Summary
Det är fortfarande en stor utmaning att utveckla villkorlig gen-knockout eller effektiva gene-knockdown i vuxen zebrafiskar organ. Här rapporterar vi ett protokoll för presterande nanopartikel-medierad siRNA-nedtystning i vuxen zebrafiskar hjärtat, vilket ger en ny förlust-av-funktion-metod för att studera vuxna organ i zebrafiskar och andra modellorganismer.
Abstract
Däggdjur har en mycket begränsad förmåga att regenerera hjärtat efter hjärtinfarkt. Däremot, återskapar de vuxna zebrafiskar dess hjärta efter apex resektion eller cryoinjury, vilket gör det till ett viktigt modellerar organism för hjärtat regenerering studie. Avsaknaden av förlust-av-funktion metoder för vuxna organ har dock begränsat insikter om mekanismerna bakom hjärtat regenerering. RNA-interferens via olika leveranssystem är ett kraftfullt verktyg för tysta gener i däggdjursceller och modellorganismer. Vi har tidigare rapporterat att siRNA-inkapslat nanopartiklar framgångsrikt komma in i cellerna och resultera i en anmärkningsvärd gen-specifika knockdown i regenererande vuxen zebrafiskar hjärtat. Här presenterar vi en enkel, snabb och effektiv protokollet för dendrimer-medierad siRNA delivery och nedtystning i regenererande vuxen zebrafiskar hjärtat. Denna metod ger en alternativ metod för att bestämma gen funktioner i vuxna organ i zebrafiskar och kan utökas till andra modellorganismer samt.
Introduction
Hjärtinfarkt har blivit en större hälsorisk, leder till en enorm ekonomisk belastning runt om världen1. Vuxna däggdjur hjärtat inte att regenerera och fylla på förlorad hjärtmuskelcellerna i makroskopisk skala efter skadan, vilket leder till bildandet av ärrvävnad och efterföljande hjärtsvikt. Till skillnad från däggdjur är zebrafiskar kapabel att hjärtat regenerering, främst genom robust hjärtinfarkt spridning efter olika typer av hjärt-skada, vilket gör det en ideal modellerar organism för att undersöka hjärtat regenerering molekylära mekanismer 2,3,4,5,6,7,8. Dechiffrera de endogena mekanismerna är underliggande zebrafiskar hjärtat regenerering ett spännande område för forskning i sökandet efter nya terapeutiska strategier för att förbättra mänskliga hjärtat regenerering9.
Det finns genetisk manipulation metoder i zebrafiskar. Dessa består av morpholinos (MO) som används också allmänt i grodor, chick och däggdjur förutom i zebrafiskar10,11,12,13. MO har effektiv Nedslagning av målet genuttryck i vuxen zebrafiskar fin, hjärna och näthinna14,15,16,17,18,19. Låst-nucleic acid (LNA) är en annan konstgjord oligonukleotiden brukade slå ner endogena genernas uttryck inte bara i zebrafiskar embryon, utan också i vuxna djur organ20,21,22, 23 , 24. bristen på effektiva förlust-av-funktion metoder för vuxna hjärtan är dock fortfarande ett hinder i att studera molekylära mekanismer för orgel regenerering. På nuvarande, småmolekylär hämmare eller transgena uttrycket av dominant-negativ mutanter används främst för att blockera funktionen av en viss gen eller väg att studera dess funktion i vuxen zebrafiskar hjärtat regenerering25,26 ,27. Dock inte alla gener eller signalvägar som är tillämpliga för dessa metoder.
Små-störande RNAs (siRNAs) används allmänt för förlust-av-funktion analysen i däggdjursceller och embryon av modellorganismer, liksom vuxna organ för prekliniska studier på djur modeller28,29,30 , 31 , 32. siRNAs har använts effektivt att tysta gener i tumörer33,34,35 och hjärtmuskelceller36,37,38,39 ,40 via olika leveranssystem. Nyligen har utvecklat vi effektiva siRNA-inkapslat nanopartikel-nedtystning i regenererande vuxen hjärtat med flera olika nanopartiklar41,42,43, som tillhandahåller ett nytt verktyg för funktionella studier av gener i vuxen zebrafiskar organ. Baserat på våra tidigare studier41,42,43, presenterar här vi en enkel, praktisk, men ändå kraftfulla protokoll för siRNA nedtystning i regenererande vuxen zebrafiskar hjärtat med f-PAMAM-PEG-R9 tåååålamooooooood. Aldh1a2 (aldehyd dehydrogenas 1, familjemedlem A2) genen var uppreglerad efter zebrafiskar apex resektion och ablation av Aldh1a2 blockerade de kardiella regenerering44. Här tar vi aldh1a2 gen som exempel att testa gen knockdown effektivitet medieras av nanopartiklar-inkapslat siRNA injektion. Detta protokoll innehåller en procedur för zebrafiskar hjärtat resektion, kemisk syntes av nanopartiklar och en leveransmetod på siRNA-inkapslat nanopartiklar i vuxen zebrafiskar hjärta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden används ett zebrafiskar protokoll godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén på Peking University, som är fullt ackrediterad av föreningen för bedömning och ackreditering av laboratorium djur vård.
1. beredning av Tricaine lösning
- För att förbereda tricaine stamlösning, lägga 400 mg etyl 3-aminobensoat methanesulfonate pulver till 97,9 mL destillerat vatten och tillsätt därefter 2,1 mL 1 M Tris (pH 9,5) att justera pH till ~ 7. Lagra stamlösning vid 4 ° C.
- För att förbereda tricaine fungerande lösning, lägga till 4,2 mL stamlösning tricaine 100 mL akvarievatten system.
2. vuxen zebrafiskar ventrikulära resektion
- Förbereda instrument och material för kirurgin som omfattar en bit av svamp, en petriskål fylld med tricaine arbetar lösning, en plast pipett, ett stereomikroskop, två vassa pincetten iridektomi sax, och vinklad pincett (figur 1).
- Förbereda ett litet spår av storlek 4 x 0,5 cm och 0,5 cm på djupet på en svamp för att hålla zebrafiskar under ventrikulär resektion kirurgi.
- Fyll en 3 L zebrafiskar tank med halv tank zebrafiskar system vatten som görs med hjälp av 60 mg/L havet salter i dH2O för återvinning av skadade fisken.
- Söva fisken i en 10 cm petriskål med tricaine lösning tills gill rörelserna minska till en per sekund och hålla fisken i minst 30 s för att säkerställa att det är helt sövd.
- Överföra den sövda fisken med armbågen pincetten till spåret i en fuktig svamp ventrala sida upp. Visuellt lokalisera felmarginalen med bultande hjärta och leta upp hjärtat under ett stereomikroskop.
- Använda iridektomi saxen för att göra ett litet snitt på ca 1 mm som penetrerar huden och musklerna, och försiktigt riva silvrig epitelskiktet i hjärtsäcken med pincett tips att komma åt hjärtat. Sätt inte tången alltför djupt in i hålrummet att undvika skadan som hjärtat.
Obs: vid denna punkt, Tänk på att undvika omfattande blödning. Utesluta fisk från experiment om omfattande blödning uppstår, eftersom överdriven blödningen orsakas främst av oavsiktlig skada till hjärtat och så kommer att leda till missvisande resultat. - Exponera ventrikeln genom att försiktigt hålla sin spets med vass pincett med den icke-dominanta handen eller genom att tillämpa mild buktryck. Ta sedan bort ca 20% av ventrikeln vid spetsen med iridektomi sax med den andra handen.
Obs: Ingen omfattande blödning skulle inträffa på denna punkt. - Använd en våt servett för att täcka snittet, som de sår blöda ymnigt för 15 – 45 s innan koagulering, och sedan lägga fisken tillbaka in i tanken med systemet vatten.
Obs: Det är inte nödvändigt att sutur snittet. - Se till att fisken återfår gill rörelser inom 1 min och återupptar sedan simning. Om fisken inte visar gill rörelser efter 50 s i vatten, underlätta det genom att spruta vatten till gälarna med plast pipett tills fisken återupptar aktiv ventilation.
- Bibehålla fisken i återanvända systemet efter den ventrikulära resektion.
Obs: Inga särskilda omsorger är nödvändigt jämfört med normala fisken. Dödligheten av vuxen zebrafiskar ventrikulära resektion är ca 5 – 10%. Nästan alla dödsfall inträffar inom 24 timmar efter operationen.
3. beredning av siRNA-inkapslat nanopartiklar
- Syntetisera den f-PAM4-PEG-R9 dendrimer.
Obs: Syntes av f-PAM4-PEG-R9 dendrimer material utfördes enligt den tidigare37 med vissa ändringar. Längden på α, ω-dipyridyl disulfido polyetylenglykol (Py-PEG-Py) reducerades till en molekylvikt på 1000 att maximera inkapsling av siRNAs (figur 2B). - Torka 10 mg cysteaminklorhydrat kärnan i G4.0 polyamidoamine (kallas PAMAM) använder vakuum torktumlare på 45 ° C för 1 h och lös sedan PAMAM i 2 mL Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS, en balanserad saltlösning används för en mängd olika cell kultur applikationer).
- Lös upp 1,7 mg tris(2-karboxymetyl) fosfin (TCEP) i 1 mL DPBS, blanda med den PAMAM lösning som beretts i 3.2 och lämna vid rumstemperatur med skonsam omrörning för 8 h.
Obs: TCEP är tio gånger i molar förhållandet överskott till disulfide obligationer av PAMAM. - Ta bort överdriven TCEP genom ultrafiltrering. Lägg till DPBS till ovan PAMAM-TCEP blandningen att nå volymen på 10 mL och lösningen överförs till ett 3 kDa MWCO (molekylär vikt avskurna) ultrafiltrering rör. Efter centrifugering vid 3 000 g i 15 min, kassera lösningen i samling röret. Lägga till DPBS på filtret enheten till 10 mL och försiktigt pipett provet flera gånger och centrifugera igen. Upprepa detta steg för 4 gånger. Efter den sista filtreringen, aspirera provet från enhetens filter.
Obs: Produkten av detta steg reduceras PAMAM (kallas f-PAM4). - Lös upp 14 mg Py-PEG-Py i 1 mL DPBS, mix med f-PAM4 lösningen och lämna den med skonsam omrörning i rumstemperatur i 3 h. Ta sedan bort den överdrivna Py-PEG-Py genom ultrafiltrering steget som beskrivs i 3.4. Efter den sista filtreringen, aspirera provet från enhetens filter.
Obs: Produkten är benämn så f-PAM4-PEG-Py. Py-PEG-Py är 10-faldig i molar förhållandet till thiol grupper i den f-PAM4. - Lös upp 6,4 mg av cystein avslutas R9 peptid (Ac-CRRRRRRRRR-NH2) i 1 mL DPBS, blanda med f-PAM4-PEG-Py och rör varsamt för 8 h i rumstemperatur. Rena den slutliga produkten, som kallas f-PAM4-PEG-R9, av ultrafiltrering steget som beskrivs i 3.4 förutom att DPBS ändras till avjoniserat vatten. Lyophilize produkten med en frys dammsugare torktumlare.
Obs: Produkterna i 3.5 och 3.6 innan frystorka den lagras vid-20 ℃ för minst 1 månad. Efter att frystorka den f-PAM4-PEG-R9 lagras proverna vid-20 ℃ för minst 2 månader. - För att avgöra graden av PEG och peptid modifiering, lös 5 mg av den f-PAM4-PEG-Py i D2O (deuteriumoxid) och överför det till NMR (kärnmagnetisk resonans) prov röret. Utför 1H-NMR spektralanalys på 400 MHz och analysera data med hjälp av NMR data analys programvara37.
Obs: Specifikt, representant PAMAM toppar (- NCH2CH2CO-), PEG toppar (- OCH2CH2-) och arginin rester toppar (- HCCH2CH2CH2NH-) i peptiderna förväntas vara i intervall 2,4 – 2,6, 3,7 – 3,8 och 1,6 – 1,8 ppm, respektive. Bestämma graden av ändring av PEG och R9 i förhållande till PAMAM genom att beräkna integraler av PEG och R9 topparna till PAMAM topparna. Modifiering av PEG är 100% och R9 ändringen är minst 50%. 1H-NMR spektrala analyserna utförs i det core facilitet till institutionen. - Lös upp f-PAM4-PEG-R9 dendrimer pulver i PBS till 4 mg/mL och göra alikvoter av lösningen för engångsbruk.
Obs: Den dendrimer lösningen kan förvaras vid-20 ° C i minst en månad, utan upprepad frysning och upptining. - Lös den cyanin färgämnen-märkt siRNAs (kallas Cy5-siRNA), Aldh1a2 siRNA eller kodade negativ kontroll siRNA i destillerat vatten till 10 µM.
Obs: Använd den cyanin färgämnen-märkt siRNAs för att utvärdera huruvida de nanopartiklar inkapslade siRNA kan ange fisk hjärtat (figur 2A-B). Detta protokoll tar aldh1a2 som ett exempel genen att avgöra effektiviteten i leverans av f-PAM4-PEG-R9 dendrimer-inkapslat siRNA. Sekvenserna av siRNAs är: Cy5-siRNA antisense strand: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′, siAldh1a2 antisense strand: 5'-UUCAGGACAACCGUGUUCCdTdT-3' och kodade negativ kontroll siRNA antisense strand: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'. - För att förbereda siRNA-inkapslat nanopartiklar lösningen, blanda siRNA med en lika stor volym av dendrimer lösning och inkubera provet i rumstemperatur i 20 min. bereda färska siRNA-nanopartiklar lösning före användning.
Obs: Volymen siRNA-inkapslat nanopartiklar lösning beror på antalet fiskar kommer för att injiceras. Till exempel förbereda minst 120 µL dendrimer lösning (mix 60 µL siRNA lösning och 60 µL dendrimer lösning) injektion av 10 fiskar (~ 10 µL per fisk), räkna till förlust av lösning.
4. injektion av siRNA-inkapslat nanopartiklar i vuxen zebrafiskar hjärta
- Som beskrivits ovan, förbereda en bit svamp med ett spår, en 10 cm petriskål fylld med tricaine lösning, en plast pipett, ett stereomikroskop, elbow pincett och en insulinspruta (figur 1), samt ett akvarium med vatten för bostäder i fiska efter injektionen.
- Låt den skadade zebrafiskar som förberett i steg 2.1 – 2.10 att återvinna för 1 dag efter ventrikulära resektion, och sedan söva 1 dpa (dagar efter amputation) fisken i tricaine lösning som beskrivs i 2.4.
- Överföra den sövda fisken, ventrala sida upp, till spåret i fuktig svampen med armbågen pincetten. Leta upp med bultande hjärta under stereomikroskopet.
- Ladda 10 µL siRNA-inkapslat nanopartiklar lösningen i sprutan insulin. Undvik bubblor som möjligt.
- Immobilisera fisken försiktigt med armbågen pincetten för att hålla bröstkorg regionen med den icke-dominanta handen. Inte klämma fisken för hårt.
Obs: Tänk på att ingen omfattande blödning skulle inträffa under injektionen. - Håll den fyllda insulinspruta på ~ 30° och injicera ~ 10 µL lösning i brösthålan med den andra handen (kompletterande Figur1).
Obs: Lösningen rinner ibland ut under injektionen, men detta påverkar inte siRNA effekten. SiRNA-nanopartiklar lösningen kan injiceras en gång om dagen i flera dagar till en månad, beroende på en särskild experimentella plan. Injicera en fisk med en typ av siRNA varje gång. Om fler än två typer av siRNA behöver injiceras i en fisk, injicera en typ av siRNA varje gång, och sedan injicera en annan typ av siRNA 1 h senare. I detta protokoll injicerades endast en typ av siRNA per fisk. - Överföra fisken till tanken med systemets vatten.
Obs: Fisken förväntas starta om ventilation inom 1 min och sedan fortsätter att simma. Injektion av siRNA-inkapslat nanopartiklar eller siRNA orsakar normalt inte dödsfall i vuxen zebrafiskar.
5. hjärta insamling, fixering och utvärdering av effektiviteten av siRNA Delivery
- Förbereda 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD lösning i en mikrocentrifug rör för varje grupp.
- Söva fisken i tricaine lösning på utvalda dagar efter injektioner. Placera fisken supinely i spåret i en fuktig svamp. Göra ett stort snitt i regionen bröstkorg och öppna allmänt med pincetten. Grepp i utflödet tarmkanalen och dra ut hela hjärtat noggrant med pincetten.
- Skölj hjärtat med PBS och ta snabbt bort extra vätska med en servett. Sätta upp till 10 hjärtan i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör med 1 mL PARAFORMALDEHYD. Försiktigt vänd röret flera gånger och hålla över natten vid 4 ° C.
- Mät fluorescensintensiteten hos Cy5-siRNAs-insprutning hjärtan i vivo imaging system (kompletterande figur 2). Använd 3 – 4 zebrafiskar hjärtan för varje grupp i denna studie.
- Montera fast hjärtan med antingen paraffin eller ULT förening (inbäddning Medium för fryst vävnadsprover att säkerställa Optimal skärtemperatur).
6. utvärdering av nanopartiklar-medierad siRNA nedtystning
- Förbered en isolerad container och lång pincett. Häll i flytande kväve till en tredjedel av volymen av behållaren.
- Söva fisken i tricaine lösning på 2 dpa. Dissekera hjärtan som beskrivs i 5.2 och ta sedan bort utflöde tarmkanalen och atrium.
Obs: Fisken kan återhämta sig från operation i en dag och sedan injiceras på 1 dpa med antingen äggröra siRNA-inkapslat nanopartiklar (siNC) som en negativ kontroll eller aldh1a2 siRNA-inkapslat nanopartiklar (siAldh1a2). - Överföra ventriklarna i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör med hjälp av pincetten, täcka tube locket och placera omedelbart röret i den isolerade behållaren med flytande kväve. Låt rören flottören på det flytande kvävgasen för några min. Använd den lång pincetten ta bort rören från behållaren.
- Upprepa steg 6.2 och 6.3 tills alla ventriklar samlas. Använd 6 – 10 hjärtan för varje grupp.
- Extrahera den total-RNA hjärtan med RNA isolering reagens. Bedöma uttrycksnivåerna för de respektiva generna av kvantitativ RT-PCR med primers Gapdh F: GATACACGGAGCACCAGGTT; GAPDH R: GCCATCAGGTCACATACACG; Aldh1a2 F: TGAGCGAGGAGCAGCAGAGA; Aldh1a2 R: TCCACGAAGAAGCCTTTAGTAGCA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att avgöra effektiviteten i dendrimer-medierad siRNA leverans, vi resected apexen av ventrikeln zebrafiskar hjärta, sedan injiceras cirka 10 µL av dendrimer endast (mock grupp), Cy5-siRNA endast (nakna grupp) eller f-PAMAM-PEG-R9 dendrimer-inkapslat Cy5-siRNA (Cy5-siRNA grupp) intrapleurally, respektive (figur 2A-B). Fluorescens signalen var detekterbart i hjärtan injiceras med dendrimer-inkapslat Cy5-siRNA på 3, 24 och 48 hpi (timmar efter injektion), medan det var knappt detekterbara i hjärtan från grupperna håna och naken på 48 hpi (figur 2C-D), tyder på att den f-PAMAM-PEG-R9 dendrimer effektivt underlättar distribution av siRNAs i vuxen zebrafiskar hjärtat och är stabil i minst två dagar.
För att undersöka effekten av dendrimer-inkapslat siRNA på nedtystning, valde vi aldh1a2 (retinoic acid-syntetisera enzym) som en målgenen, som har rapporterats att krävas för hjärtat förnyelse efter ventrikulära resektion44 . Som visas i figur 3A, var fisken tillåtna att återvinna för en dag efter ventrikulära resektion och sedan microinjected med dendrimer-inkapslat siRNA. Vi hittade att aldh1a2 mRNA uttryck nivå minskade i de hjärtan som behandlats med f-PAMAM-PEG-R9 dendrimer-inkapslat siAldh1a2 jämfört med dendrimer-inkapslat kodade siRNA (siNC) på 2 dpa (figur 3B), visar att f-PAMAM-PEG-R9 dendrimer-medierad siRNAs uppnå gen-specifik nedtystning i vuxen zebrafiskar hjärtat.
Figur 1 : Hjärtkirurgi och bröstkorg injektion instrument. Fotografi av de instrument som används för ventrikulär resektion i vuxen zebrafiskar hjärtat: svamp med en groove, elbow pincett, vass pincett, iridektomi sax, lång pincett och insulin sprutan används för dendrimer-inkapslat siRNA delivery. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Effektiv f-PAMAM-PEG-R9 dendrimer-assisted leverans av siRNA in i skadade vuxna zebrafiskar hjärtat. (A) systemet för att utreda upptag effektivitet nanopartikel-inkapslat Cy5-siRNA i vuxen zebrafiskar hjärtat efter ventrikulära resektion (dpa: dagar efter amputation; hpi: timmar efter injektion). (B) syntes av f-PAMAM-PEG-R9 dendrimer och beredning av dendrimer-inkapslat Cy5-siRNA. (C) Cy5 fluorescens avbildning av hjärtan injiceras med tåååålamooooooood endast (mock), Cy5-siRNA bara utan dendrimer inkapsling (naken) och dendrimer-inkapslat fluorescens märkt Cy5-siRNA (Cy5-siRNA) upptäcks av den i vivo imaging system, visar att fluorescens signaler var nästan omätbara i grupperna håna och naken på 48 hpi, medan starka signaler kvar i de dendrimer-inkapslat Cy5-siRNA grupperna från 3 till 48 hpi. Den godtyckliga skalan av fluorescens signaler visar från svaga (blå) till stark (röd). (D) kvantifiering av Cy5-siRNA fluorescens signaler i hjärtan bedömas av den i vivo imaging system som panel C (* P < 0,05, *** P < 0,001; data är medelvärde ± s.e.m.; envägs variansanalys följt av Bonferroni's flera jämförelse tester; n = 3-4 hjärtan). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Effektiv siRNA Tystande av aldh1a2 i skadade vuxna zebrafiskar hjärtat. (A) system för att undersöka aldh1a2 siRNA nedtystning effekt. (B) qPCR avslöjar att aldh1a2 mRNA minskade i nanopartikel-inkapslat siAldh1a2 hjärtan jämfört med nanopartiklar-inkapslat kodade siRNA hjärtan (siNC). Aldh1a2 mRNA uttryck nivå var normaliserade av GAPDH (*** P < 0,001; data är menar ± s.e.m. med parat Students t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: bilder av brösthålan injektion. (A), brösthålan i vuxna fiskar på 1 dag post amputation. (B) injektion av nanopartiklar-inkapslat siRNA i brösthålan. Skala barer: 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2: upptag effektivitet nanopartikel-inkapslat Cy5-siRNA i oskadd vuxen zebrafiskar hjärtat. (A) Cy5 fluorescens avbildning av hjärtan injiceras med tåååålamooooooood endast (mock), Nakna Cy5-siRNA utan dendrimer inkapsling (naken) och dendrimer-inkapslat Cy5-siRNA under den i vivo imaging system. Godtyckliga omfattningen av fluorescens signaler är svag (blå)-stark (röd). (B) kvantifiering av Cy5-siRNA fluorescens signaler i hjärtan som mäts av den i vivo imaging system som panel A (NC: inga betydande olik; data är medelvärde ± s.e.m.; envägs variansanalys följt av Bonferroni's flera jämförande test; n = 3-4 hjärtan). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafiskar är fullt kapabel att regenerera en mängd organ inklusive de vuxna hjärta5. Medan transgena och genetiska metoder är väl utvecklade för att studera gen funktioner i embryon av zebrafiskar, inför utredare fortfarande den skrämmande uppgiften att generera villkorlig muterade alleler i zebrafiskar45,46. Således, transgena dominant-negativ mutanter eller småmolekylär hämmare används ofta till adress gen funktioner i vuxen zebrafiskar organ25,27,42. Under senaste åren, har vi utvecklat en alternativ metod för förlust-av-funktion analys av gener i vuxen zebrafiskar hjärtat med nanopartiklar-medierad siRNA delivery och nedtystning41,42, 43. här, ett detaljerat protokoll för denna metod som använder dendrimer-medierad siRNA nedtystning i zebrafiskar hjärtan i synnerhet och eventuellt i andra zebrafiskar organ, i allmänhet presenteras.
SiRNA molekylen kan inte träda i cellerna av sig själv på grund av sin negativa laddning och enkelt skulle brytas ned av nuclease. Med mono-skingra molekyler, avstämbara strukturer och egenskaper, tåååålamooooooood ha ansetts så lovande siRNA bärare 47. De PAMAM tåååålamooooooood har rika katjoniska periferier och buffring aminer inuti som kunde medla siRNA inkapsling i fysiologiska förhållanden och en ”proton svamp” effekt att släppa siRNA från endosomes i cytoplasman respektive48 , 49 , 50. i denna artikel, PAMAM ändrades för att förbättra stabilitet och leverans. F-PAMAM-PEG-R9 systemet ger en halvsfärisk PAMAM dendrimer huvud med positiv laddning att förhindra nedbrytning av nuclease inkapsling av siRNA. PEG armen och R9 transmembrana peptiden användes för att förbättra hydrophilicitet av nanopartiklarna för stabilisering och främja införandet av celler respektive.
Kvalitet och typ av nanopartiklar är kritiska för effektiv siRNA delivery och nedtystning i zebrafiskar hjärtat. Vi har framgångsrikt undersökt tre strukturellt-diverse nanopartiklar för detta ändamål: PEG-PLA, f-PAMAM-PEG-R9 och PEI-HYD-RGD nanopartiklar41,42,43. Även om de inte kommersiellt tillverkas, en vanlig organisk kemi lab lätt att syntetisera och rena nanopartiklar som tidigare beskrivits35,37,43. Här, valde vi den f-PAMAM-PEG-R9 dendrimer som ett exempel för att Visa enkel, effektiv, dendrimer-medierad siRNA delivery och nedtystning i vuxen zebrafiskar hjärtat efter ventrikulära resektion, eftersom det är relativt lätt att förbereda siRNA-loaded dendrimer-komplex, som genom ruvning blandningen vid rumstemperatur för ~ 20 min. Däremot, har pH justeras för siRNA-loaded nanocomplexes om PEI-HYD-RGD är begagnade43. Förfaranden för emulgering och rening är likaså viktigt att få enhetliga nanopartikel-inkapslat siRNA lösning om PEG-PLA nanopartiklar är begagnade35,41.
Ett annat viktigt steg är att minimera eller har inga blödningar under injektion av dendrimer-inkapslat siRNA som beskrivs i 4.5 eftersom omfattande blödning avbryter hjärtat regenerering och andra biologiska system. Vi föreslår således, exklusive fisk från experimentella grupper om blödning uppstår under injektionen. I allmänhet styras injektionsproceduren enkel enkelt efter några prövningar.
De stora begränsningarna med denna metod är siRNA tekniken i sig, såsom potentiella off-target effekter och ofullständig radering av gener av intresse. Annars mycket reproducerbara biologiska replikering av nedtystning av flera gener har påvisats i vårt arbete och andras41. Allt detta protokoll är snabb, enkel och effektiv, och injektion behandlingen tolereras väl av vuxen zebrafiskar. Experimentell analys av siRNA-nedtystning effektivitet kan omfatta bedömning av mRNA-uttrycksnivåerna genom in situ hybridisering eller kvantitativ RT-PCR eller protein uttryck nivåer med hjälp av Western blotting, immunhistokemisk färgning, eller andra funktionella analyser. Tillsammans, vi stöder fullt ut nanopartiklar underlättas siRNA delivery som ett alternativt verktyg för förlust-av-funktion studier i vuxen zebrafiskar hjärtat i synnerhet och detta synsätt kan också utvidgas till andra organ i vuxen zebrafiskar och andra modellorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr. IC Bruce för kritiska kommentarer och läsa manuskriptet. Detta arbete stöds av bidrag från National Natural Science Foundation Kina (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 och 31521062), AstraZeneca Asien, och framväxande marknaden innovativ medicin och tidiga utveckling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4 °C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1 11889-11895 (2003).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
- Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
- London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
- Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
- Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
- Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
- Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
- Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2'-4' conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
- Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2',4'-(N-methoxy)aminomethylene and 2',4'-aminooxymethylene and 2'-O,4'-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
- Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
- Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2',4'-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
- Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
- de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
- McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
- Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
- Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing's sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
- Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
- Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
- Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
- Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
- Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
- Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
- Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
- Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
- Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
- Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
- Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
- Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
- Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
- Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).
