonen av intrakranielt vaskulær treet. (A) viser et representativt hjernen eksempel; (B) viser den tilsvarende nesten rekonstruert vascular tree. (C) fargekodet visualisering av diameteren på venstre MCA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Nøyaktigheten av digitale gjenoppbyggingen av er blodkar. Gjennomsnittlig diameter målt fra 3D rekonstruert hjernen prøver sammenlignet med de bestemt mikroskopisk. Dataene vises i gjennomsnittlig ± standard feil av gjsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Fartøyet volum og fartøy diameter etter SAH. (A) sammenligning av MCA diameter målt fra 3D rekonstruert blodkar i SAH og humbug mus. (B) fartøy volum i SAH og humbug mus. Dataene vises i gjennomsnittlig ± standard feil av gjsnitt. p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Murine SAH modeller er et viktig verktøy for grunnleggende SAH forskning. Cerebral vasospasme brukes ofte som et sluttpunkt i eksperimentelle studier undersøker mekanismer fører til DCI etter SAH9,11. Men er kvantifisering av cerebral vasospasme i mus eller annet liten dyr modeller av SAH utfordrende. Vanligvis er vasospasme kvantifisert ved ex vivo fastsettelse av fartøyet diameter på definerte anatomiske punkter etter endovascular perfusjon og støping7,9,12 eller ved fastsettelse av omkrets av definerte skip histologiske seksjoner10,11. Men disse metodene har noen ulemper: vasospasme evalueres bare på definerte anatomiske punkter; vasospasme i nabolandet fartøyet segmenter kan unnslippe evaluering. Histologiske gjenstander presenterer en annen kilde til feil. Videre kan evaluering være ganske subjektiv, fordi den nøyaktige plasseringen der fartøyet diameter måles bestemmes av etterforskeren.
Målet var derfor å etablere en metode som quantifies cerebral vasospasme ved å beregne fartøyet volumet av hele cerebral fartøyet segmenter cross-sectional bildebehandling data7. Den viktigste fordelen med volumetriske metoden som presenteres her er at hele fartøyet segmenter kan undersøkes. Dette unngår behovet for definisjonen av et punkt der fartøyet diameter måles. Enda en fordel av evalueringen av hele fartøyet segmenter er at den antagelig presenterer en mer objektiv parameter for å kvantifisere vasospasme enn bestemmelse av fartøyet diameter på definerte punkter hvor vasospasme av mer proksimale eller distale fartøyet kan unnslippe evaluering. Digital representasjon av fartøyet diameter med en fargekode lar en intuitiv vurdering av graden av vasospasme. Videre fører volumetriske evaluering til større forskjeller mellom vasospastic fartøy forhold til evaluering av fartøyet diameter som vist i representant resultatene. Den virtuelle rekonstruksjonen oppnådd med metoden presenteres her gjenspeiler den vascular anatomien nøyaktig. Dette vises av evalueringen av representant serien, hvilke fartøyet diameter målt mikroskopisk og fra de digitale rekonstruksjoner var lik, reprodusere observasjoner av en tidligere studie7. Men til tross for sine fordeler, er videre studier nødvendig for å evaluere hvorvidt metoden presenteres her er bedre enn konvensjonelle metoder for vasospasme analyse.
En begrensning av metoden presenteres her er at den gir mer tid i forhold til microscopic analyse av støpt hjernen prøver eller histologiske analyse (mikro CT skannetid 90 minutter per hjernen prøve, databehandling 45 min per hjernen prøve). Videre kan tilgjengeligheten av mikro CT skanner begrense sin søknad. Antall dyr undersøkt her var tilstrekkelig til å demonstrere gjennomførbarheten av protokollen beskrevet i dette manuskriptet. Men hvis protokollen skal brukes i behandlingsstudier, basert dyr ville ha skal beregnes på de forventede effektene på fartøyet volumer og diameter. En annen begrensning av dette og andre studier med murine SAH modeller er at vasospasme bestemt ex vivo. Dette gjør longitudinelle studier umulig som undersøke opprinnelige verdier før SAH induksjon og vasospasme på ulike tidspunkt. Selv om studier har vist at det er mulig å skildre anatomi av store intrakranielt blodårene i mus i vivo bruker magnetisk resonans tomografi18, beregnede tomografi angiography19eller digital subtraksjon angiography20, disse metodene, til vår kunnskap, har ennå ikke blitt brukt til å analysere cerebral vasospasme i murine SAH modeller i vivo. Av notatet er digital gjenoppbyggingen av hjerne blodkar med påfølgende volumetriske evaluering av cerebral vasospasme presenteres her ikke begrenset til bruk på ex vivo mikro CT data. Om høyoppløselige vaskulær kryss seksjon hjernen imaging i mus skal bli tilgjengelig i fremtiden, kan den brukes til å utføre en volumetric analyse av vasospasme i vivo.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien er en del av doktoravhandling av T. Pantel, presentert for medisinske fakultetet av Johannes Gutenberg-universitetet i Mainz. Studien ble støttet av Friedhelm frigjør Stiftung og Stiftung Neurochirurgische Forschung (tilskudd til an).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medetomidin | Pfizer, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
| Midazolam | Ratiopharm, Ulm, Germany | n.a. | |
| Fentanyl | Curamed, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
| Venofix 21G | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | n.a. | 21G cannula |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4 | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | D8662 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | 100496 | |
| Microfil MV-122 | Flowtech Inc., Carver, MA, USA | n.a. | Radiopaque |
| Micro-CT system Y.Fox | Yxlon, Garbsen, Germany | n.a. | |
| Reconstruction Studio software version 1.2.8.1 | TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany | n.a. | Reconstruction software |
| Amira software version 5.4.2 | FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA | n.a. | Visualization software |
| PHD ultra syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3 | Pressure controlled pump |
| anatomical forceps (blunt) | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 160323_v | |
| Infinity X-21 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | high resolution camera |
| DeltaPix Insight software version 2.0.1 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | |
| C57BL6 mice | Charles River, Cologne, Germany |
References
- Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
- Dorsch, N. A clinical review of cerebral vasospasm and delayed ischaemia following aneurysm rupture. Acta Neurochirurgica Supplement. 110 (Pt 1), 5-6 (2011).
- Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: Proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Friedrich, B., et al. CO2 has no therapeutic effect on early microvasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), e1-e6 (2014).
- Friedrich, B., Muller, F., Feiler, S., Scholler, K., Plesnila, N. Experimental subarachnoid hemorrhage causes early and long-lasting microarterial constriction and microthrombosis: An in vivo microscopy study. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (3), 447-455 (2012).
- Terpolilli, N. A., et al. Nitric oxide inhalation reduces brain damage, prevents mortality, and improves neurological outcome after subarachnoid hemorrhage by resolving early pial microvasospasms. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (12), 2096-2107 (2016).
- Neulen, A., et al. A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data. PLoS One. 12 (2), e0172010 (2017).
- Schuller, K., Buhler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (81), e50845 (2013).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 136-140 (2009).
- Momin, E. N., et al. Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).
- Froehler, M. T., et al. Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic. Journal of Clinical Neurocience. 17 (9), 1169-1172 (2010).
- Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).
- Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm. British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).
- Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. Journal of Neuroscience Methods. 190 (2), 164-170 (2010).
- Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. Journal of Neuroscience Methods. 221, 70-77 (2014).
- Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurological research. 24 (5), 510-516 (2002).
- Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M.
- Marjamaa, J., et al. Mice with a deletion in the first intron of the Col1a1 gene develop dissection and rupture of aorta in the absence of aneurysms: High-resolution magnetic resonance imaging, at 4.7 T, of the aorta and cerebral arteries. Magnetic Resonance in Medicine. 55 (3), 592-597 (2006).
- Schambach, S. J., et al. Ultrafast high-resolution in vivo volume-CTA of mice cerebral vessels. Stroke. 40 (4), 1444-1450 (2009).
- Figueiredo, G., et al. Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice. Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).
