Summary
Dit protocol beschrijft een eyeblink conditioning paradigma geschikt voor experimenten met een-jaar-oude zuigelingen. Commerciële of op maat gemaakte apparatuur kan worden gebruikt voor het leveren van de prikkels en gegevensverzameling en analyse moet worden verricht op de video-opnamen.
Abstract
Klassieke eyeblink conditioning (EBC) verwijst naar de geleerde associatie tussen een geconditioneerde stimulus (een auditieve Toon) en een unconditioned stimulus (een trekje van lucht naar het hoornvlies). Eyeblink conditionering is vaak experimenteel gebruikt voor de opsporing van afwijkingen in de cerebellaire-afhankelijke leren en geheugen, dat ten grondslag ligt aan dit soort associative leren. Terwijl experimenten bij volwassenen en oudere kinderen relatief eenvoudig zijn te beheren met behulp van commerciële apparatuur, is eyeblink conditionering bij zuigelingen meer uitdagende als gevolg van hun slechte naleving, waardoor de juiste positionering van de apparatuur moeilijk. Om te bereiken conditionering in een-jaar-oude zuigelingen, kan een op maat of een aangepast commercieel systeem worden gebruikt voor de lucht bladerdeeg naar de zuigeling hoornvlies. De belangrijkste uitdaging ligt in het succesvol opsporen en classificeren van de gedragsmatige reacties. Wij rapporteren dat geautomatiseerde knipperen detectiemethoden onbetrouwbaar in deze populatie, en dat experimenten conditioning moet worden geanalyseerd met behulp van frame-voor-frame analyse van aanvullende videocamera opnamen. Deze methode kan worden toegepast te bestuderen developmental veranderingen in eyeblink conditionering en te onderzoeken of dit paradigma kinderen met neurologische stoornissen detecteren kan.
Introduction
EBC is een vorm van klassieke conditionering, die wordt gebruikt bij het beoordelen van leren en geheugen bij mensen en andere dieren. De conventionele EBC paradigma verwijst naar een geleerde associatie tussen een onschuldig 'geconditioneerde' stimulus (een auditieve tone) met de 'onvoorwaardelijke' stimulus (een hoornvlies lucht trekje dat een reflexieve eyeblink, de unconditioned-reactie induceert). Associative leren is beoordeeld door de presentatie van de geconditioneerde stimulus en eyeblinks te classificeren, zoals airconditioning en unconditioned reacties-een stijging in het aantal geconditioneerde reacties na verloop van tijd, of over meer dan één sessie, kan duiden op associatieve leren plaatsvindt.
De eyeblink conditioning paradigma kan identificeren van individuen met associative leren bijzondere waardeverminderingen worden gebruikt. Vertraging conditioning-waar de geconditioneerde stimulus (CS) aanvangt vόόr maar overlapt de stimulus unconditioned (VS)-wordt beheerd door cerebellaire circuit1,2, en bij volwassenen en kinderen met neurologische stoornissen, wordt verstoord inclusief schizofrenie3, Autisme4,5, en foetaal alcohol spectrum disorder6,7. Vanuit het oogpunt van klinische onderzoeken eyeblink conditioning bij zuigelingen mogelijk ondersteuning voor eerdere opsporing en behandeling van deze neurologische aandoeningen. Echter, terwijl oudere kinderen een hoornvlies lucht bladerdeeg6,7,8 tolereren kunnen en kunnen een stabiele hoofd/ooghoogte voor de duur van het experiment worden bijgehouden, zuigelingen zijn minder compatibel en conventionele eyeblink detectie apparatuur en software is niet voldoende.
Hier beschrijven we een eenvoudig protocol om te onderzoeken van korte-vertraging eyeblink conditioning in één-jarige kinderen, die aangepast vanuit protocollen is eerder elders beschreven9,10,11. Dit protocol kan worden beheerd met behulp van een commerciële of op maat gemaakte systeem geschikt voor het leveren van een gecontroleerde trekje van lucht naar het hoornvlies. Echter, in plaats van commerciële eyeblink detectie software (bijvoorbeeldvan de San Diego Instrument EyeBlink Detection System, die signalen van een infrarood camera verwerkt), wij, en anderen9,10,11, raden frame-voor-frame analyse van video camera opnames op te sporen en eyeblink reacties in een-jaar-oude zuigelingen te classificeren.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de noordelijke B gezondheid en handicap ethisch comité, referentienummer: 13/NTB/181.
1. technische voorschriften
- Gebruik een luchtbox bladerdeeg staat van het beheer van een trekje van lucht rechtstreeks naar het hoornvlies. Dit kan worden bereikt met behulp van een flexibele buis aangesloten op een lucht tank via een luchtcompressor. De zuigeling om veiligheid te garanderen, past dit met een instelbare drukregelaar die luchtdruk beperkt en grenzen lucht bladerdeeg duur.
Opmerking: Commercieel beschikbare systemen nemen de compressor binnen het systeem, en vereisen geen een lucht tank. - Gebruik een verstelbare hoofdband of de hoed die kan worden gedragen door het kind en maakt het mogelijk passende plaatsing van het lucht-puff buizen naast het oog.
- Twee draagbare audio luidsprekers met regelbaar volume instellingen instellen.
- Ontwerpen en instellen van computationele controle van de apparatuur zodat het bladerdeeg Toon en lucht kan automatisch worden beheerd, met precieze timing en verschillende tussenpozen.
- Een draagbare video-camera met ten minste een beeldfrequentie van 60-Hz instellen handmatig opnemen eyeblink reacties. Gebruiken voor het meten van responstijden, een video camera die het proces begin, vangen kan door het opnemen van het hoorbare Toon of door het filmen van een proef begin-indicator in het softwarepakket geprogrammeerd.
- Installeren en uitvoeren van een video-editing software waarmee frame-voor-frame intensivering van zowel video als audio componenten (bijvoorbeeldAdobe Premiere Pro) waarmee de onderzoeker voor het meten van het tijdsinterval tussen de stimulus en de respons van het knipperen.
2. experimentele paradigma
- Beheren van proeven in blokken van 10. Elk blok moet de volgende proef typen bevatten.
- Omvatten acht gepaarde proeven, waar elke leren-proef bestaat uit een 750-ms Toon (80 dB, 1 kHz) dat overlapt en eindigt met een 100-ms lucht bladerdeeg (~1/20 psi)9,10,11.
- Omvatten een ongepaard proces, dat bestaat uit een enkele 750-ms Toon alleen in de afwezigheid van het bladerdeeg lucht om te testen op een antwoord van de geconditioneerde eyeblink met associative leren gepresenteerd.
- Omvatten een somatosensorische proces bestaande uit een enkele 100-ms lucht bladerdeeg proces gepresenteerd alleen in de afwezigheid van de Toon om te testen voor hoornvlies gevoeligheid voor het lucht-bladerdeeg en de juiste positionering van de hoofdband.
- Het interval tussen opeenvolgende proeven randomize (b.v., 8-16 s, met een gemiddelde proef tijdsinterval van ongeveer 12 s)9,10,11.
- Meet vijf opeenvolgende blokken (dat wil zeggen, een totaal van 50 proeven) in een enkele sessie, voor een totale sessieduur is ongeveer 12 min.
- Om te testen of airconditioning aanhoudt, beheren twee EBC sessies van 50 proeven ten minste 1 h uit elkaar.
3. de testprocedure
- EBC in een matig verlichte ruimte (~ 300 lux) met consistente verlichting niveaus tussen experimenten uitvoeren.
- Plaats de twee draagbare sprekers aan weerszijden van de zuigeling, ongeveer 40 cm aan beide zijden van het hoofd.
- De op maat gemaakte hoofdband plaats op de zuigeling hoofd en aangepast aan de grootte van het hoofd.
- Plaats de flexibele buis houdt de lucht bladerdeeg mondstuk en de aangrenzende infrarood sensor zodat dit ongeveer 1-3 cm vanaf het rechteroog van het kind in een hoek van de ~ 45° van het axiale vlak van het hoofd (Figuur 1 zijn).
- Controleer voordat u begint met het experiment, dat de experimentele opstelling is geoptimaliseerd voor het leveren van de cornea lucht bladerdeeg. Leveren van een single-test-air bladerdeeg voor de zuigeling oog en observeren of een eyeblink plaatsvindt en zichtbaar op de videocamera is. Indien geen eyeblink wordt waargenomen, passen de hoofdband positionering zodat het bladerdeeg luchtbox dichter bij het oog is.
- Het opnemen van de zuigeling eyeblink reacties tijdens de gehele duur van het experiment. Plaats de videocamera zodat het gezichtsveld is gericht op de zuigeling ogen. De camera moet dicht genoeg bij kleine oogbewegingen te onderscheiden, maar niet zo dicht zodat de zuigeling buiten het frame verplaatsen kunt als hij/zij kieskeurig wordt.
- Zorgen voor dat de onderzoekers om de stimulans timing worden gemaskeerd. Als de EBC-gebruikersinterface geeft aan wanneer het volgende proces zal plaatsvinden, vragen de onderzoeker om te oriënteren zich weg van de computerinterface, zodat zij zich niet bewust zijn wanneer de volgende prikkel zal worden geleverd. Dit voorkomt dat de onderzoeker reageert op de stimulus zelf en mogelijk bij te dragen tot de zuigeling aangeleerde reacties.
4. het optimaliseren van de experimentele opstelling voor een-jaar-oude zuigelingen
- Ervoor zorgen dat twee onderzoekers beschikbaar om uit te voeren van het experiment.
- Bij het plaatsen van de hoofdband op de zuigeling, vragen de verzorger om te plaatsen het kind op schoot geconfronteerd met zijwaarts. Hierdoor kan de onderzoeker aan de aanpak van de zijkant en achter de zuigeling hoofd, terwijl een tweede onderzoeker zich bezighoudt met het kind.
- Plaatsen van de hoofdband en positionering van de straalpijp moeten worden uitgevoerd zo snel en zo rustig mogelijk te zijn om de naleving van de zuigeling. Plaatsen van een hand over het uiteinde van de verstuiver voorkomt dat het kind draaien hun hoofd in het mondstuk tijdens de plaatsing.
- Houd de baby op de caregiver's schoot gedurende het gehele experiment.
Opmerking: Hoewel een kinderstoel een meer consistente omgeving tussen experimenten bieden kan, kan dit verhogen van angst en naleving in vele zuigelingen verminderen. - Gebruiken voor zuigelingen geneigd te bemoeien met de hoofdband tijdens het experiment, zachte afleiding.
- De hoofdband is meestal beweegt tijdens het experiment. Als het kind niet meer reageert op de lucht bladerdeeg of de hoofdband is aanzienlijk afgeweken van het oog, onderbreken van het experiment en de hoofdband positie aanpassen voordat u doorgaat.
- Stimuleren van het kind te zoeken tijdens het experiment teneinde de omvang van de bewegingen van de eyeblink; op deze manier kan eyeblink detectie verbeterd worden.
Opmerking: Dit kan worden bereikt door het plaatsen van het kind voor een monitor spelen een kind vriendelijke video (bijvoorbeeld, een cartoon aangepast aan de leeftijd met het geluid uitgeschakeld) iets boven hun lijn van het zicht.
5. Eyeblink detectie met behulp van Video Camera opnamen
- Laat twee onderzoekers onafhankelijk van elkaar definiëren de antwoorden van de eyeblink voor elk experiment.
- Gebruik video-editing software voor het analyseren van elke proef voor een 2.000-ms latency na begin van de proef.
- Gebruiken van de audio golfvorm voor het detecteren van het eerste frame van het verhoor intreden.
- Voor de gepaarde (CS + U.S.) en ongepaarde (alleen CS) proeven, proef begin vanaf het begin van het hoorbare Toon definiëren.
- Uitvoeren voor de somatosensorische proeven waar alleen de VS (lucht bladerdeeg) is gepresenteerd, pretesting om ervoor te zorgen dat de camera microfoon het lawaai van de subtiele 100-ms gemaakt door het bladerdeeg lucht kan detecteren. Anders, video-opname van de indicator van de proef begin geprogrammeerd in de software pakket helpt bij de opsporing van het intreden van lucht bladerdeeg.
- Gebruiken de videotrack voor het detecteren van de blink-reactie. Blink latency als beide volgt opnemen: Blink begin-het eerste frame de oogleden begint te sluiten; Knipperen piek-het eerste frame waarbij de oogleden zijn maximaal gesloten.
- Zo nodig, strategieën voor het afhandelen van onduidelijke reacties. Zie de volgende voorbeelden.
- Redelijk uitsluiten gedeeltelijke knippert, die zich voordoen kunnen wanneer de oogleden niet volledig sluiten door meer dan ~ 50%.
- Uitsluiten proeven waar het begin van de bladerdeeg Toon/lucht is verborgen door omgevingsgeluid, of waar de blink-reactie is verduisterd van uitzicht, vanaf de verdere analyses.
- Analyseren in proeven waar meerdere knippert in acht worden genomen, de eerste reactie van de knipperen na verhoor begin.
- Het registreren van het aantal videoframes tussen het begin van de stimulus en de piek knipperen. Zet de latentie in real-time op basis van de sampling-snelheid van de videocamera.
6. EBC reactie classificatie
- Na het opsporen van bepalen deze proeven waarin een eyeblink reactie is opgetreden, welk type van knipperen, op basis van de latentie ten opzichte van het begin van de stimulus (Figuur 2).
- Een knipoogje definiëren als een reactie schrikken als het zich binnen de eerste 200-ms interval na de Toon voordoet; Deze vertegenwoordigen een reflex reactie op de auditieve Toon of knippert die toevallig zijn getimed met Toon begin die onafhankelijk van het lucht-puff zou hebben plaatsgevonden.
Opmerking: Schrikken reacties kunnen worden waargenomen voor de gepaarde (CS + U.S.) of ongepaarde (alleen CS) proeven, waar de auditieve Toon worden afgeleverd. - Definieer een knipoogje als somatosensorische reactie als het plaatsvindt in reactie op het bladerdeeg lucht; het geeft aan of het hoornvlies gevoelig voor het lucht-puff met de huidige configuratie van de zendspoel is. Dit is een soort unconditioned reactie (zie hieronder).
- Definieer unconditioned reacties als somatosensorische reacties op de lucht bladerdeeg tijdens gepaarde (CS + U.S.) proeven die meer dan 650 ms na het begin van de Toon optreden.
- Geconditioneerde reacties definiëren als knippert die optimaal te laten samenvallen met de lucht bladerdeeg zijn getimed. Ze zijn geïnitieerd tussen 350 tot 650 ms na het begin van de Toon voor de gepaarde of ongepaarde proeven en aangeven dat associatief leren tussen de CS en de VS kan hebben plaatsgevonden.
- Definiëren van een proces als mislukt reacties als geen knipoogje werd ontdekt in reactie op het bladerdeeg lucht; Deze kunnen worden waargenomen voor de gepaarde (CS + U.S.) proeven of de somatosensorische proeven. Deze reacties geven aan dat het lucht-puff is niet het bereiken van het oog.
- Een knipoogje definiëren als een reactie schrikken als het zich binnen de eerste 200-ms interval na de Toon voordoet; Deze vertegenwoordigen een reflex reactie op de auditieve Toon of knippert die toevallig zijn getimed met Toon begin die onafhankelijk van het lucht-puff zou hebben plaatsgevonden.
7. analyse van de Associative leren
Opmerking: Een aantal methoden zijn eerder beschreven om te beoordelen van de associative leren9,10,11 (kort beschreven hier). Onderzoekers moeten deze methoden wijzigen of ontwikkelen hun eigen om te definiëren of associative leren heeft plaatsgevonden, afhankelijk van hun experimentele design.
- Eerst proeven waarin geen bruikbare gegevens was verzameld, zoals die met technische fouten uit te sluiten.
- Bereken de gevoeligheid voor het lucht-puff door berekening van het percentage van eyeblink reacties uit alle mogelijke somatosensorische proeven.
- Beoordelen of associative leren tijdens het experiment opgetreden door het vergelijken van het percentage van geconditioneerde reacties in opeenvolgende blokken van 10 proeven. Een toename van het percentage van geconditioneerde reacties in de loop van het experiment kan duiden op conditionering is opgetreden.
Opmerking: U kunt ook modelleren van de verandering in eyeblink latencies na verloop van tijd kan worden gebruikt om te beoordelen of het kind is hun reactietijden in de loop van het experiment aangepast. - Beoordelen of associative leren in experimentele sessies of tussen twee experimentele groepen plaatsvindt. Gebruik een willekeurige criterium om te bepalen of airconditioning heeft plaatsgevonden (bijvoorbeeld, > 40% geconditioneerde reacties binnen een experimentele sessie)6,9.
Representative Results
Testbaarheid van Eyeblink conditionering in een-jaar-oude zuigelingen:
De experimentele opstelling vereist te onderzoeken eyeblink conditionering is een uitdaging voor een-jaar-oude zuigelingen. In de experimenten die wij hebben gevoerd, 35% (11 baby's) niet deelnemen aan het experiment omdat ze niet tolereren zou, het dragen van een hoofdband of ontvangen van het bladerdeeg lucht aan het hoornvlies (n = 31 zuigelingen geprobeerd). Ongeveer de helft (52%, n = 16 zuigelingen) voltooid of gedeeltelijk voltooide de eerste set van 50 proeven (mediaan [IQR] = 22,5 [0 - 50] proeven voltooid). De rest deelgenomen aan twee experimentele sessies.
Verwezenlijking van betrouwbare experimentele resultaten vereist juiste positionering van de hoofdband en lucht bladerdeeg eenheid gedurende het gehele experiment. Voor die kinderen die in het experiment meedoen, kan lucht bladerdeeg levering aan het hoornvlies worden bereikt voor de meerderheid van de proeven (77 ± 6% van de lucht soezen veroorzaakte een knipoogje reactie; n = 13 zuigelingen/557 lucht bladerdeeg proeven geprobeerd). De resterende proeven vertegenwoordigen 'failed proeven' waarin het kind niet gevoelig voor het lucht-bladerdeeg was.
Figuur 3 toont lucht bladerdeeg levering succes tijdens twee conditionering experimenten van 50 proeven. Het aantal waargenomen eyeblinks wordt beschreven als een percentage van lucht bladerdeeg proeven (d.w.z., gepaarde of somatosensorische proeven). Reacties van de eerste baby afname van elk opeenvolgend blok van 10 proeven, die aangeeft dat de hoofdband zijn sub optimaal aan het einde van het experiment geplaatst kan te knipperen. In tegenstelling, illustreert het tweede kind relatief goede gevoeligheid voor het lucht-bladerdeeg, met ten minste 90% van de lucht bladerdeeg proeven met succes het opwekken van een reactie knipperen in elke latere blok van 10 proeven.
Eyeblink succes opsporingstarieven met behulp van Video Camera analyse:
Een hand-held video camera biedt een betrouwbare methode voor het vastleggen van eyeblink reacties doordat de onderzoeker voor het handmatig bijhouden van de zuigeling ogen. Handmatige analyse van de frame-voor-frame werd gebruikt voor het identificeren van de antwoorden van 90 ± 3% van proeven (n = 13 zuigelingen/608 proeven geprobeerd). De resterende proeven vertegenwoordigen waarin de zuigeling ogen waren verduisterd tijdens het filmen.
Hoewel videoanalyse subjectieve interpretaties vereist, kan deze methode worden gebruikt voor het betrouwbaar meten van eyeblink latency vanaf het begin van de stimulus. Onze analyse van blink reactietijden gemeten door twee onafhankelijke waarnemers illustreert goed inter rater betrouwbaarheid waarbij het gemiddelde verschil tussen de metingen 28.4 ms en 95% grenzen van akkoord van ± 263.9 ms was (Figuur 4: n = 4 experimenten geanalyseerd door twee waarnemers/94 knipperen reacties). Gezien het feit dat de geconditioneerde eyeblinks worden gedefinieerd als degenen die binnen een venster van de 300-ms vallen, hierdoor voldoende nauwkeurig te onderscheiden geconditioneerde van unconditioned reacties. Merk op dat deze proeven met aanzienlijke meningsverschillen gemakkelijk geraamd na overleg tussen de waarnemers kunnen.
Eyeblink Conditioning in een-jaar-oude zuigelingen:
De twee conditionering experimenten weergegeven in figuur 5A en 5B illustreren de eyeblink reactie latencies in de loop van het experiment voor zowel de gepaarde en ongepaarde proeven. De antwoorden van de eyeblink van het eerste kind tijdens de eerste EBC sessie piek na het begin van het lucht-bladerdeeg en buiten het raam van de latency die een geconditioneerde reactie definieert. Bovendien, deze baby niet reageert op een van de ongepaarde (alleen tone) proeven. Samen, dit geeft aan dat dit kind niet heeft geleerd te associëren de Toon en de lucht bladerdeeg tijdens hun eerste blootstelling aan het EBC paradigma. Ter vergelijking, de tweede baby, die met hun tweede zitting van de EBC samenwerkt, routinematig knippert vóór het intreden van lucht bladerdeeg, en reageert op alle de ongepaarde proeven, met vermelding van dat de zuigeling eyeblink conditioning na de eerste sessie van 50 heeft bereikt proeven. Figuur 5C illustreert een typische methode voor de beoordeling van de associative leren over meerdere proeven van sessies6,9,10,11. Het aantal geconditioneerde reacties van beide zuigelingen wordt beschreven in opeenvolgende blokken van 10 proeven en als een percentage van alle gekoppelde en ongepaarde proeven in elk blok. In dit geval beide zuigelingen Toon minimale wijzigingen in associative leren tijdens het experiment, ter illustratie van een gebrek aan conditioning (kind 1, sessie 1) of dat conditionering is gebeurd (kind 2, sessie 2).
Figuur 1 : Eyeblink conditioning set-up met een een-jaar-oude baby deelnemer. De op maat gemaakte hoofdband ondersteunt het bladerdeeg luchtbox wordt weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Stimuli en respons definities voor een eyeblink conditioning paradigma geschikt zijn voor experimenten met een-jaar-oude kinderen. (A) tijdens de gepaarde proeven, een 750-ms hoorbare Toon (geconditioneerde stimulus [CS]) overlapt en eindigt met een 100-ms lucht trekje (unconditioned stimulus [US]). Blink reacties variëren naar gelang van hun timing ten opzichte van het begin van de stimulus (trillen reactie: 0 - 200 ms; geconditioneerde reactie [CR]: 350-650 ms; unconditioned reactie [UR]: 650-2.000 ms). Reactie definities zijn identiek voor ongepaarde (alleen CS) proeven. (B) somatosensorische proeven leveren een lucht van enkele 100-ms bladerdeeg (VS) alleen, en knippert die zich binnen een venster van de 300-ms voordoen zijn geclassificeerd als somatosensorische Reacties (SSR). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Voorbeeld van conditionering van experimenten in een-jaar-oude zuigelingen variatie te illustreren in lucht bladerdeeg gevoeligheid eyeblink. De gevoeligheid voor het lucht-puff wordt omschreven als het aantal waargenomen reacties op het bladerdeeg van de lucht (geleverd als een somatosensorische proces of als een gepaarde proces) als een percentage van alle lucht bladerdeeg proeven, in elke latere blok van 10 proeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Bland-Altman perceel ter illustratie van de overeenkomst in knipperen reactietijden gemeten vanaf videocamera opnamen door twee onafhankelijke waarnemers. Lichtgrijze lijnen geven de bias tussen metingen (gedefinieerd als het gemiddelde verschil tussen de metingen) en de boven- en ondergrenzen van overeenkomst (LOA, gedefinieerd als de gemiddelde verschil ± 1.96 standaarddeviaties). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Voorbeeld van eyeblink conditioning experimenten in een-jaar-oude zuigelingen ter illustratie van de variatie in geconditioneerde reacties. Blink reactietijden worden weergegeven voor de gekoppelde (CS + U.S.) proeven (zwarte cirkels) en ongepaarde (alleen CS) proeven (Grijze vierkantjes). De grijze balk geeft de timing van het lucht-bladerdeeg en de zwarte lijnen geven de latentie tussen 350-650 ms gebruikt voor het definiëren van een geconditioneerde reactie. Proeven die niet wekken een reactie worden weergegeven op de x-as. (A) Blink reacties vallen over het algemeen buiten het raam airconditioning en ongepaarde proeven nagelaten te wekken een reactie van de eyeblink. ()B) Reacties zijn voldoende getimede te laten samenvallen met de uitbraak van het lucht-bladerdeeg en ongepaarde reacties en gepaarde proeven starten een geconditioneerde reactie. (C) Conditioning in de loop van het experiment wordt geïllustreerd als het aantal geconditioneerde reacties (beschreven als een percentage van alle gekoppelde en ongepaarde proeven), in elk opeenvolgend blok van 10 proeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Wijzigingen en probleemoplossing:
Commerciële of op maat gemaakte eyeblink conditioning systemen moet de prikkels voorleggen aan het onderwerp in een experimenteel gecontroleerde manier en kundig voor speurder de gedrags reacties. Hoewel dit is een niet-invasieve procedure, de technische vereisten voor het uitvoeren van deze experimenten in minder compatibel populaties (bijv, zuigelingen) is uitdagend. De hoofd-mount fysiek aansluiten in het oog is mogelijk voor dierproeven, zoals conditioning experimenten in schapen12,13. Oudere kinderen kunnen tolereren het dragen van een hoofdband met een bijgevoegde lucht-bladerdeeg levering unit6,7,8 en kunnen worden aangemoedigd om een constante ooghoogte televisie als een afleiding gebruiken. Hoewel naleving bij zeer jonge zuigelingen kan worden bereikt door conditionering tijdens slaap14, oudere zuigelingen naderen dan één jaar zijn over het algemeen gemakkelijk afgeleid, waardoor ze een unieke uitdagende bevolking. Ondanks de uitdagingen zijn eyeblink conditioning experimenten mogelijk voor sommige wakker, een-jaar-oude zuigelingen. Onze slagingspercentages zijn vergelijkbaar met die eerder gemeld in de literatuur (~ 40% - 50% compliance)9, met de kans op succes waarschijnlijk het gevolg van door de zuigeling temperament op de dag van het experiment.
Kritische stappen binnen het Protocol:
Het is raadzaam een verkrijgbare EBC set-up aan te passen, of met behulp van een op maat gemaakte lucht druk generator zoals eerder is beschreven voor jongere zuigelingen9,10,11. De eerste uitdaging is het handhaven van de lucht-bladerdeeg levering eenheid in de juiste positie gedurende het gehele experiment, waarbij een kleinere, bewerkt zendspoel. Oog veiligheid is een bijzondere zorg voor niet-conforme zuigelingen die proberen de zendspoel om zelf te verwijderen. Daarom, zuigelingen moeten worden nauwlettend te allen tijde. Een deel van de kinderen zullen niet toestaan dat het dragen van de hoofdband of ontvangen van de lucht bladerdeeg voor het oog (hier, ~ 35%), hoewel dit kan worden verbeterd door de zuigeling zachtjes af te leiden als dit is toegestaan door de experimentele protocol en als dit niet openlijk met kind interfereert gedrag. Voor de kinderen die het experiment voltooien, zijn lucht-bladerdeeg-alleen proeven essentieel om te bevestigen dat de zendspoel correct werd gepositioneerd als ontbreken of omkering van conditionering reacties kan worden veroorzaakt door slechte levering van de lucht bladerdeeg gedurende het gehele experiment.
Hoewel handmatige video-analyse tijdrovend is, zijn geautomatiseerde maatregelen van de zuigeling eyeblink reacties momenteel moeilijk te bereiken. Infrarood sensoren geleverd met commerciële EBC set-ups (gepositioneerd op de hoofdband grenzend aan de luchtbox bladerdeeg) Noteer de reflectiecoëfficiënt van moment tot moment van het hoornvlies op een 1-kHz sampling rate en knippert kunnen worden opgespoord door het meten van de verandering in de reflectie na het begin van de stimulus. Belangrijke wijzigingen ten opzichte van de basislijn reflectiecoëfficiënt blijkt dat een eyeblink heeft plaatsgevonden, en geautomatiseerde analyse kan worden gebruikt om te detecteren en te classificeren knipperen reacties. Echter, wij en anderen9,10,11 suggereren dat onderzoekers moeten niet vertrouwen op infrarood hoornvlies reflectiecoëfficiënt metingen voorzien van commerciële EBC set-ups te detecteren knippert bij één-jarige kinderen. Hoewel deze methode mogelijk geschikt voor volwassen deelnemers of oudere kinderen6,7, konden we niet betrouwbaar detecteren knippert in één-jarigen met behulp van deze methode. Hier, wordt te verwaarlozen verandering in de basislijn reflectiecoëfficiënt geconstateerd over de lengte van het verhoor tijdperk, die aangeeft dat de eyeblink niet wordt gedetecteerd door de infrarood sensor. Bovendien worden valse positieve pieken vaak waargenomen, die worden veroorzaakt door de zuigeling hoofdbewegingen die veranderen de positionering van de sensor. Piloot testen bij volwassenen suggereert dat de deelnemer zich concentreren moet op of iets boven de horizontale lijn van het zicht, met de luchtbox voor bladerdeeg gepositioneerd binnen 1-2 cm van het hoornvlies, met succes het detecteren van de eyeblinks-voorwaarden die niet kunnen worden gehandhaafd licht van de zuigeling. Daarnaast kan de grootte van de kleine interpalpebral horizontalis in zuigelingen verminderen hoornvlies reflectiecoëfficiënt, blink detection meer moeilijk dan bij volwassenen of oudere kinderen te maken.
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden:
Ondanks de noodzaak voor handmatige videocamera analyse en de lagere temporele resolutie van een 60-Hz video in vergelijking met metingen van de reflectiecoëfficiënt van 1 kHz maken de verbeterde slagingspercentages van video-opnamen dit een superieure methode de infrarood sensor. Hoewel het hoornvlies lucht bladerdeeg wordt ook geleverd door de dezelfde zendspoel bijlage als een commerciële infrarood sensor, weergegeven stimulans bezorging als veerkrachtiger te plaatsen dan de infrarood sensor, zoals de lucht bladerdeeg sterkte kan worden aangepast als vereist. Dit vermijdt overmatige aanpassing van de hoofdband, die de neiging om de naleving van de zuigeling. Onderzoekers die kunnen bereiken hogere slagingspercentages met behulp van de infrarood sensor wellicht nog ondersteuning van de analyse van de videocamera. Voor de proeven waar er geen antwoord van de detecteerbare eyeblink opgenomen door de infrarood sensor is, video-opnames kunnen onderscheid maken tussen echte antwoorden of ongeldige proeven (dat wil zeggen, of het kind het bladerdeeg luchtbox droeg in de juiste positie, of deed ze niet knipperen, of of de infrarood sensor niet te detecteren het knipperen). Video-opnames zijn ook nodig om te bevestigen van vals-positieve resultaten, zoals bewegingen tijdens het proces kunnen ook produceren artefacten vermomd als knippert. Eye-tracking apparaat15,16 en elektromyografie9,10,14 van de Musculus orbicularis oculi zijn andere geautomatiseerde methoden voor blink detection die buiten het bestek van dit document vallen, Hoewel zonder visuele bevestiging van het bladerdeeg luchtbox positionering voor elk afzonderlijk experiment, deze methoden kans om te lijden van de dezelfde nadelen als de infrarood eyeblink detectie software hier beschreven zijn.
Eerder is gepubliceerde werk op oog-blink conditionering gericht op jongere zuigelingen, meestal 4-5 maanden van leeftijd; Dit werk wordt toegevoegd aan dit orgaan van literatuur door te beschrijven van technieken voor het gebruik met oudere zuigelingen (12 ± 1 maand oud) en de unieke uitdagingen die deze leeftijdsgroep presenteert. Andere auteurs hebben ook gebruikt voor video-analyse (alleen of in combinatie met elektromyografie) met zuigelingen9,10,11,14. De resultaten die hier gepresenteerd in overeenstemming zijn met deze eerdere bevindingen die video frame-voor-frame-analyse is de beste methode suggereren voor het opsporen van eyeblinks in zuigelingen, zoals elektromyografie zowel infrarood toezicht problematisch vanwege gezichts- en hoofd kunnen bewegingen bij zeer jonge kinderen. Dit werk ondersteunt ook de bevinding dat zuigelingen geconditioneerde reacties zelfs op zeer jonge leeftijd, ten minste voor een 650-ms vertraging interval9 ontwikkelen kunnen.
Toekomstige toepassingen:
Zoals een beperkt aantal studies hebben geprobeerd eyeblink conditioning experimenten met menselijke baby's, moeten de parameters van de stimulans zorgvuldig worden overwogen in de toekomst experimenten. Conditionering geconstateerd zo spoedig 10 dagen van leeftijd17 en ten minste binnen de eerste maand van leven14, hoewel een lange onderlinge stimulans interval (bijvoorbeeld1.500 ms) lijkt te zijn succesvoller in deze zeer vroeg stadium van de kinderschoenen18 . Ter vergelijking, kinderen zes maanden van leeftijd naderen kunnen worden betrouwbaarder geconditioneerd met een korter interval10, hoewel minder succesvol dan in volwassenen19. Het 650-ms interval tussen de Toon en de lucht bladerdeeg voorgesteld voor één-jarige kinderen in dit protocol met succes kunnen induceren conditioning in 4 - of 5-maand-oude baby's9,10,11, zo goed als in oudere kinderen6,7. Dit suggereert dat eyeblink conditionering is ontwikkelingsachterstand geregeld, met de optimale vertraging tussen de Toon en de lucht bladerdeeg minderen met zuigeling leeftijd10, hoewel extra experimenten aanpassing van dit protocol zijn vereist om te onderzoeken deze verdere parameters.
Beperkingen van deze techniek:
EBC kan lastig zijn om in te stellen en wellicht problemen oplossen in elke afzonderlijke situatie. Bepalen wanneer conditionering opgetreden is moeilijk te definiëren en best over meerdere proeven of sessies wordt waargenomen. Bijvoorbeeld, hebben andere studies gebruikt een willekeurige conditionering percentage van 40% binnen elk blok van 10 proeven om te definiëren van conditionering en ten opzichte van de wijzigingen tussen opeenvolgende experimentele sessies6,9,10, 11. Succesvolle voltooiing van het vereiste aantal proeven te observeren conditionering kan dus moeilijk te bereiken bij jonge kinderen.
Met betrekking tot de data-analyse, is een van de specifieke uitdagingen stimulus-opgeroepen knippert scheiden van spontane (endogene) knippert9. Het aantal spontane eyeblinks is verschillend tussen individuen maar kan worden beïnvloed door omgevingsfactoren zoals kamer vochtigheid, evenals gedrags Staten. Dubbele knippert optreden wanneer er twee volledige ooglid sluitingen in een zeer korte tijd (bijvoorbeeld, 400 ms)20, en het is mogelijk dat deze spontane knippert die zich op hetzelfde moment als een reflexive weerspiegelen (geconditioneerde of onvoorwaardelijke) eyeblink. We af en toe waargenomen dubbele knippert in onze gegevensverzameling, met behulp van dit protocol, wij en geregistreerde en de latentie om alleen het eerste knipperen. Echter het teruggooien van deze proeven kan verhogen van zekerheid dat de analyse is het vastleggen van stimulus-opgeroepen knippert alleen.
Onderzoekers moet ook om besluiten te nemen op het raam van de latency te definiëren een geconditioneerde of unconditioned antwoord, evenals of latentie om voor te stellen het begin knipperen of het Knipoogje piek (ooglid sluiting). We hebben hier conservatief een geconditioneerde antwoord gedefinieerd als een Knipoogje dat voorafgaand aan 650 ms in gepaarde of ongepaarde proeven, zekerheid pieken dat het knipperen wordt gestart vóór het intreden van lucht bladerdeeg in plaats van in reactie op het bladerdeeg lucht te bieden. Echter kan dit venster latency worden uitgebreid voor ongepaarde proeven waar geen lucht bladerdeeg wordt aangeboden, met name als piek om te definiëren van de latentie van de reactie met behulp van knipperen. Hier de belangrijk beginsel is dat alle instanties worden behandeld op dezelfde wijze, door alle onderzoekers, en dat dit criterium wordt bepaald vóór enige data analyse.
Kortom, kan frame-voor-frame videoanalyse bieden een betrouwbare en reproduceerbare methode voor de beoordeling van de klassieke EBC reacties bij jonge zuigelingen. Deze maatregelen voorzien een maatregel van het leren van gedrag, hoewel een veelomvattende beoordeling gegeven developmental is vereist voor de neurologische ontwikkeling volledig te karakteriseren in kinderschoenen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Nieuw-Zeelandse Optometric visie Research Foundation, het Bureau van de bevordering van de gezondheid, de Universiteit van Auckland faculteit onderzoek Ontwikkelingsfonds, en de Universiteit van Auckland School of Medicine PBRF te financieren.
Wij zijn dankbaar aan de twee optometrie studenten van de Universiteit van Auckland (Shannon Boy en Harpreet Singh) die voltooid de handmatige video analyse te onderzoeken van de overeenkomst in knipperen respons metingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eyeblink conditioning system | San Diego Instruments | Model #2325-0145-W | includes portable airpuff unit and infrared emitter/receiver mounted to adjustable headband; eyeblink stimulus and response detection software; PC interface |
| 4K Ultra HD action camera | RV77 | Model SJ9000 | micro SD/TF card recording 90fps at 720p |
References
- Freeman, J. H., Steinmetz, A. B. Neural circuitry and plasticity mechanisms underlying delay eyeblink conditioning. Learning & Memory. 18 (10), 666-677 (2011).
- Mccormick, D. A., et al. The engram found? Role of the cerebellum in classical conditioning of nictitating membrane and eyelid responses. Bulletin of the Psychonomic Society. 18 (3), 103-105 (1981).
- Bolbecker, A. R., et al. Eye-blink conditioning deficits indicate temporal processing abnormalities in schizophrenia. Schizophrenia Research. 111 (1-3), 182-191 (2009).
- Sears, L. L., Finn, P. R., Steinmetz, J. E. Abnormal classical eye-blink conditioning in autism. Journal of Autism and Development Disorders. 24 (6), 737-751 (1994).
- Oristaglio, J., et al. Children with autism spectrum disorders show abnormal conditioned response timing on delay, but not trace, eyeblink conditioning. Neuroscience. 248, 708-718 (2013).
- Jacobson, S. W., et al. Impaired eyeblink conditioning in children with fetal alcohol syndrome. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 32 (2), 365-372 (2008).
- Jacobson, S. W., et al. Impaired delay and trace eyeblink conditioning in school-age children with fetal alcohol syndrome. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (2), 250-264 (2011).
- Ohlrich, E. S., Ross, L. E. Acquisition and differential conditioning of the eyelid response in normal and retarded children. Journal of Experimental Child Psychology. 6 (2), 181-193 (1968).
- Ivkovich, D., Eckermann, C. O., Krasnegor, N. A., Stanton, M. E. Using eyeblink conditioning to assess neurocognitive development. Eyeblink Classical Conditioning: Volume I. Woodruff-Pak, D., Steinmetz, J. E. , Springer. Boston, MA. 119-142 (2002).
- Klaflin, D. I., Stanton, M. E., Herbert, J., Greer, J., Eckerman, C. O. Effect of delay interval on classical eyeblink conditioning in 5 month old human infants. Developmental Psychobiology. 41 (4), 329-340 (2002).
- Ivkovich, D., Collins, K. L., Eckerman, C. O., Krasnegor, N. A., Stanton, M. E. Classical Delay Eyeblink Conditioning in 4- and 5-Month-Old Human Infants. Psychological Science. 10 (1), 4-8 (1999).
- Nation, K., et al. Video-based data acquisition system for use in eye blink classical conditioning procedures in sheep. Behavior Research Methods. , 1-14 (2016).
- Johnson, T. B., Stanton, M. E., Goodlett, C. R., Cudd, T. A. Eyeblink classical conditioning in the preweanling lamb. Behavioral Neuroscience. 122 (3), 722-729 (2008).
- Reeb-Sutherland, B. C., et al. One-month-old Human Infants Learn About the Social World While They Sleep. Developmental Science. 14 (5), 1134-1141 (2011).
- Kulke, L., Atkinson, J., Braddick, O. Automatic Detection of Attention Shifts in Infancy: Eye Tracking in the Fixation Shift Paradigm. PLoS One. 10 (12), e0142505 (2015).
- Meng, X., Uto, Y., Hashiya, K. Observing Third-Party Attentional Relationships Affects Infants' Gaze Following: An Eye-Tracking Study. Frontiers in Psychology. 7, 2065 (2016).
- Naito, T., Lipsitt, L. P. Two attempts to condition eyelid responses in human infants. Journal of Experimental Child Psychology. 8 (2), 263-270 (1969).
- Little, A. H., Lipsitt, L. P., Rovee-Collier, C. Classical conditioning and retention of the infant's eyelid response: effects of age and interstimulus interval. Journal of Experimental Child Psychology. 37 (3), 512-524 (1984).
- Hoffman, H. S., Cohen, M. E., Devido, C. J. A comparison of classical eyelid conditioning in adults and infants. Infant Behavior and Development. 8 (3), 247-254 (1985).
- Nakanishi, M., Mitsukura, Y., Wang, Y., Wang, Y. T., Jung, T. P. Online Voluntary Eye Blink Detection using Electrooculogram. IEICE Proceeding Series. , (2012).
