Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Наночастицы опосредованной siRNA сайленсинга генов в сердце взрослого человека данио рерио

Published: July 29, 2018 doi: 10.3791/58054
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Beijing Key Laboratory of Cardiometabolic Molecular Medicine, State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Institute of Molecular Medicine, Peking University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Peking University

Summary

Это остается серьезной проблемой разработки условной гена нокаут или эффективным-нокдаун гена в органах взрослых рыбок данио. Здесь мы приводим протокол для исполняющих наночастиц опосредованной siRNA сайленсинга генов в сердце взрослого данио рерио, обеспечивая тем самым новый метод функция потерь для изучения органов взрослых в данио рерио и других модельных организмов.

Abstract

Млекопитающие имеют весьма ограниченные возможности для восстановления сердца после инфаркта миокарда. С другой стороны взрослых рыбок данио восстанавливает свое сердце после резекции верхушки или cryoinjury, что делает его организма важной моделью для изучения регенерации сердца. Однако отсутствие потери функции методов для органов взрослых ограничила идеи в механизмы, лежащие в основе регенерации сердца. Система РНК-интерференции через различные системы доставки является мощным инструментом для сайленсинга генов в клетках млекопитающих и модельных организмов. Мы уже ранее сообщали, что малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц успешно ввести клетки и привести к замечательным нокдаун ген специфического в самом восстанавливающий взрослых рыбок данио. Здесь мы представляем простой, быстрый и эффективный протокол для доставки дендример опосредованной siRNA и сайленсинга генов в самом восстанавливающий взрослых рыбок данио. Этот метод обеспечивает альтернативный подход для определения функции гена в органов взрослых в данио рерио и может быть распространено на другие модели организмов также.

Introduction

Инфаркт миокарда стал серьезной угрозой, приводит к огромным бременем вокруг мира1. Сердце взрослого человека млекопитающих не регенерировать и пополнить потерянные кардиомиоцитов в макроскопических масштабах после травмы, приводит к образованию рубцовой ткани и последующие сердечной недостаточности. В отличие от млекопитающих данио рерио способен регенерации сердца, главным образом через надежные миокарда распространения после различных видов травмы сердца, что делает его организма идеальная модель для изучения молекулярных механизмов регенерации сердца 2,3,4,5,6,,78. Расшифровка местных механизмов базовой регенерации сердца данио рерио является захватывающей области исследований в поисках роман терапевтических стратегий для улучшения человеческого сердца регенерации9.

В zebrafish доступны методы генетической манипуляции. Они состоят из морфолиновая (MO), которые также широко используются в лягушек, цыпленок и млекопитающих, кроме данио рерио10,11,12,13. MO имеет эффективное нокдаун целевого выражения гена в плавник взрослых рыбок данио, мозга и сетчатки14,,1516,,1718,19. К морю нуклеиновых кислот (LNA) является другой искусственный олигонуклеотида, используемый для сбить эндогенного ген выражение не только в zebrafish эмбриона, но и в, органов взрослых животных20,,2122 23 , 24. Однако отсутствие эффективных методов потери функции для взрослых сердец по-прежнему является препятствием в изучение молекулярных механизмов регенерации органов. В настоящее время, мелкомолекулярных ингибиторы или трансгенных выражение Доминант отрицательных мутантов главным образом используются для блокировки функции определенного гена или путь для изучения его функции в взрослых рыбок данио сердце регенерации25,26 ,27. Однако не все гены или сигнальных путей применимы для этих методов.

Вмешательства малые РНК (малые интерферирующие РНК) широко используются для анализа потери функции в mammalian клеток и эмбрионов модельных организмов, а также органов взрослых доклинические исследования в животных моделей28,29,30 , 31 , 32. Малые интерферирующие РНК эффективно использовались для молчание генов в опухоли33,,3435 и кардиомиоцитов36,,3738,39 ,40 через различных систем доставки. Недавно мы разработали эффективных малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц сайленсинга генов в самом восстанавливающий взрослых, используя несколько различных наночастиц41,,4243, обеспечивая новый инструмент для функциональные исследования генов в органах взрослых рыбок данио. Основываясь на наших предыдущих исследований41,42,43, здесь мы представляем простой, практические, но мощный протокол для малых интерферирующих РНК сайленсинга генов в самом восстанавливающий взрослых рыбок данио, с помощью f ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ-PEG-R9 дендримеров. Aldh1a2 (альдегид дегидрогеназа 1, член семьи A2) ген был upregulated после резекции верхушки данио рерио и абляции Aldh1a2 заблокирован сердца регенерации44. Здесь мы берем гена aldh1a2 в качестве примера для проверки эффективности нокдаун гена при посредничестве наночастиц инкапсулированное siRNA инъекции. Этот протокол содержит процедуру для резекции сердце данио рерио, химического синтеза наночастиц и метод доставки на малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц в сердце взрослого данио рерио.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все животные процедуры используется данио рерио протоколом, утвержденным на институциональный уход животных и использования Комитетом в Пекинском университете, который полностью аккредитован ассоциации оценки и аккредитации лабораторных животных уход.

1. Приготовление раствора Tricaine

  1. Подготовить раствор tricaine, добавить 400 мг 3-аминобензоат этиловый метансульфонат порошка 97,9 мл дистиллированной воды и затем добавьте 2.1 мл 1 М трис (рН 9,5) для регулировки рН ~ 7. Хранят раствор при 4 ° C.
  2. Подготовить рабочий раствор tricaine, добавьте 4.2 мл tricaine Стоковый раствор 100 мл аквариумной воды системы.

2. взрослых рыбок данио желудочков резекция

  1. Подготовить инструменты и материалы для хирургии, которые включают кусок губки, чашку Петри, заполнены с работы решения, пластиковая Пипетка, стереомикроскопом, две острые щипцы, ножницы иридэктомия, tricaine и локоть пинцет (рис. 1).
  2. Подготовьте небольшой паз размером 4 x 0,5 см и 0,5 см в глубину на губку провести данио рерио во время операции резекции желудочков.
  3. Заливка, данио рерио танк 3 Л с половиной баком воды системы данио рерио, которая производится с использованием 60 мг/Л морской соли в dH2O для восстановления пострадавшей рыбы.
  4. Анестезировать рыба в 10 см Петри блюдо с tricaine решения до тех пор, пока жабры движение уменьшение на одну секунду и сохранить рыбу по крайней мере 30 s для обеспечения полностью под наркозом.
  5. Передать наркотизированных рыбы с помощью пинцета локоть паз в вентральной стороне влажную губку вверх. Визуально обнаружить разницы бьющееся сердце, а затем найдите сердце под стереомикроскопом.
  6. Используйте ножницы иридэктомия сделать небольшой надрез около 1 мм, что проникает в кожу и мышцы и тщательно слезу серебристые эпителиального пласта перикарда мешка с щипцами советы для доступа к сердце. Не вставляйте щипцы слишком глубоко в полости чтобы избежать травмы сердца.
    Примечание: на данный момент, имейте в виду, чтобы избежать обширными кровоизлияниями. Исключить рыбу из эксперимента, если обширные кровотечение происходит, так как чрезмерное кровотечение вызвано главным образом травмы сердца и таким образом приведет в заблуждение результатов.
  7. Разоблачить желудочка, нежно держа своего апогея с острыми щипцами, используя недоминирующей руки или применяя нежный внутрибрюшного давления. Затем с другой стороны, удалите ~ 20% желудочка на вершине иридэктомия ножницами.
    Примечание: Не обширные кровотечение должно произойти на данный момент.
  8. Используйте влажные салфетки для покрытия разрез, как кровоточить раны обильно за 15-45 s до свертывания, а затем положить рыбу обратно в бак с водой системы.
    Примечание: Нет необходимости в шов надрез.
  9. Убедитесь, что рыба восстанавливает жабры движение в течение 1 мин и затем возобновляет плавательный. Если рыба не показывают жабры движение после 50 s в воде, облегчить его, брызги воды в жабры, используя пластиковые пипетки, пока рыба не возобновит активная вентиляция.
  10. Сохраняйте рыбу в системе рециркуляции после желудочковой резекции.
    Примечание: Без специальных заботится являются необходимыми по сравнению с нормальной рыбы. Уровень смертности взрослых рыбок данио желудочков резекции составляет около 5 – 10%. Почти все смерть происходит в течение 24 часов после операции.

3. Подготовка малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц

  1. Синтезировать f Пэм4-PEG-дендример R9.
    Примечание: Синтез4f-PAM-PEG-R9 дендример материалов была выполнена, как описано выше37 с некоторыми изменениями. Длина α, ω-дипиридиловых disulfido Полиэтиленгликоль (Py-PEG-Py) были сокращены с молекулярной массой 1000 максимизировать инкапсуляции малые интерферирующие РНК (рис. 2B).
  2. Сухие 10 мг Цистамин ядра G4.0 polyamidoamine (называют ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ) с использованием вакуумной сушкой на 45 ° C за 1 час и затем растворить ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ в 2 мл Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS, сбалансированного солевого раствора используется для разнообразных приложений культуры клеток).
  3. Распустить 1.7 мг tris(2-carboxyethyl) фосфин (TCEP) в 1 мл DPBS, смешать с ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ раствор, приготовленный в 3.2 и оставить при комнатной температуре с мягким перемешиванием за 8 ч.
    Примечание: TCEP является десятикратное в молярное соотношение избыток дисульфидными облигаций ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ.
  4. Удалите чрезмерную TCEP, ультрафильтрации. Добавить DPBS в выше ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ-TCEP смесь до объема 10 мл и решение передается в трубку ультрафильтрации (молекулярный вес отрезать) MWCO 3 кДа. После центрифугирования в 3000 g 15 мин отменить решение в коллекции трубки. Добавить DPBS в фильтр устройства до 10 мл и аккуратно пипетки образца несколько раз и снова центрифуги. Повторите этот шаг для 4 раза. После последнего фильтрации аспирационная образец из фильтра устройства.
    Примечание: Результатом этого шага уменьшается ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ (называется f-PAM4).
  5. Распустить 14 мг Py-PEG-Py в 1 мл DPBS, смесь с f-PAM4 раствор и оставить его с мягким перемешиванием при комнатной температуре в течение 3 ч. Затем удалите чрезмерную Py-PEG-Py, ультрафильтрация шаг, как описано в 3.4. После последнего фильтрации аспирационная образец из фильтра устройства.
    Примечание: F-PAM4-PEG-Py называют продукт. Количество Py-PEG-Py десятикратного в молярное соотношение тиоловых групп в f-PAM4.
  6. Растворите 6,4 мг цистеина прекращается R9 пептида (Ac-CRRRRRRRRR-NH2) в 1 мл DPBS, смешать с f-PAM4-PEG-Py и осторожно перемешать за 8 ч при комнатной температуре. Очистки конечного продукта, вызываемый f-PAM4-PEG-R9, ультрафильтрация шаг, как описано в 3.4, за исключением того, что DPBS изменяется в деионизированной воде. Lyophilize продукт с использованием замораживания Вакуумные сушилки.
    Примечание: Продукты в 3.5 и 3.6 перед лиофилизации хранятся в-20 ℃ для по крайней мере 1 месяц. После лиофилизации f-PAM4-PEG-R9 образцы хранятся в-20 ℃ для по крайней мере 2 месяца.
  7. Для определения степени PEG и пептида модификации, растворяют 5 мг f-PAM4-PEG-Py в D2O (окись дейтерия) и передать его в пробирку образца ЯМР (ядерный магнитный резонанс). Спектральный анализ 1H ЯМР на частоте 400 МГц и анализировать данные с помощью ЯМР данные анализа программного обеспечения37.
    Примечание: Специально, представитель ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ пики (- NCH2CH2CO-), PEG пики (- OCH2CH2-) и аргинина остатков пиков (- HCCH2CH2CH2NH-) в пептидов, как ожидается, будет в диапазонах 2,4-2,6, 3,7-3,8 и 1.6-1.8 млн., соответственно. Определите степень модификации PEG и R9 относительно ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ путем вычисления интегралов PEG и R9 пиков на ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ вершины. Степень изменения PEG составляет 100% и изменение R9 по крайней мере 50%. 1H ЯМР Спектральные анализы проводятся в объекте основного учреждения.
  8. Распустить f Пэм4-PEG-R9 дендример порошок в PBS до 4 мг/мл и сделать аликвоты решения для одноразового использования.
    Примечание: Катионные раствор может храниться при температуре-20 ° C по меньшей мере один месяц, без повторил замораживания и оттаивания.
  9. Растворите цианиновые красители с надписью малые интерферирующие РНК (называемых Cy5-siRNA), Aldh1a2 siRNA или омлет отрицательного контроля малых интерферирующих РНК в дистиллированной воде до 10 мкм.
    Примечание: Используйте цианиновые красители с надписью малые интерферирующие РНК для оценки ли наночастиц инкапсулированные siRNA может войти в сердце рыбы (рис. 2A-B). Этот протокол принимает aldh1a2 качестве примера гена для определения эффективности доставки f-PAM4-PEG-R9 инкапсулированные дендример siRNA. Последовательности малые интерферирующие РНК: Cy5-siRNA антисмысловых нити: 5 ' ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′, siAldh1a2 антисмысловых прядь: 5'-UUCAGGACAACCGUGUUCCdTdT-3' и кинулись отрицательный контроль siRNA антисмысловых strand: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'.
  10. Приготовляют раствор малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц, смешать с равным объемом раствора дендример siRNA и инкубировать образца при комнатной температуре 20 мин свежезаваренным подготовить решение малых интерферирующих РНК наночастиц перед использованием.
    Примечание: Объем малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц решения зависит количество рыб собирается быть вставлен. Например, подготовить по крайней мере 120 мкл дендример решение (микс 60 мкл раствора siRNA и 60 мкл дендример раствор) для инъекций 10 рыб (~ 10 мкл за рыбы), подсчитывая потери раствора.

4. инъекции малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц в сердце взрослого человека данио рерио

  1. Как описано выше, подготовить кусок губки с пазом, чашку Петри 10 см, наполненный tricaine раствор, Пластиковые пипетки, стереомикроскопом, локоть пинцета и инсулина шприца (рис. 1), а также бак рыб с системой воды для жилищного строительства рыбы после инъекции.
  2. Разрешить потерпевшим данио рерио, подготовленный в шагах 2.1 – 2.10 восстановить за 1 день после желудочковой резекции и затем анестезировать 1 рыбы (дней после ампутации) ДПВ в растворе tricaine, как описано в 2.4.
  3. Передача наркотизированных рыбы, вентральной стороне вверх, чтобы паз в влажной губкой с помощью пинцета локоть. Найдите бьющееся сердце под стереомикроскопом.
  4. Загрузите 10 мкл раствора малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц в шприц инсулина. Избегайте пузырьков как можно больше.
  5. Иммобилизации рыбы, аккуратно с помощью пинцета локоть провести грудной региона не доминирующей рукой. Не зажимайте рыба слишком плотно.
    Примечание: Имейте в виду, что не обширные кровотечение должно происходить во время инъекции.
  6. Возьмите шприц заполненные инсулина на ~ 30° и вставляют ~ 10 мкл раствора грудной полости, другой рукой (Дополнительные рис. 1).
    Примечание: Решения, иногда изливается во время инъекции, но это не влияет на эффект siRNA. Решение малых интерферирующих РНК наночастиц можно вводить один раз в день в течение нескольких дней до одного месяца, в зависимости от конкретного экспериментального плана. Вводить рыбу с одним типом siRNA каждый раз. Если более двух видов siRNA должны быть введены в одну рыбу, придать один тип siRNA каждый раз, а затем придать другой тип siRNA 1 час позже. В этом протоколе был введен только один вид интерферирующей РНК в рыбы.
  7. Передача рыбы в бак с водой системы.
    Примечание: Рыба ожидается перезапуск вентиляции в течение 1 мин, а затем возобновить плавательный. Введения малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц или малых интерферирующих РНК обычно не вызывают смерть в взрослых рыбок данио.

5. сердце сбор, фиксация и оценки эффективности siRNA доставки

  1. Подготовка 1 мл 4% раствора параформальдегида в пробки microcentrifuge для каждой группы.
  2. Анестезировать рыбы в tricaine растворе на отдельных дней после инъекции. Место рыбы supinely в паз в влажной губкой. Сделать большой разрез в регионе грудной и широко открыть с помощью пинцета. Сцепление оттока тракта и вытащить все сердце тщательно с помощью пинцета.
  3. Промойте сердце с PBS и быстро удалить дополнительную жидкость с салфеткой. Положите до 10 сердца в 1,5 мл microcentrifuge трубка с 1 мл параформальдегида. Аккуратно перевернуть трубку несколько раз и держать на ночь при 4 ° C.
  4. Измеряют интенсивность флуоресценции Cy5-малые интерферирующие РНК вводят сердец, с использованием в vivo imaging системы (дополнительный рисунок 2). Используйте 3 – 4 данио рерио сердца для каждой группы в этом исследовании.
  5. Монтировать фиксированные сердца с парафином или OCT составные (внедрение среды для замороженных образцов ткани для обеспечения оптимальной температуры вырезывания).

6. Оценка наночастиц опосредованной siRNA сайленсинга генов

  1. Подготовьте изотермических контейнеров и длинный пинцет. Налейте в жидком азоте до трети объема контейнера.
  2. Анестезировать рыбы в tricaine растворе 2 ДПВ. Вскрыть сердца, как описано в пункте 5.2, а затем удалить отток тракта и атриум.
    Примечание: Рыба может оправиться от операции в один день и затем вводят в 1 ДПВ с либо омлет малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц (siNC) как отрицательный контроль или aldh1a2 малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц (siAldh1a2).
  3. Перевести желудочков в пробки microcentrifuge 1,5 мл, с помощью пинцета, охватывают крышку трубки и сразу же поместить трубку в изолированный контейнер с жидким азотом. Пусть поплавок трубы на жидкого азота для нескольких минут используйте длинный пинцет для удаления труб из контейнера.
  4. Повторите шаги 6.2 и 6.3 собраны все желудочков. Используйте 6 – 10 сердца для каждой группы.
  5. Экстракт всего РНК сердец с реактивом изоляции РНК. Оценивать уровни выражения соответствующих генов путем количественного RT-PCR используя праймеры Gapdh F: GATACACGGAGCACCAGGTT; GAPDH R: GCCATCAGGTCACATACACG; Aldh1a2 F: TGAGCGAGGAGCAGCAGAGA; Aldh1a2 R: TCCACGAAGAAGCCTTTAGTAGCA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для определения эффективности доставки дендример опосредованной siRNA, мы резецируется Апекс желудочке сердца данио рерио, затем вводят около 10 мкл только катионные (макет группы), Cy5-siRNA только (голые группа) или f ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ-PEG-R9 инкапсулированные дендример Intrapleurally Cy5-интерферирующие РНК (Cy5 siRNA группа), соответственно (Рисунок 2A-B). Флуоресценции сигнал был обнаруживаемая в сердцах, вводится с инкапсулированные дендример Cy5-малых интерферирующих РНК в 3, 24 и 48 hpi (часов впрыск), хотя это было трудно обнаружить в сердцах из групп макет и голый на 48 hpi (рис. 2C-D), Предполагая, что дендример f ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ-PEG-R9 эффективно содействует доставке малые интерферирующие РНК в сердце взрослого данио рерио и стабильным для по крайней мере два дня.

Исследовать влияние инкапсулированные дендример siRNA сайленсинга генов, мы выбрали aldh1a2 (ретиноевой кислоты синтезировать фермент) в качестве целевого ген, который было сообщено потребуются для восстановления сердца после желудочковой резекции44 . Как показано на рисунке 3A, рыбы были позволено восстановить за один день после желудочковой резекции и затем microinjected с инкапсулированные дендример siRNA. Мы обнаружили, что уровень выражение mRNA aldh1a2 снизился в сердцах, относились с f ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ-PEG-R9 дендример инкапсулированное siAldh1a2 по сравнению с что дендример инкапсулированное кинулись интерферирующей РНК (siNC) на 2 dpa (Рисунок 3B), демонстрируя, что f ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ-PEG-R9 дендример опосредованной малые интерферирующие РНК достижения ген специфического глушителей в сердце взрослого данио рерио.

Figure 1
Рисунок 1 : Операции на сердце и грудном инъекций инструменты. Фотография инструментов, используемых для желудочковой резекция в сердце взрослого данио рерио: Губка с пазом, локоть пинцет, острые щипцы, ножницы иридэктомия, длинный пинцет и инсулина шприц используется для доставки дендример инкапсулированное siRNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : f ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ-PEG-R9 при содействии дендример эффективной интерферирующей РНК в сердце раненых взрослых рыбок данио. (A) схема для расследования эффективность поглощения наночастиц инкапсулированное Cy5-интерферирующей РНК в сердце взрослого данио рерио после резекции желудочков (ДПА: дней после ампутации; hpi: часов после инъекции). (B) синтез дендример f ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ-PEG-R9 и подготовка инкапсулированные дендример Cy5-siRNA. (C) Cy5 флуоресценции изображения сердец вводят с дендримеров только (макет), Cy5-siRNA только без дендример инкапсуляции (голая) и катионные инкапсулированное флуоресценции помечены Cy5-siRNA (Cy5-siRNA) обнаружены в vivo изображений системы, показывают, что флуоресценции сигналы были почти обнаружить в группе Макет и голый на 48 hpi, в то время как сильные сигналы, сохранена в инкапсулированные дендример Cy5-siRNA групп от 3 до 48 hpi. Произвольной шкале флуоресценции сигналов показывает от слабых (синий) для сильной (красный). (D) количественная оценка Cy5-siRNA флуоресценции сигналов в сердцах, оценены в vivo imaging системы, Группа C (* P < 0,05, *** P < 0,001; данные являются среднее ± s.e.m.; односторонний дисперсионный анализ следуют Бонферрони в множественные сравнения испытаний; n = 3-4 сердца). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Эффективное siRNA глушителей из aldh1a2 в самом сердце раненых взрослых рыбок данио. (A) схема для расследования эффект подавления экспрессии гена aldh1a2 siRNA. (B) ПЦР показывает что aldh1a2 мРНК сократилось в сердцах наночастиц инкапсулированное siAldh1a2, по сравнению с наночастиц инкапсулированное кинулись siRNA сердца (siNC). Aldh1a2 уровень мРНК выражения нормализовалось GAPDH (*** P < 0,001; данных означает ± s.e.m. с паре t критерия Стьюдента). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Supplementary Figure 1
Дополнительный рисунок 1: изображения грудной полости инъекции. (A) грудной полости у взрослых рыб на 1 день пост ампутации. (B) инъекции наночастиц инкапсулированное интерферирующей РНК в грудной полости. Масштаб бары: 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Supplementary Figure 2
Дополнительный рисунок 2: эффективность поглощения наночастиц инкапсулированное Cy5-интерферирующей РНК в сердце ранен взрослых рыбок данио. (A) Cy5 флуоресценции изображений сердца, вводится с дендримеров только (макет), голый Cy5-siRNA без дендример инкапсуляции (голая) и катионные инкапсулированное Cy5-siRNA под в vivo imaging системы. Произвольные масштаб флуоресценции сигналов является от слабых (синий) сильный (красный). (B) количественная оценка Cy5-siRNA флуоресценции сигналов в сердцах, измеряется в vivo imaging системы, Группа A (NC: нет значительных различных; данные являются среднее ± s.e.m.; односторонний дисперсионный анализ следуют Бонферрони несколько сравнения теста; n = 3-4 сердца). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Данио рерио полностью способен регенерировать различных органов, включая взрослых сердца5. Хотя трансгенных и генетические методы развитая для изучения функций генов в эмбрионов у рыбок данио, следователи по-прежнему сталкивается с сложной задачей генерации условных мутантные аллели в zebrafish45,46. Таким образом трансгенных Доминант отрицательных мутанты или малых молекул ингибиторов часто используются для функций гена адрес в взрослых рыбок данио органов25,27,42. За последние несколько лет, мы разработали альтернативный метод для анализа потери функции генов в сердце взрослого данио рерио, с использованием наночастиц опосредованной siRNA доставки и41,42, экспрессию гена 43. здесь, представлен подробный протокол для этого метода, с помощью дендример опосредованной siRNA сайленсинга генов в сердцах данио рерио и, возможно, в частности в других органах данио рерио, в общем,.

Молекула малых интерферирующих РНК может вступить в клетки само по себе из-за его отрицательный заряд и будет легко деградировавших в результате нуклеиназы. С моно дисперсные молекул, Перестраиваемые структуры и свойств, дендримеры рассматривались как перспективных малых интерферирующих РНК перевозчиков 47. ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ дендримерами богатых катионными периферии и буферизации амины, внутри которой может посредничать siRNA инкапсуляции в физиологических условиях и вызвать эффект «Протон Губка» для выпуска малых интерферирующих РНК из endosomes в цитоплазме соответственно48 , 49 , 50. в этой статье, была изменена ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ повышении стабильности и доставки. F ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ-PEG-R9 система обеспечивает полусферическая головка дендример ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ с положительный заряд для инкапсуляции siRNA для предотвращения деградации нуклеиназы. PEG руку и R9 трансмембранного пептид использовался для улучшения гидрофильность наночастицы для стабилизации и содействовать поглощения клетками соответственно.

Качество и тип наночастиц являются критически важными для эффективного siRNA доставки и сайленсинга генов в сердце у рыбок данио. Мы успешно исследовали три структурно разнообразные наночастиц для этой цели: PEG-пла, f ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ-PEG-R9 и пей-Илья-РГД наночастиц41,42,43. Хотя они не производятся коммерчески, лаборатории регулярно органической химии можно легко синтезировать и очистить наночастиц, как описано ранее35,37,43. Здесь мы выбрали f ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ-PEG-R9 дендример как пример, чтобы показать простой, эффективный, катионные опосредованной siRNA доставки и сайленсинга генов в сердце взрослого данио рерио после желудочковой резекции, потому что это относительно легко подготовить малых интерферирующих РНК загрузки Катионные комплексы, такие как по инкубации смесь при комнатной температуре ~ 20 мин. С другой стороны рН должен корректироваться для малых интерферирующих РНК загружен нанокомплексы если Пей-Илья-РГД используется43. Аналогичным образом эмульгирующих и очистки процедуры необходимы для получения единообразных наночастиц инкапсулированное siRNA решение если PEG-пла наночастицы используются35,41.

Другим важным шагом является для сведения к минимуму или нет кровотечения во время инъекции инкапсулированные дендример siRNA, как описано в 4.5 с обширными кровоизлияниями прерывает регенерации сердца и других биологических систем. Таким образом мы предлагаем за исключением рыб из экспериментальной группы, если кровотечение возникает во время инъекции. В общем эта простая инъекции процедура легко освоен после нескольких испытаний.

Основные ограничения данного метода находятся в siRNA технология сама по себе, как потенциальные эффекты пробить и неполное удаление генов интерес. В противном случае, высокую воспроизводимость биологических репликации сайленсинга генов нескольких генов был продемонстрирован в нашей работе и что других41. Важно отметить, что этот протокол является быстрым, простым и эффективным, и инъекции лечения взрослых данио рерио хорошо переносится. Экспериментальный анализ эффективности сайленсинга генов малых интерферирующих РНК может включать оценку уровней выражение mRNA в situ гибридизация или количественного RT-PCR, или уровнях выражения протеина используя западной помарки, применением иммуногистохимического окрашивания, или другие функциональные анализы. Вместе мы полностью поддерживаем способствовали наночастиц siRNA доставки как альтернативный инструмент для исследования функция потерь в сердце взрослого данио рерио, в частности, и этот подход может также быть распространена на другие органы в взрослых рыбок данио и других организмов, модель.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы благодарят д-р Брюс IC для критических замечаний и читать рукопись. Эта работа была поддержана субсидий из национального естественных наук фонд Китая (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 и 31521062), AstraZeneca Азии и возникающие рынок инновационной медицины и раннего развития.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
tricaine Sigma E10521 Store at 4 °C
stereomicroscope Leica  S8AP0
sharp forcep WPI 14098
iridectomy scissors WPI 501778
elbow tweezers Suzhou Liuliu SE05Cr
α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) Biomatrik (Jiaxing) Inc. 5239
core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) Andrews ChemServices AuCS-297
vacuum drying equipment Yiheng DZF-6020
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144
tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) Alfar Aesar 51805-45-9 Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.
ultrafiltration tube Millipore UFC900308
freeze dryer Martin Christ Alpha 2-4 Ldplus
NMR spectrometer Bruker AV400
Deuterium oxide(D2O) J&K 174611
NMR sample tube J&K WG-1000-7-50
3 kDa MWCO ultrafiltration tube Merck UFC900308
sea salts Instant Ocean® SS15-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
  2. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
  3. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
  4. Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
  5. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  6. Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1 11889-11895 (2003).
  7. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
  8. Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
  9. Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
  10. Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
  11. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  12. Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
  13. London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
  14. Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
  15. Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
  16. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
  17. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
  18. Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
  19. Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
  20. Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
  21. Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2'-4' conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
  22. Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2',4'-(N-methoxy)aminomethylene and 2',4'-aminooxymethylene and 2'-O,4'-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
  23. Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
  24. Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2',4'-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
  25. Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
  26. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  27. Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
  28. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
  29. de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
  30. Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
  31. McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
  32. Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
  33. Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing's sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
  34. Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
  35. Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
  36. Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
  37. Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
  38. Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
  39. Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
  40. Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
  41. Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
  42. Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
  43. Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
  44. Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
  45. Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
  46. Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
  47. Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
  48. Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
  49. Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
  50. Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).

Tags

Биология развития выпуск 137 данио рерио взрослых сердце регенерации наночастицы siRNA гена глушителей развития биологии генетики
Наночастицы опосредованной siRNA сайленсинга генов в сердце взрослого человека данио рерио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, C., Wang, F., Hou, J., Zhu,… More

Xiao, C., Wang, F., Hou, J., Zhu, X., Luo, Y., Xiong, J. W. Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (137), e58054, doi:10.3791/58054 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter