Summary
Continua a ser um grande desafio para desenvolver condicional gene nocaute ou eficaz knockdown do gene-em órgãos adultos do zebrafish. Aqui nós relatamos um protocolo para desempenho siRNA nanoparticle-mediada silenciamento no coração de adultos do zebrafish, proporcionando assim um novo método de perda-de-função para estudar órgãos adultos no zebrafish e outros organismos-modelo.
Abstract
Mamíferos têm uma capacidade muito limitada para regenerar o coração após infarto do miocárdio. Por outro lado, o zebrafish adulto regenera seu coração após a ressecção do ápice ou cryoinjury, tornando-se um organismo importante modelo para estudo de regeneração do coração. No entanto, a falta de métodos de perda-de-função para órgãos adultos restrito insights sobre os mecanismos subjacentes a regeneração do coração. Interferência do RNA através de diferentes sistemas de entrega é uma ferramenta poderosa para o silenciamento de genes em células de mamíferos e organismos modelo. Informamos anteriormente que nanopartículas de siRNA-encapsulado com êxito inserir células e resultam em uma notável derrubada de gene-específico no coração adulto zebrafish regeneradora. Aqui, apresentamos um protocolo simples, rápido e eficiente para a entrega de siRNA mediada por dendrímeros e silenciamento de genes no coração adulto zebrafish regeneradora. Este método fornece uma abordagem alternativa para determinar as funções do gene em órgãos adultos no zebrafish e pode ser estendido para outros organismos modelo também.
Introduction
Infarto do miocárdio tornou-se uma ameaça de saúde, levando a um enorme fardo econômico ao redor do mundo1. O coração dos mamíferos adulto falha regenerar e reabastecer o cardiomyocytes perdido na escala macroscópica após a lesão, levando à formação de cicatriz tecidos e subsequente insuficiência cardíaca. Ao contrário dos mamíferos, o peixe-zebra é capaz de regeneração do coração, principalmente através da proliferação robusta miocárdica após diferentes tipos de lesão do coração, tornando-se um organismo modelo ideal para investigar os mecanismos moleculares da regeneração do coração 2,3,4,5,6,7,8. Decifrando os mecanismos endógenos regeneração de coração de zebrafish subjacente é uma excitante área de pesquisa na busca de novas estratégias terapêuticas melhorar a regeneração de coração humano9.
Métodos de manipulação genética estão disponíveis no zebrafish. Estes consistem de morpholinos (MO) que são também amplamente utilizados em rãs, pintinho e mamíferos além no zebrafish10,11,12,13. MO tem eficiente nocaute da expressão do gene alvo no zebrafish Adulto barbatana, cérebro e retina14,15,16,17,18,19. Ácido nucleico bloqueado (LNA) é outro oligonucleotide artificial usada para derrubar a expressão do gene endógeno não apenas em embriões de peixe-zebra, mas também em órgãos de animais adultos20,21,22, 23 , 24. no entanto, a falta de métodos eficazes de perda-de-função para corações dos adultos continua a ser um obstáculo no estudo dos mecanismos moleculares de regeneração do órgão. No presentes, pequeno-molécula inibidores ou expressão transgênica dominante negativo mutantes são principalmente usados para bloquear a função de um determinado gene ou caminho para estudar a sua função no zebrafish adulto coração regeneração25,26 ,,27. No entanto, nem todos os genes e vias de sinalização são aplicáveis para esses métodos.
Interferindo de pequenos RNAs (siRNAs) são amplamente utilizados para a análise de perda-de-função de células de mamíferos e embriões de organismos-modelo, bem como órgãos adultos para estudos pré-clínicos em animais modelos28,29,30 , 31 , 32. siRNAs foram efetivamente usadas para silenciar genes em tumores33,34,35 e em cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 através de diferentes sistemas de entrega. Recentemente, desenvolvemos eficientes encapsulado siRNA nanoparticle-silenciamento de genes no coração adulto regeneradora usando vários diferentes nanopartículas41,42,43, fornecendo uma nova ferramenta para estudos funcionais de genes em órgãos adultos do zebrafish. Baseado em nossos anteriores estudos41,42,43, aqui apresentamos um protocolo simples, prático, e potente para siRNA silenciamento no coração adulto zebrafish regeneradora usando f-PAMAM-PEG-R9 dendrímeros. Aldh1a2 (aldeído desidrogenase 1, membro da família A2) gene foi upregulated após a ressecção do ápice de zebrafish e ablação de Aldh1a2 bloqueou a regeneração cardíaca44. Aqui tomamos aldh1a2 gene como um exemplo para testar a eficiência de gene "knockdown" mediada pela injeção de siRNA nanoparticle-encapsulado. Este protocolo contém um procedimento para ressecção de coração zebrafish, síntese química de nanopartículas e um método de entrega sobre nanopartículas siRNA-encapsulado no coração de adultos do zebrafish.
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Protocol
Todos os procedimentos de animal usado um zebrafish protocolo aprovado pelo Comitê de uso na Universidade de Pequim, que é totalmente credenciada pela Associação para avaliação e acreditação do cuidado de Animal de laboratório e institucional Cuidado Animal.
1. preparação da solução de tricaina
- Para preparar solução estoque tricaina, adicionar 400 mg etil 3-aminobenzoato Metanossulfonato de pó para 97,9 mL de água destilada e em seguida, adicionar 2,1 mL de 1 M Tris (pH 9,5) para ajustar o pH a 7 ~. Armazenar a solução a 4 ° C.
- Para preparar a solução de trabalho de tricaina, adicione 4,2 mL metanosulfonato de solução para 100 mL de água de sistema aquário.
2. adulto Zebrafish ressecção Ventricular
- Preparar os instrumentos e materiais para a cirurgia, que incluem um pedaço de esponja, uma placa de Petri preenchida com metanosulfonato trabalhando a solução, uma pipeta plástica, um estereomicroscópio, duas pinças afiadas, tesoura iridectomy, e cotovelo pinça (Figura 1).
- Prepare um sulco pequeno do tamanho de 4 cm x 0,5 cm e 0,5 cm de profundidade em uma esponja para segurar o zebrafish durante a cirurgia de ressecção ventricular.
- Encher um tanque de zebrafish 3L com meio tanque de água de sistema de zebrafish que é feita por meio do mar de 60 mg/L de sais na dH2O para a recuperação do peixe ferido.
- Anestesiar o peixe em um prato de Petri com solução de metanosulfonato de 10 cm até os movimentos de emalhar diminuem para um por segundo e mantém os peixes pelo menos 30 s para garantir que ele é totalmente anestesiado.
- Transfira o peixe anestesiado com a pinça de cotovelo ao sulco em um lado ventral de esponja úmida acima. Localizar visualmente a margem do coração batendo e em seguida, localize o coração sob um estereomicroscópio.
- Use a tesoura de iridectomy para fazer uma pequena incisão de cerca de 1 mm que penetra a pele e os músculos e rasgue com cuidado a camada epitelial prateada do saco pericárdico com as pontas da pinça para acessar o coração. Não coloque a pinça muito fundo na cavidade para evitar a lesão do coração.
Nota: neste ponto, tenha em mente para evitar hemorragia extensa. Exclui o peixe o experimento se extensa hemorragia ocorre, desde que o sangramento excessivo é causada principalmente pelo ferimento acidental com o coração e isso irá resultar em resultados de enganosa. - Expor o ventrículo, suavemente, mantendo seu ápice com Pinças afiadas usando a mão não-dominante ou aplicando pressão abdominal suave. Em seguida, com a outra mão, retire ~ 20% do ventrículo no vértice usando a tesoura de iridectomy.
Nota: Não há hemorragia extensa deve ocorrer neste ponto. - Use um guardanapo molhado para cobrir a incisão, como o sangramento de feridas profusamente para 15 – 45 s antes de coagulação e depois colocar o peixe de volta para o tanque com água do sistema.
Nota: Não é necessário suturar a incisão. - Certifique-se que o peixe recobra a Brânquia movimentos dentro de 1 min e recomeça a natação. Se o peixe não mostra gill movimentos após 50 na água, facilitar isso por esguichar água para as brânquias, utilizando uma pipeta plástica até que o peixe retoma a ventilação activa.
- Manter os peixes no sistema de reciclagem após a ressecção ventricular.
Nota: Sem cuidados especiais são necessários, em comparação com o peixe normal. A taxa de mortalidade de adultos do zebrafish ressecção ventricular é cerca de 5 a 10%. Quase todos a morte acontece dentro de 24 h após a cirurgia.
3. preparação de nanopartículas de siRNA-encapsulado
- Sintetizar o PAM-f4-PEG-R9 dendrímeros.
Nota: A síntese de PAM-f4-PEG-R9 dendrímeros materiais foi realizada conforme descrito anteriormente,37 , com algumas modificações. O comprimento de α, ω-dipiridil disulfido polietileno glicol (PEG-Py-Py) foram reduzidos a uma massa molecular de 1.000 para maximizar o encapsulamento de siRNAs (Figura 2B). - Secar 10mg do núcleo cystamine de G4.0 polyamidoamine (denominado PAMAM) usando secador de vácuo a 45 ° C por 1 h e então dissolver o PAMAM em fosfato salino de 2ml Dulbecco (DPBS, uma solução equilibrada de sal usada para uma variedade de aplicações de cultura de células).
- Dissolver a fosfina de 1,7 mg tris(2-carboxyethyl) (TCEP) em 1 mL DPBS, misture com a solução PAMAM preparada em 3.2 e deixar em temperatura ambiente com agitação suave para 8 h.
Nota: TCEP é dez vezes em relação molar em excesso para as ligações de bissulfeto do PAMAM. - Remova TCEP excessiva por ultrafiltração. Adicionar DPBS para a mistura de PAMAM-TCEP acima para alcançar o volume de 10 mL e a solução é transferida para um tubo de ultrafiltração 3 kDa MWCO (peso molecular cortado). Após a centrifugação a 3.000 g durante 15 min, descarte a solução no tubo de coleta. Adicionar DPBS para o dispositivo de filtro até 10 mL e suavemente pipeta a amostra várias vezes e centrifugar novamente. Repita esta etapa para 4 vezes. Após a última filtração, Aspire a amostra do dispositivo de filtro.
Nota: O produto desta etapa é reduzido PAMAM (denominado f-PAM4). - Dissolver 14 mg Py-Py-PEG em 1 mL DPBS, mistura com a solução de f-PAM4 e deixá-lo com agitação suave na temperatura ambiente por 3 h. Em seguida, retire o excesso Py-PEG-Py por etapa a ultrafiltração, conforme descrito no ponto 3.4. Após a última filtração, Aspire a amostra do dispositivo de filtro.
Nota: O produto é nomeado como f-PAM4-PEG-Py. A quantidade de Py-Py-PEG é 10 vezes na proporção molar para os grupos de thiol no f-PAM4. - Dissolver 6,4 mg de cisteína finalizado peptídeo R9 (Ac-CRRRRRRRRR-NH2) em 1 mL DPBS, misturar com f-PAM4-PEG-Py e mexa delicadamente por 8 h à temperatura ambiente. Purifica o produto final, chamado f-PAM4-PEG-R9, por etapa a ultrafiltração, conforme descrito no ponto 3.4, exceto que DPBS é alterado para água desionizada. Lyophilize o produto usando um secador de vácuo congelar.
Nota: Os produtos em 3.5 e 3.6 antes de liofilização são armazenados a-20 ℃ durante pelo menos 1 mês. Após a liofilização de f-PAM4-PEG-R9, as amostras são armazenadas a-20 ℃ durante pelo menos 2 meses. - Para determinar o grau de modificação de PEG e peptídeo, dissolver 5 mg da f-PAM4-PEG-Py no D2O (óxido de deutério) e transferi-lo para o tubo de amostra NMR (ressonância Nuclear magnética). Executar análise espectral de 1h-NMR de 400 MHz e analisar os dados usando NMR dados análise software37.
Nota: Especificamente, o representante PAMAM picos (- NCH2CH2CO-), PEG picos (- OCH2CH2-) e picos de resíduo de arginina (- HCCH2CH2CH2NH-) nos peptídeos são esperados para ser nos intervalos 2.4 – 2.6, 3.7 – 3.8 e 1.6-1.8 ppm, respectivamente. Determine o grau de modificação do PEG e R9 em relação a PAMAM calculando as integrais dos picos para os picos PAMAM PEG e R9. O grau de modificação de PEG é 100% e a modificação de R9 é pelo menos 50%. As análises espectrais 1H-NMR são executadas na instalação de núcleo da instituição. - Dissolver o PAM-f4-PEG-R9 dendrímeros retocar em PBS a 4 mg/mL e faça alíquotas da solução para uma única utilização.
Nota: A solução de dendrímeros pode ser armazenada a-20 ° C durante pelo menos um mês, sem repetidos congelamentos e descongelamentos. - Dissolva a cianina corantes-rotulado siRNAs (denominado siRNA-Cy5), Aldh1a2 siRNA ou mexidos controlo negativo siRNA em água destilada a 10 µM.
Nota: Use a cianina corantes-rotulado siRNAs para avaliar se o siRNA nanoparticle encapsulado pode entrar no coração de peixe (Figura 2A-B). Este protocolo utiliza aldh1a2 como um gene de exemplo para determinar a eficiência de entrega dos f-PAM4-PEG-R9 encapsulado dendrímeros siRNA. As sequências do siRNAs são: vertente antisentido Cy5-siRNA: 5 '-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3 ′, siAldh1a2 antisentido vertente: 5'-UUCAGGACAACCGUGUUCCdTdT-3' e controle negativo mexidos siRNA antisentido strand: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'. - Para preparar a solução de nanopartículas de siRNA-encapsulado, siRNA se misturam com um volume igual de solução de dendrímeros e incubar a amostra em temperatura ambiente por 20 min. na hora preparar a solução de siRNA nanoparticle antes do uso.
Nota: O volume da solução de nanopartículas de siRNA-encapsulado depende do número de peixes vai ser injetado. Por exemplo, preparar a solução de dendrímeros de pelo menos 120 µ l (mistura 60 µ l siRNA solução e solução de dendrímeros 60 µ l) para a injeção de 10 peixes (~ 10 µ l por peixe), contando com a perda da solução.
4. injeção de nanopartículas de siRNA-encapsulado no coração de Zebrafish adulto
- Conforme descrito acima, preparar um pedaço de esponja com um sulco, um prato de Petri de 10 cm preenchido com solução tricaina, uma pipeta plástica, um estereomicroscópio, pinças de cotovelo e uma seringa de insulina (Figura 1), bem como um tanque de peixes com sistema de água para habitação a os peixes após a injeção.
- Permitir o zebrafish ferido preparado em passos 2.1 – 2.10 recuperar para 1 dia após a ressecção ventricular e em seguida anestesiar o 1 peixe dpa (amputação de pós dias) tricaina solução conforme descrito em 2.4.
- Transfira o peixe anestesiado, lado ventral para cima, ao sulco na esponja úmida usando a pinça do cotovelo. Localize o coração sob o microscópio.
- Carrega 10 µ l da solução de nanopartículas de siRNA-encapsulados para a seringa de insulina. Evite o máximo possível de bolhas.
- Imobilize o peixe suavemente usando a pinça do cotovelo para manter a região torácica com a mão não dominante. Não fixe os peixes demasiado firmemente.
Nota: Tenha em mente que nenhuma hemorragia extensa deve ocorrer durante a injeção. - Segurar a seringa de insulina enchido ~ 30 ° e injetar ~ 10 µ l da solução na cavidade torácica, usando a outra mão (Supplemental Figura 1).
Nota: A solução às vezes flui para fora durante a injeção, mas isso não afeta o efeito de siRNA. A solução de siRNA-nanopartículas pode ser injetada uma vez por dia durante vários dias a um mês, dependendo de um plano específico e experimental. Injete um peixe com um tipo de siRNA cada vez. Se precisam de mais de dois tipos de siRNA ser injetado em um peixe, injetar um tipo de siRNA cada vez e em seguida, injetar um outro tipo de siRNA 1h mais tarde. Neste protocolo, foi injetado apenas um tipo de siRNA por peixe. - Transfira o peixe para o tanque com a água do sistema.
Nota: Os peixes são esperados para reiniciar a ventilação dentro de 1 min e depois retomar a natação. A injeção de nanopartículas de siRNA-encapsulado ou siRNA normalmente não causa morte em adultos do zebrafish.
5. coleta, fixação e avaliação da eficiência de siRNA entrega o coração
- Prepare-se 1 mL de solução de paraformaldeído 4% em um tubo de microcentrifugadora para cada grupo.
- Anestesia o peixe tricaina solução selecionada dias após as injeções. Coloque o peixe na ranhura passivamente em uma esponja úmida. Fazer uma grande incisão na região torácica e abrir-se amplamente com a pinça. Aperto do trato de saída e puxe para fora o coração inteiro cuidadosamente com a pinça.
- Enxágue o coração com PBS e rapidamente remover líquido extra com um guardanapo. Coloque até 10 corações em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL com paraformaldeído 1ml. Suavemente inverta o tubo várias vezes e manter-se durante a noite a 4 ° C.
- Medir a intensidade de fluorescência de corações Cy5-siRNAs-injetado usando o na vivo de imagem de sistema (Supplemental Figura 2). Use 3 – 4 corações de zebrafish para cada grupo neste estudo.
- Monte os corações fixos com parafina ou composto OCT (incorporação média para amostras de tecido congelado garantir a temperatura ideal de corte).
6. avaliação de siRNA Nanoparticle-mediada, silenciamento de genes
- Prepare um recipiente isolado e uma pinça longa. Despeje em nitrogênio líquido a um terço do volume do recipiente.
- Anestesia o peixe tricaina solução no dpa 2. Dissecar os corações conforme descrito em 5.2 e remova o trato de saída e o átrio.
Nota: O peixe pode recuperar da cirurgia em um dia e então injetado em 1 dpa com qualquer mexidas siRNA-encapsulado nanopartículas (siNC) como um negativo controle ou aldh1a2 siRNA-encapsulado nanopartículas (siAldh1a2). - Transferir os ventrículos em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga usando uma pinça, cobrir a tampa do tubo e imediatamente colocar o tubo no recipiente isolado com nitrogênio líquido. Deixe o flutuador de tubos sobre o nitrogênio líquido para alguns min. Use a pinça longa para retirar os tubos do recipiente.
- Repita as etapas de 6.2 e 6.3, até que todos os ventrículos são coletados. Use corações de 6 a 10 para cada grupo.
- Extraia o RNA total de corações com reagente de isolamento de RNA. Avaliar os níveis de expressão dos respectivos genes por RT-PCR quantitativo utilizando primers Gapdh f: GATACACGGAGCACCAGGTT; GAPDH r: GCCATCAGGTCACATACACG; Aldh1a2 f: TGAGCGAGGAGCAGCAGAGA; Aldh1a2 r: TCCACGAAGAAGCCTTTAGTAGCA.
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Representative Results
Para determinar a eficiência da entrega mediada por dendrímeros siRNA, ressecados do ápice do ventrículo do coração zebrafish, então injetado cerca de 10 µ l de dendrímeros só (grupo simulado), Cy5-siRNA só (grupo nu) ou f-PAMAM-PEG-R9 dendrímeros encapsulado Cy5-siRNA (grupo de siRNA-Cy5) intrapleurally, respectivamente (Figura 2A-B). O sinal de fluorescência foi detectável nos corações injetados com encapsulado dendrímeros Cy5-siRNA em 3, 24 e 48 hpi (injeção de pós de horas), enquanto era dificilmente detectável nos corações dos grupos fictícios e nua no hpi 48 (Figura 2C-D), sugerindo que o f-PAMAM-PEG-R9 dendrímeros efetivamente facilita a entrega de siRNAs em coração adulto zebrafish e são estável pelo menos dois dias.
Para investigar o efeito de siRNA dendrímeros encapsulado no silenciamento, escolhemos a aldh1a2 (enzima de síntese de ácido retinoico) como um gene alvo, o que foi relatado para ser necessária para a regeneração do coração após ressecção ventricular44 . Como mostrado na Figura 3, os peixes eram permitiu recuperar para um dia após a ressecção ventricular e então injetados com siRNA dendrímeros encapsulado. Nós achamos que o nível de expressão de RNAm de aldh1a2 diminuiu nos corações tratados com f-PAMAM-PEG-R9 dendrímeros encapsulado siAldh1a2 comparado com o de dendrímeros encapsulado mexido siRNA (siNC) no dpa 2 (Figura 3B), demonstrando que o f-PAMAM-PEG-R9 mediada por dendrímeros siRNAs alcançar silenciamento do gene-específico no coração de adultos do zebrafish.
Figura 1 : Cirurgia cardíaca e torácica injeção instrumentos. Foto dos instrumentos utilizados para ressecção ventricular no coração zebrafish adulto: esponja com uma ranhura, cotovelo pinças, Pinças afiadas, tesoura iridectomy, pinças longas e a seringa de insulina usada para entrega de siRNA dendrímeros encapsulado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : F-PAMAM-PEG-R9 dendrímeros assistida prestação efectiva de siRNA em zebrafish adulto ferido coração. (A) esquema para investigar a eficiência de absorção de Cy5-siRNA nanoparticle-encapsulado no coração de adultos do zebrafish após ressecção ventricular (dpa: pós-amputação dias; hpi: pós-injeção de horas). (B) síntese de dendrímeros PAMAM-R9-PEG-f e preparação de dendrímeros encapsulado Cy5-siRNA. (C) imagem de fluorescência Cy5 dos corações injetadas com apenas dendrímeros (simulação), Cy5-siRNA apenas sem encapsulamento dendrímeros (nu) e encapsulado dendrímeros fluorescência rotulado Cy5-siRNA (siRNA-Cy5) detectado pela imagem latente em vivo sistema, mostrando que os sinais de fluorescência foram quase indetectáveis nos grupos fictícios e nuas no hpi 48, enquanto sinais fortes mantidas a grupos de Cy5-siRNA dendrímeros encapsulado de 3 para 48 hpi. A escala arbitrária de sinais de fluorescência mostra do fraco (azul) para forte (vermelho). (D) quantificação de fluorescência Cy5-siRNA sinaliza em corações avaliadas pelo na vivo de imagem de sistema como em painel C (* P < 0.05, * * * P < 0,001; dados são média ± no MEV mostrou; análise de variância One-Way seguido por Bonferroni de comparação múltipla testes; n = 3-4 corações). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Silenciamento de siRNA eficiente de aldh1a2 no zebrafish adulto ferido coração. (A) esquema para investigar o efeito de silenciamento de genes de aldh1a2 siRNA. (B) qPCR revela que aldh1a2 mRNA diminuiu em corações de nanopartículas encapsulado siAldh1a2 comparadas com nanopartículas-encapsulado mexidos siRNA corações (siNC). O nível de expressão de RNAm de aldh1a2 foi normalizado pelo GAPDH (* * * P < 0,001; dados são significar ± no MEV mostrou com emparelhado o teste t de Student). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1: imagens de injeção de cavidade torácica. (A), a cavidade torácica no peixe adulto no post do dia 1 amputação. (B) injeção de siRNA nanoparticle-encapsulado dentro da cavidade torácica. Escala de bares: 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 2: eficiência de absorção de Cy5-siRNA nanoparticle-encapsulado no zebrafish adulto ferido coração. (A) imagem de fluorescência Cy5 dos corações injetadas com dendrímeros apenas (simulação), Cy5-siRNA nua sem encapsulamento dendrímeros (nu) e encapsulado dendrímeros Cy5-siRNA sob o no vivo sistema de imagem. A escala arbitrária de sinais de fluorescência é fraco (azul) a forte (vermelho). (B) quantificação de fluorescência Cy5-siRNA sinaliza em corações medidas pelo na vivo de imagem de sistema como em painel A (NC: não significativa diferente; dados são média ± no MEV mostrou; análise de variância One-Way seguido o Bonferroni é múltiplo teste de comparação; n = 3-4 corações). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O peixe-zebra é plenamente capaz de regenerar uma variedade de órgãos, incluindo o coração adulto5. Enquanto métodos genéticos e transgênicos são bem desenvolvidos para estudar funções de genes em embriões de peixe-zebra, os investigadores ainda são confrontados com a difícil tarefa de geração de alelos mutantes condicionais no zebrafish45,46. Assim, a transgênicos dominante negativo mutantes ou inibidores da pequeno-molécula são frequentemente usados para funções de gene endereço no zebrafish adulto órgãos25,,27,42. Ao longo dos últimos anos, temos desenvolvido um método alternativo para a análise de perda de função de genes no coração adulto zebrafish usando siRNA nanoparticle-mediada entrega e41,42, de silenciamento do gene 43. aqui, um protocolo detalhado para este método usando siRNA mediada por dendrímeros silenciamento no zebrafish corações em particular e, possivelmente, em outros órgãos de zebrafish, em geral, é apresentado.
A molécula de siRNA não pode entrar dentro das células, por si só, devido à sua carga negativa e poderia ser facilmente degradada pela nuclease. Com mono-dispersar moléculas, estruturas ajustáveis e propriedades, dendrímeros têm sido considerados como promissor siRNA transportadoras 47. Os dendrímeros PAMAM tem ricas periferias catiônicas e aminas buffer dentro do qual poderiam mediar o encapsulamento de siRNA em condições fisiológicas e induzir um efeito "esponja de próton" para liberar siRNA de endossomos no citoplasma respectivamente48 , 49 , 50. neste artigo, o PAMAM foi modificado para melhorar a eficiência de estabilidade e de entrega. O sistema f-PAMAM-PEG-R9 fornece uma cabeça de dendrímeros PAMAM hemisférica com a carga positiva para o encapsulamento de siRNA impedir a degradação da nuclease. O braço de PEG e o peptídeo transmembrana R9 foi usado para melhorar a Hidrofilia das nanopartículas para estabilização e promover a absorção pelas células, respectivamente.
A qualidade e o tipo de nanopartículas são críticos para a entrega de siRNA eficaz e silenciamento de genes no coração do zebrafish. Temos investigado com sucesso três nanopartículas estruturalmente diversa para essa finalidade: PEG-PLA, nanopartículas f-PAMAM-PEG-R9 e PEI-HYD-RGD41,42,43. Embora eles não são produzidos comercialmente, um laboratório de química de orgânica regular pode facilmente sintetizar e purificar nanopartículas conforme descrito anteriormente,35,37,43. Aqui, nós escolhemos os dendrímeros PAMAM-R9-PEG-f como um exemplo para mostrar a entrega simples, eficiente, mediada por dendrímeros siRNA e silenciamento de genes no coração adulto zebrafish após ressecção ventricular, porque é relativamente fácil de preparar siRNA-carregado dendrímeros-complexos, tais como incubando a mistura à temperatura ambiente por 20 min. Por outro lado, o pH deve ser ajustado para siRNA-carregado nanocomplexes se PEI-HYD-RGD é usado43. Da mesma forma, procedimentos de emulsão e purificação são essenciais para obter solução uniforme siRNA nanoparticle-encapsulado se PEG-PLA nanopartículas são usados35,41.
Outro passo crítico é minimizar ou não ter nenhum sangramento durante a injeção de siRNA dendrímeros encapsulado conforme descrito em 4.5 desde hemorragia extensa interrompe a regeneração do coração e outros sistemas biológicos. Assim, sugerimos que excluindo peixes de grupos experimentais, se o sangramento ocorre durante a injeção. Em geral, este procedimento de injeção simples é facilmente dominado depois de alguns testes.
As principais limitações desse método são a tecnologia siRNA em si, como potenciais efeitos fora do alvo e supressão incompleta de genes de interesse. Caso contrário, a replicação biológica altamente reprodutível de silenciamento de genes de vários genes tem sido demonstrada em nosso trabalho e a dos outros41. Importante, este protocolo é rápido, simples e eficiente, e o tratamento de injeção é bem tolerado por adultos do zebrafish. Análise experimental de siRNA-silenciamento eficiência pode incluir a avaliação dos níveis de expressão de RNAm por hibridação in situ ou RT-PCR quantitativo, ou dos níveis de expressão de proteínas usando borrões ocidentais, coloração, imuno-histoquímica ou outras análises funcionais. Juntos, apoiamos inteiramente siRNA nanoparticle-facilitado entrega como uma ferramenta alternativa para estudos de perda--função no coração zebrafish adulto em particular e esta abordagem também pode ser estendida para outros órgãos no zebrafish adulto e outros organismos-modelo.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer Dr. IC Bruce comentários críticos e ler o manuscrito. Este trabalho foi financiado por doações da Nacional Natural Science Foundation da China (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 e 31521062), AstraZeneca, Ásia e emergente mercado inovador medicina e desenvolvimento precoce.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4 °C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
References
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