Summary
हम नसों और murine मॉडल में इंजेक्शन के इंट्रा-एमनियोटिक मार्गों के माध्यम से utero प्रत्यारोपण (IUT) में एक प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल अद्वितीय प्रतिरक्षा सहिष्णु भ्रूण वातावरण में कोशिकाओं, वायरल वैक्टर, और अंय पदार्थों को लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
utero ट्रांसप्लांटेशन (IUT) में चिकित्सा कि स्टेम सेल, वायरल वैक्टर, या किसी भी अंय पदार्थों जल्दी हमल में शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक अद्वितीय और बहुमुखी मोड है । चिकित्सीय प्रयोजनों के लिए IUT के पीछे तर्क भ्रूण के छोटे आकार पर आधारित है, भ्रूण immunologic अपरिपक्वता, भ्रूण स्टेम या जनक कोशिकाओं की पहुंच और प्रफलन प्रकृति, और एक रोग या लक्षणों की शुरुआत का इलाज करने की क्षमता जंम से पहले । भ्रूण के इन सामान्य विकास के गुणों का लाभ उठाते हुए, एक IUT के माध्यम से टेम स्टेम सेल (HSC) के वितरण की आवश्यकता के बिना सिकल सेल रोग जैसे जन्मजात hematologic विकारों का इलाज करने की क्षमता है जन्मोत्तर HSC प्रत्यारोपण के लिए myeloablative या immunosuppressive कंडीशनिंग आवश्यक है । इसी प्रकार, विकास के दौरान कई अंगों में जनक कोशिकाओं की पहुंच संभावित जीन थेरेपी या जीनोम संपादन के लिए वायरल वैक्टर के एक IUT के बाद स्टेम/जनक कोशिकाओं के एक अधिक कुशल लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है । इसके अतिरिक्त, IUT सहित सामांय विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जा सकता है, लेकिन सीमित नहीं है, immunologic सहिष्णुता के विकास । murine मॉडल एक मूल्यवान और सस्ती IUT की क्षमता और सीमाओं को समझने के पूर्व नैदानिक बड़े पशु अध्ययन और एक अंतिम नैदानिक आवेदन करने के लिए साधन प्रदान करता है । यहां, हम नसों और इंट्रा एमनियोटिक मार्गों के माध्यम से murine भ्रूण में एक IUT प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है के लिए आवश्यक शर्तों और utero टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण, सहनशीलता प्रेरण में पीछे तंत्र स्पष्ट, और utero जीन थेरेपी में ।
Introduction
प्रसवपूर्व स्क्रीनिंग और निदान में हाल ही में अग्रिमों जन्मजात विकारों जो पर्याप्त जन्मोत्तर उपचार के विकल्प और महत्वपूर्ण रुग्णता और मृत्यु दर में परिणाम नहीं है की एक संख्या के लिए भ्रूण के इलाज की संभावना को प्रकाश में लाया है । विशेष रूप से, utero टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण में (IUHCT) और जीन चिकित्सा/जीनोम संपादन करने के लिए भ्रूण के सामांय विकासात्मक गुणों का लाभ लेने के लिए जंमजात hematologic, प्रतिरक्षा, और आनुवंशिक का इलाज करने की क्षमता है जन्मोत्तर HSC प्रत्यारोपण और जीन थेरेपी से अधिक कुशलता से विकारों/जीनोम संपादन1,2कर सकते हैं । विशेष रूप से, भ्रूण के छोटे आकार के कारण, दाता कोशिका या वायरल वेक्टर खुराक प्राप्तकर्ता के वजन के अनुसार अधिकतम किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, भ्रूण की immunologic अपरिपक्वता दाता HSCs myeloablative और immunosuppressive कंडीशनिंग कि जन्मोत्तर प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल में आवश्यक है बिना इंजेक्शन हो सकता है । इसी तरह, वायरल वैक्टर एक चिकित्सीय transgene या जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी ले जाने के लिए या तो transgene उत्पाद या वायरल वेक्टर एक सीमित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बिना इंजेक्ट किया जा सकता है । अंत में, भ्रूण स्टेम/जनक कोशिकाओं की पहुंच और प्रफलन प्रकृति लक्ष्य जनक कोशिकाओं की एक अधिक कुशल transduction की संभावना है, साथ ही जीनोम संपादन के कुछ तरीके (समरूपता-मरंमत निर्देशित) जो साइकिल चालन की आवश्यकता कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक होने के लिए । murine मॉडल के रूप में कार्य करता है एक व्यावहारिक और सस्ती करने के लिए स्टेम सेल जीव विज्ञान और इम्यूनोलॉजी में महत्वपूर्ण सवालों के पूर्व नैदानिक बड़े पशु मॉडल में प्रयोग करने से पहले और पता है, जैसे, प्राथमिक मॉडल के रूप में सेवा की है जिसमें IUHCT और utero में जीन थेरेपी में1,2,3का पता लगाया गया है ।
हालांकि कई चर IUHCT की सफलता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है और utero जीन थेरेपी में/murine और बड़े पशु मॉडल में जीनोम संपादन, एक महत्वपूर्ण चर HSCs या वायरल वेक्टर के वितरण की विधि है । भ्रूण जिगर में होने वाले पहले से गुजारें प्रभाव के साथ दाता HSCs की बड़ी खुराक का वितरण, IUHCT के समय में टेम अंग, माउस और बड़े पशु मॉडल में engraftment के macrochimeric स्तर को प्राप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई होने के लिए दिखाया गया है4 ,5. यह माउस मॉडल में vitelline नस और कुत्ते मॉडल में एक इंट्रा कार्डियक इंजेक्शन के माध्यम से दाता कोशिकाओं के एक इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त किया गया था । इंजेक्शन का मार्ग भी विकास के दौरान विभिन्न अंगों की जनक कोशिकाओं को लक्षित करने में एक मौलिक भूमिका निभाता है । उदाहरण के लिए, vitelline नस के माध्यम से एक नसों में इंजेक्शन एक देर से हमल इंजेक्शन6,7के बाद कुशलता से transduce cardiomyocytes और हेपैटोसाइट्स करने के लिए दिखाया गया है । वैकल्पिक रूप से, वायरल वैक्टर के एक इंट्रा एमनियोटिक इंजेक्शन अंगों के लक्ष्यीकरण की अनुमति देता है कि शारीरिक रूप से भ्रूण तह के आधार पर उजागर कर रहे हैं/ इस एमनियोटिक में वायरल वेक्टर के लिए श्वसन तंत्र को उजागर करता है जो सामान्य भ्रूण "श्वास" आंदोलनों, का लाभ लेने के लिए देर से एक इंट्रा-एमनियोटिक इंजेक्शन के माध्यम से श्वसन उपकला के लक्ष्यीकरण द्वारा सबसे अच्छा उदाहरण है द्रव9. IUT के इन दो मोड, vitelline नस और इंट्रा एमनियोटिक के माध्यम से नसों में, हमारी प्रयोगशाला में कई अतीत और चल रहे प्रयोगों के लिए आधार किया गया है । इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से murine मॉडल में नसों में और इंट्रा-एमनियोटिक IUT प्रदर्शन के लिए तरीकों का वर्णन ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को संस्थागत पशु देखभाल और फिलाडेल्फिया के बच्चों के अस्पताल में उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. इंजेक्शन पिपेट का निर्माण
- एक ऊर्ध्वाधर micropipette खींचने का उपयोग करना, एक १०० µ एल microcapillary पिपेट (चित्रा 1a -1C) खींचो । micropipette खींचने इतना है कि पतला अंत > 1 सेमी लंबा है जांचना ।
नोट: शुरू में, खींचने की सेटिंग एक इष्टतम लंबाई के लिए समायोजित किया जाना चाहिए । एक उच्च गर्मी की स्थापना टिप अब कर देगा, और एक उच्च खींच सेटिंग टिप संकरा का व्यास कर देगा । - पतला अंत इतना काट कि यह ≥ 1 सेमी लंबा है । सुनिश्चित करें कि सुई की नोक पर आंतरिक व्यास ७० µm और १०० µm के बीच है और यह है कि यह उलटा अंत की लंबाई के लिए व्युत्क्रम आनुपातिक है ।
नोट: आंतरिक व्यास भी micropipette खींचने के अंशांकन पर निर्भर करता है । ऊर्ध्वाधर micropipette खींचने या किसी भी पसंदीदा micropipette खींचने के प्रकार के निर्माता से निर्देश देखें । - यह सुनिश्चित करने के बाद कि सुई सही आंतरिक व्यास है, के लिए एक micropipette beveller का उपयोग कर टिप पैनापन द्वारा 15-20 डिग्री के बेवल बनाने के एक हीरे पैनापन पहिया (चित्रा 2a -2c) । करने के लिए बहुत अधिक दबाव के बिना पहिया पर धीरे टिप आराम सुनिश्चित करें, को तोड़ने या टिप खुर की संभावना कम है ।
नोट: एक तूलिका दूर सुई टिप पर बनाता है कि किसी भी मलबे पोंछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । - एक खुर्दबीन के नीचे टिप का मूल्यांकन और यह सुनिश्चित करें कि टिप किसी भी चिप्स या दरारें बिना दौर है । आंतरिक व्यास का पुनर्मूल्यांकन सुनिश्चित करें कि यह ७० µm और १०० µm (चित्रा 2d -2H) के बीच है ।
- सुई के बाकी हिस्सों पर लाइनों ड्रा उन दोनों के बीच मात्रा के 5 µ एल नामित करने के लिए (जैसे, १.३ मिमी की एक आंतरिक व्यास के साथ सुइयों ३.७७ mm वेतन वृद्धि पर तैयार लाइनों होना चाहिए).
- आटोक्लेव सुई पहले शल्य चिकित्सा में उपयोग करने के लिए और उंहें बाँझ दस्ताने के साथ संभाल ।
2. utero इंजेक्शन में
- उन्हें समय से आगे autoclaving कर आवश्यक यंत्र तैयार करें । microinjector सुई धारक, एक शल्य सुई चालक, Adson संदंश, घुमावदार नियमित ऊतक कैंची की एक जोड़ी, एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज, कपास के एक जोड़े-टिप applicators, एक हस्तांतरण पिपेट, एक जोड़ी के रूप में आवश्यक उपकरणों को शामिल करें ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब, और एक 4-0 polyglactin ९१० टांके के पैक ।
- एक बाँझ तकनीक का प्रयोग, सुई धारक को सुई देते हैं और microinjector में प्लग.
नोट: के रूप में इस्तेमाल किया संकुचित नाइट्रोजन की सेटिंग्स का पालन कर रहे हैं: 4-6 साई, शेष 0 साई सुई । क्या इंजेक्शन किया जा रहा है पर निर्भर करता है, विशेष रूप से, injectate की चिपचिपाहट, साथ ही micropipette के आकार, इंजेक्शन टाइम्स ०.३-१.५ एस के बीच बदलती हैं । - बाँझ 1x फॉस्फेट-खारा (पंजाब) के 5-10 µ एल ड्राइंग द्वारा किसी भी संभव मलबे की सुई टिप बाहर साफ और फिर इसे बाहर समाशोधन । इस 2-3x दोहराएं ।
- एक क्लिपर के साथ अपने पेट शेविंग द्वारा सर्जरी के लिए गर्भवती 2-6 महीने की महिला चूहों को तैयार करें । निपल्स नुकसान नहीं सावधान रहो । प्रशासन मौखिक दर्द दवा (जैसे, १०० µ एल के १.५ मिलीग्राम/एमएल meloxicam मौखिक निलंबन प्रति माउस) ।
- इच्छित मात्रा में वांछित सामग्री (कोशिकाओं/वेक्टर/दवा) के साथ सुई भरना शुरू करें । सुई भरते समय सुई टिप को तोड़ने के लिए नहीं सावधान रहें ।
नोट: भ्रूण प्रति इंजेक्शन की मात्रा विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर बदलता है । 20 µ एल कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या (यानी, vitelline नस में 107 कोशिकाओं को इंजेक्शन के लिए अच्छी तरह से काम करता है । उदाहरण के लिए, हम 1 x 107 पूरे अस्थि मज्जा C57BL से अलग कोशिकाओं/6TgN (अधिनियम-EGFP) OsbY01 ["बी 6 ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP)" चूहों vitelline नस के माध्यम से गर्भावधि दिन में-14 बालब/ वायरल वेक्टर इंजेक्शन के लिए, एक 1:1 के 10 µ एल के एक इंजेक्शन के साथ पंजाब के साथ पतला वेक्टर अच्छी तरह से काम करता है । - इंजेक्शन समय जांचना करने के लिए, निंनलिखित कदम उठाने ।
- इंजेक्शन अंशांकन स्क्रीन करने के लिए प्राप्त करने के लिए microinjector पर मोड बटन 3x पुश. 10 या १०० ms के अंतराल जोड़कर इंजेक्शन समय समायोजित करें और मोड बटन 2x धक्का ।
- संतुलन बटन पुश और एक बार पैर पेडल धक्का । अब पेडल फिर से धक्का और कितना मात्रा धक्का प्रति सुई से बाहर खाली है का आकलन. यदि पेडल पुश प्रति 5-20 µ एल की वांछित मात्रा करने के लिए तुले नहीं, कदम 2.6.1 और 2.6.2 दोहराएँ.
नोट: आम तौर पर, यह एक समय में आधा कुल लक्ष्य मात्रा देने के लिए प्रत्येक धक्का जांचना अच्छा है । जबकि यह 30 से अधिक µ एल या कुल मात्रा के भी ४० µ एल इंजेक्षन करने के लिए संभव है, हम आम तौर पर नहीं जाना है 20 µ एल प्रति भ्रूण, नसों या इंट्रा-एमनियोटिक.
- वांछित स्तर तक सुई भरें ।
- 1 L/मिनट और isoflurane vaporizer को 3% करने के लिए ऑक्सीजन flowmeter का समायोजन करके माउस को संज्ञाहरण देने शुरू करते हैं ।
- पुष्टि करें कि क्या माउस पेडल पलटा के अभाव के लिए जाँच द्वारा anesthetized है । एक लापरवाह स्थिति में एक हीटिंग पैड के लिए माउस स्थानांतरण ।
- corneal सुखाना से बचने के लिए स्नेहक आंख जेल लागू करें । पैड के लिए ऊपरी और निचले अंगों टेप द्वारा जगह में माउस को सुरक्षित रखें ।
- तैयारी chlorhexidine के साथ पेट शराब के बाद साफ़ और एक स्थानीय संवेदनाहारी सुई (जैसे, ०.२५% bupivacaine के १०० µ एल) चमड़े के नीचे (चित्रा 3ए) ।
- कैंची के साथ, एक 1-2 सेमी त्वचा चीरा ताकि कम सीमा introitus करने के लिए कोई करीब 1 सेमी से बना है; नीचे प्रावरणी बहुत पतली और पारदर्शी है ।
- प्रावरणी के midline की पहचान करें जो आसपास के क्षेत्र से ज्यादा पारदर्शी है । midline के दोनों ओर झूठ जो अधिजठर जहाजों को घायल करने के लिए नहीं सावधान रहें । अधिजठर वाहिकाओं घायल हो जाना चाहिए, कपास के साथ दबाव-टिप applicators रक्तस्राव को रोकने के लिए पकड़.
- Adson संदंश का प्रयोग, इस तरह आंतों, मूत्राशय, या भ्रूण के रूप में अंतर्निहित अंगों में से किसी को हथियाने के बिना प्रावरणी चुटकी । प्रावरणी को कैंची से खोल कर रखें, इससे किसी भी अंग को नुकसान नहीं पहुंचेगा । एक बार सुरक्षित पेट में, fascial चीरा का विस्तार । इसे अब त्वचा चीरा से बनाओ ।
- आंतों को पेट के ऊपरी भाग में ले जाने के लिए कॉटन-टिप applicators का प्रयोग करें, इस प्रकार gravid गर्भाशय को उजागर करते हैं । गर्भाशय चीरा से बाहर उद्धार, ध्यान से सही और बाएं अंडाशय की पहचान करने के लिए सुनिश्चित सभी भ्रूण (चित्रा 3बी) गिना रहे हैं ।
- बाएँ गर्भाशय को वापस पेट में रखें ताकि केवल सही गर्भाशय सामने आ सके; यह गर्भाशय के सुखाना को रोकता है और गैर-इंजेक्टेड भ्रूण को गर्म रखता है ।
- संचालक गैर प्रमुख हाथ (चित्रा 3सी) के अंगूठे और सूचकांक उंगलियों के बीच सबसे पार्श्व भ्रूण/एमनियोटिक थैली पकड़ो । हमेशा कोमल के रूप में भ्रूण के लिए किसी भी नुकसान का कारण नहीं है ।
- स्थिति विच्छेदन माइक्रोस्कोप (एक 10x आवर्धन आदर्श है) और ध्यान समायोजित इतना है कि भ्रूण को देखने में है । एक बेहतर दृश्य के लिए प्रकाश व्यवस्था को समायोजित करें ।
- उस भाग को पहचानें जो इंजेक्ट किया जाएगा (vitelline नस, amnion) । नसों में इंजेक्शन के लिए, दोनों vitelline नसों और उनके सम्मिलन पहले कल्पना । इंट्रा एमनियोटिक इंजेक्शन के लिए, देखने में सही पक्ष के साथ भ्रूण ओरिएंट ।
- नीचे वर्णित के रूप में सुई के साथ लक्ष्य अंतरिक्ष तक पहुँचने.
- एक नसों में इंजेक्शनके लिए, इस प्रकार है ।
- गर्भाशय को इतना घुमाएं कि vitelline नस जो इंजेक्शन लगाया जा रहा है वह सुई की नोक के समानांतर हो; ध्यान रखें कि इंजेक्शन को दो रगों के सम्मिलन की दिशा में बनाया जाना जरूरी है ।
- एक 5 ° कोण और पियर्स गर्भाशय की दीवार पर गर्भाशय पर सुई रखना । अब जब कि टिप गर्भाशय की दीवार और एमनियोटिक थैली के बीच है, vitelline नस के ऊपर सीधे टिप जगह है ।
- एक लगभग स्पर्श कोण पर, जब तक कि बेवल भेदी और पोत में अग्रिम तक नस पर सुई फिसलना; यह सुई टिप (चित्रा 3डी) में देखा खून की एक फ्लैश से स्पष्ट है ।
नोट: नस तक पहुंचने के रूप में सुई पहले नस पर फिसलना के साथ नस पियर्स नहीं हो सकता है कुछ कोशिश कर सकते हैं ।
- एक इंट्रा-एमनियोटिक इंजेक्शनके लिए, इस प्रकार के रूप में करते हैं ।
- एमनियोटिक थैली घुमाएं और पियर्स के लिए जहाजों से रहित स्थान पाते हैं ।
- गर्भाशय की दीवार को सीधा सुई बिंदु और गर्भाशय के माध्यम से पियर्स, जर्दी थैली, और फिर एमनियोटिक थैली । किसी भी भ्रूण ऊतक के माध्यम से पियर्स नहीं सावधान रहना । सुनिश्चित करें कि सुई अंगों के बीच पारित कर दिया है के रूप में यह पुष्टि की है कि सुई एमनियोटिक थैली में है । फिर इंजेक्शन के साथ आगे बढ़ें ।
- एक नसों में इंजेक्शनके लिए, इस प्रकार है ।
- सामग्री वांछित (आमतौर पर 10-20 µ एल) पैर पेडल धक्का द्वारा उपयुक्त मात्रा इंजेक्षन ।
नोट: क्योंकि इंजेक्टर हर समय माइक्रोस्कोप के माध्यम से सुई टिप के दृश्य को बनाए रखने चाहिए, एक दूसरे व्यक्ति को सुई पर चिह्नों को पढ़ने के लिए इंजेक्शन राशि रखता है और इंजेक्टर को सूचित करना चाहिए कि कितना मात्रा इंजेक्षन करने के लिए छोड़ दिया है । किसी भी भ्रम और देरी से बचने के लिए इंजेक्टर और सहायक के बीच इंजेक्शन से पहले एक चर्चा महत्वपूर्ण है । यह नसों में इंजेक्शन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि सुई की एक देरी हटाने सुई में शिरापरक रक्त की एक backflow और एक गलत खुराक में परिणाम की अनुमति देगा । - एक बार वांछित मात्रा दिया है इंजेक्शन साइट से सुई वापस ले लो । वहां नसों में इंजेक्शन के साथ पोत पंचर साइट से कुछ रक्तस्राव हो सकता है के रूप में, 10-15 एस के लिए सुई के पक्ष के साथ दबाव पकड़ खून बह रहा रोकने के लिए ।
- अगले भ्रूण के लिए आगे बढ़ें । जारी रखें जब तक सही गर्भाशय सींग के सभी भ्रूण इंजेक्शन गया है ।
- पेट से छोड़ दिया गर्भाशय सींग निकालें और पेरिटोनियल गुहा के अंदर वापस सही गर्भाशय हॉर्न की जगह ।
नोट: कभी-कभार, सुई इंजेक्टर के साथ फिर से भरने की जरूरत है । - एक बार सभी भ्रूण इंजेक्ट किया गया है, गर्भाशय पेट (चित्रा 3ई) में बदलें । एक गर्भाशय या आंत्र volvulus से बचने के लिए सुनिश्चित करें ।
- एक डिस्पोजेबल हस्तांतरण पिपेट के साथ, किसी भी समझदार नुकसान की जगह के लिए पेट में 1x पंजाबियों के लगभग 2 मिलीलीटर जगह है ।
- बंद (चित्रा 3F -3 जी) के दौरान अंतर्निहित अंगों को घायल करने से बचने के लिए 4-0 polyglactin ९१० टांके का उपयोग कर एक सतत परत में प्रावरणी और पेट बंद करें ।
- टेप निकालें और एक गर्मी लैंप के नीचे एक पिंजरे में माउस हस्तांतरण । सावधान रहना गर्मी लैंप भी माउस को बंद जगह नहीं है । सुनिश्चित करें कि पिंजरे बिस्तर है, भोजन, और पानी ।
ध्यान दें: एक thermostatically नियंत्रित गर्म चैंबर भी इस्तेमाल किया जा सकता है । जब यह ईमानदार और घूमना है माउस जाग रहा है । - माउस दैनिक निरीक्षण और दर्द की दवा की जरूरत के रूप में दे ।
नोट: हम नियमित रूप से पश्चात दिन 1 और 2 पर meloxicam दे, और दिन पर 3 बार अगर माउस दर्द के लक्षण से पता चलता है । - एक ही इंजेक्शन सामग्री के साथ एक बैच सर्जरी कर रही है, तो बाँझ पंजाबियों के साथ इंजेक्शन सुई साफ । यदि एक अलग सामग्री के साथ इंजेक्शन, एक sharps कंटेनर में सुई के निपटान और एक नई सुई का उपयोग करें ।
नोट: हम किराए की बांध के साथ पिल्ले को बढ़ावा देने की सिफारिश तुरंत जंम के बाद के मामले में बांध के इंजेक्शन के लिए एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया mounts और मां के दूध के माध्यम से पिल्ले के लिए एंटीबॉडी स्थानांतरण ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
अस्तित्व और engraftment IUHCT प्रयोगों के लिए सफलता के महत्वपूर्ण उपाय हैं. एक प्रयोग के विशिष्ट समापन पर निर्भर करता है, भ्रूण है कि एक IUHCT प्राप्त एक सी-खंड या postnatally द्वारा जंम के पूर्व का विश्लेषण किया जा सकता है । औसत पर, नसों में इंजेक्शन के बाद जीवित रहने की दर ७५-१००% से लेकर । इंट्रा-एमनियोटिक इंजेक्शन के बाद जीवित रहने की दर लगभग ८५-१००% पर नसों में इंजेक्शन की तुलना में बेहतर मेले के लिए करते हैं ।
हमारी प्रयोगशाला में, इन तकनीकों में प्रवीणता प्राप्त करने के लिए प्रशिक्षण प्रक्रिया लगभग 8-12 महीने लगते हैं । एक reproducible फैशन में इन इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक कौशल के अधिग्रहण का आकलन करने के लिए, प्रशिक्षुओं भ्रूण अस्तित्व और IUT के बाद कम समय अंक पर दाता सेल engraftment के लिए निगरानी कर रहे हैं । यह निंनलिखित गुणवत्ता नियंत्रण प्रयोगों द्वारा प्रदर्शित किया जाता है । विशेष रूप से, 1 x 107 पूरे अस्थि मज्जा कोशिकाओं C57BL से अलग कर रहे हैं/6TgN (अधिनियम-EGFP) OsbY01 ("बी-6 GFP") चूहों के रूप में पहले वर्णित5 और गर्भावधि दिन में vitelline नस के माध्यम से इंजेक्शन-14 बालब/सी भ्रूण । एक समूह में, IUT एक अनुभवी प्रशिक्षक द्वारा प्रदर्शन किया गया था, और अंय समूह में एक प्रशिक्षु है जो ~ 4 महीने के लिए तकनीक का अभ्यास किया गया है । IUT के बाद काटा भ्रूण जिगर 24 ज के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों चित्रा 4एमें दिखाया गया है भ्रूणों के जिगर जो प्रशिक्षु GFP कोशिकाओं के कम engraftment के कारण कम fluoresce द्वारा IUT प्राप्त किया । इन जिगर तो प्रवाह cytometry द्वारा GFP+ दाता कोशिकाओं के लिए विश्लेषण किया गया engraftment के स्तर को बढ़ाता है । दो इंजेक्टर के बीच मतलब engraftment स्तर में अंतर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4बी) के तहत देखा छवियों के साथ संबद्ध ।
एमनियोटिक द्रव के संपर्क में transduce कोशिकाओं के लिए इंट्रा-एमनियोटिक मार्ग के माध्यम से दिया वायरल वैक्टर की क्षमता उदाहरण transduction (एक एमनियोटिक वेक्टर के एक इंट्रा-GFP इंजेक्शन के बाद उपकला कोशिकाओं ४८ ज के द्वारा किया जाता है ले GFP transgene10) गर्भावधि दिवस में-१२.५ भ्रूण (चित्रा 5 ए और 5B).
चित्रा 1 . micropipette खींचने के साथ एक ग्लास पिपेट सुई बनाने की प्रक्रिया । (क) कांच पिपेट माउंट और यह खींचने के या तो अंत पर डायल करता है कस द्वारा सुरक्षित । (ख) एक बार सुरक्षित, खींच स्विच गर्मी को सक्रिय करता है । दिखाया सेटिंग्स गर्मी कर रहे हैं #1:९८५ और खींचो: 27 । सुरक्षा के लिए इस प्रक्रिया के दौरान डार्क कवर ग्लास को बंद किया जाना चाहिए । यह फोटोशूट प्रयोजनों के लिए खोला गया था । (ग) micropipette को पृथक किया गया है । नीचे भाग को छोड़ें और अगले चरणों के लिए अलग micropipette के शीर्ष भाग ले । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 . micropipette पीसने की प्रक्रिया सुई की नोक आकार करने के लिए । (क) इस पैनल पीस के सामांय सेटअप से पता चलता है । एक प्रकाश स्रोत के लिए खुर्दबीन के नीचे टिप कल्पना की जरूरत है । (बी और सी) एक 15-20 ° कोण पर micropipette माउंट । (घ) मलबे की एक buildup पीसने की प्रक्रिया में उंमीद है । एक तूलिका का उपयोग करने के लिए पीसने की प्रक्रिया का एक बेहतर दृश्य प्राप्त टिप स्पष्ट है । (ङ) किसी भी पहचाने जाने योग्य चिप्स या दांतेदार किनारों के बिना एक अच्छी तरह से जमीन सुई टिप एक 4x आवर्धन के तहत दिखाया गया है । (F, G, और H) एक 10x आवर्धन के तहत जमीन सुई का फिर से निरीक्षण एक तेज टिप और टिप के आसपास चिकनी किनारों के साथ एक अच्छी तरह से जमीन सुई से पता चलता है । अलग कोणों पर सुई की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 . Laparotomy और utero प्रत्यारोपण में । (क) दाढ़ी, anesthetize, और टेप एक गर्भवती बांध और उसके पेट की तैयारी । (ख) laparotomy के बाद, सभी भ्रूण की एक पहचान के लिए पेट के बाहर गर्भाशय की पूर्णरूप से उद्धार । (ग) तीसरी उंगली के साथ तनाव को बनाए रखते हुए सर्जन के गैर प्रमुख सूचकांक उंगली और अंगूठे के साथ भ्रूण स्थिति । भ्रूण के संबंध में माइक्रोस्कोप के तहत सुई की नोक की पहचान. (घ) खून की एक फ्लैश वापस micropipette सुई में बह vitelline नस के cannulation पर देखा जाना चाहिए । (ङ) सभी इंजेक्शनों के पूरा होने के बाद, सभी भ्रूणों को वापस पेट में रखें । (च) 4-0 polygalactin ९१० टांकों का उपयोग करते हुए एक-परत चलने वाली सिलाई के साथ पेट को बंद करें । (छ) एक बार पेट पूरी तरह बंद हो जाने पर बांध को एक ऊष्मा दीपक के नीचे ठीक कर दें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 . एक vitelline नस इंजेक्शन के बाद दाता पूरे अस्थि मज्जा mononuclear कोशिकाओं के Engraftment । (एक) के साथ engraftment की डिग्री में अंतर (प्रशिक्षु) और बिना (प्रशिक्षक) कोशिकाओं के रिसाव स्पष्ट रूप से फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत दिखाया गया है । (ख) प्रतिशत chimerism भी प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा दर्शाए गए समान खोज को प्रतिबिंबित करते हैं. प्रत्येक डेटा बिंदु एक अलग इंजेक्शन भ्रूण से जिगर का प्रतिनिधित्व करता है । प्रयोग एक प्रशिक्षु और एक प्रशिक्षक द्वारा किया गया था । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5 . एक भ्रूण भ्रूण में ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति पैटर्न-GFP के एक अंतरराज्यीय एमनियोटिक इंजेक्शन के बाद एच ४८ । (क) इस पैनल कॉर्निया (लाल तीर) और त्वचा ई पर GFP के साथ दाग से पता चलता है 14.5 ई. के एक इंट्रा-एमनियोटिक इंजेक्शन GFP e 12.5 (e 12.5/ (ख) भ्रूण के पीछे की एक cryosection (पैनल में एक हल्के नीले बॉक्स के साथ संकेत दिया ) एक उच्च आवर्धन पर पता चलता है कि वायरल transduction सतही peridermal कोशिका परत (लाल तीर) और नहीं एपिडर्मिस (महामारी) तक ही सीमित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
utero प्रत्यारोपण में कई जंमजात विकारों कि जल्दी हमल में निदान किया जा सकता है के लिए एक संभावित चिकित्सा है । IUT के लिए murine मॉडल शोधकर्ताओं भ्रूण पर्यावरण का पता लगाने के लिए या विभिन्न उपचारों के साथ प्रयोग करने की अनुमति देता है । क्या इंजेक्शन किया जा रहा है और क्या लक्षित किया जा रहा है पर निर्भर करता है, नसों या utero प्रत्यारोपण में इंट्रा एमनियोटिक वांछित अंतरिक्ष में एक इंजेक्शन के एक विश्वसनीय वितरण प्रदान कर सकते हैं ।
विशिष्ट अंगों को लक्षित करते समय, यह महत्वपूर्ण है भ्रूण के उपयुक्त embryological आयु लेने के साथ ही इंजेक्शन तकनीक । जबकि E14 पर नसों इंजेक्शन hematologic आला लक्ष्यीकरण के लिए आदर्श है, और E16 पर इंट्रा एमनियोटिक इंजेक्शन फेफड़ों लक्ष्यीकरण के लिए आदर्श है, ये केवल उपलब्ध विकल्प नहीं हैं । उदाहरण के लिए, इंट्रा एमनियोटिक इंजेक्शन के रूप में भ्रूण के लिए किया जा सकता है अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन8के साथ E8 के रूप में जल्दी । E9-E1011में अल्ट्रासाउंड-निर्देशित इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन के साथ E14 से पहले प्रणालीगत डिलीवरी भी संभव है । ' भ्रूण विकास के विभिंन चरणों में इंजेक्शन प्रदर्शन की व्यवहार्यता सुरक्षा और जीन स्थानांतरण और सेल प्रत्यारोपण की दक्षता की जांच के रूप में अच्छी तरह से विकास के बुनियादी सवालों की जांच के प्रयोगों के लिए महान क्षमता प्रदान करता है जीवविज्ञान.
इसके अलावा, एक नसों में और इंट्रा-एमनियोटिक डिलीवरी के अतिरिक्त, अन्य साइटों को भी चिकित्सा या वैज्ञानिक सवाल के प्रयोजन के आधार पर लक्ष्यीकरण के लिए उपलब्ध हैं पीछा किया जा रहा है. utero इंट्रामस्क्युलर दृष्टिकोण में पेशी dystrophies12, रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स13के transduction के लिए एक intraspinal दृष्टिकोण के लिए एक जीन हस्तांतरण के लिए इस्तेमाल किया गया है, और जीन स्थानांतरण लक्ष्य के लिए एक intracranial दृष्टिकोण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोगों14. utero टेम कोशिका प्रत्यारोपण, intrahepatic और intraperitoneal मार्गों में के लिए प्रसव के प्रत्येक मार्ग के रूप में अतिरिक्त व्यवहार्य विकल्प है अंततः टेम आला15लक्ष्य । हालांकि, नसों में प्रत्यारोपण मार्ग टेम आला में दाता कोशिकाओं के एक अधिक कुशल होमिंग और दाता कोशिकाओं की एक बड़ी खुराक के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार स्थिर दीर्घकालिक दाता कोशिका engraftment के समग्र उच्च स्तर में जिसके परिणामस्वरूप बिना जोड़ा गया भ्रूण मृत्युदर1.
प्रोटोकॉल हम IUT प्रदर्शन के लिए ऊपर विस्तृत है शक्तिशाली और बहुमुखी उपकरण है कि vivo में एक अद्वितीय के लिए अनुमति का अध्ययन करने के लिए स्टेम सेल जीवविज्ञान, विकासात्मक इम्यूनोलॉजी और immunologic सहिष्णुता प्रेरण, विकास जीव विज्ञान, और जंम के पूर्व जीन थेरेपी/ इन वितरण विधियों भी प्रासंगिक नैदानिक निहितार्थ है और IUHCT के अध्ययन के लिए आधार और पूर्व में utero जीन थेरेपी में किया गया है जैसे कुत्ते और ovine मॉडल4,16के रूप में नैदानिक बड़े पशु मॉडल । वे एक मूल्यवान उपकरण के रूप में सेवा के लिए विकास जीवविज्ञान में नए विचारों का परीक्षण और विनाशकारी जंमजात आनुवंशिक, hematologic, प्रतिरक्षा, और चयापचय विकारों के लिए नए उपचार का पता लगाने के लिए जारी रहेगा ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
References
- Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
- Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
- Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).
- Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).
- Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).
- Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).
- Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
- Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).
- Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).
- Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
- Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).
- Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).
- Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
- Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
- Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).
