Summary
Qui, descriviamo un protocollo per la caratterizzazione biochimica dell'enzima modificante la RNA lievito, Mod5 e discutere come questo protocollo potrebbe essere applicato ad altri enzimi modificanti la RNA.
Abstract
N6- isopentenyladenosine RNA modifiche sono funzionalmente diversi e altamente conservata tra procarioti ed eucarioti. Una delle più altamente conservato N6- isopentenyladenosine modifiche si verifica la posizione A37 in un sottoinsieme di tRNA. Questa modifica migliora l'efficienza della traduzione e fedeltà aumentando l'affinità del tRNA per il ribosoma. Mutazione di enzimi responsabili di questa modifica negli eucarioti sono associate a diversi Stati di malattia, compreso cancro e la disfunzione mitocondriale. Pertanto, comprendere la specificità di substrato e attività biochimiche di questi enzimi è importante per la comprensione della biologia eucariotica normale e patologica. Una vasta gamma di metodi è stata impiegata per caratterizzare i6A modificazioni. Qui è descritto un approccio diretto per la rilevazione di isopentenylation di Mod5. Questo metodo utilizza l'incubazione di RNA con una transferasi di isopentenyl ricombinante, seguita da digestione RNasi T1 e analisi di elettroforesi del gel 1-dimensionale per individuare i6A modifiche. Inoltre, il potenziale adattabilità di questo protocollo per la caratterizzazione di altri enzimi modificanti la RNA è discussa.
Introduction
Modifiche RNA almeno 163 posttranscriptional distinte sono state identificate, con queste modifiche che conferisce funzioni diverse e dipendente dal contesto di RNAs, direttamente che influenzano la struttura di RNA e che interessano interazioni di RNA con altri molecole1,2. L'apprezzamento per il numero e la varietà di RNA modifiche aumenta, è fondamentale per sviluppare le analisi che possono interrogare in modo affidabile sia le modifiche di RNA e gli enzimi che catalizzano loro.
Si verifica una delle prime modifiche di RNA di essere identificato a base 37 in tRNAs, adiacente al anti-codone3,di lato per 3'4. Un gruppo di isopentenyl viene trasferito da dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) nella posizione di N6 di adenosina 37 (ho6A37) 3,5 su un sottoinsieme di tRNAs sia citoplasmiche e mitocondriali. Ho6A37 migliora la fedeltà di traduzione ed efficienza aumentando affinità di tRNA per il ribosoma4,6 e ho6A37 è importante per la risposta allo stress in batteri7. Gli enzimi che eseguire questa modifica sono definiti transferasi isopentenyl tRNA e sono altamente conservati in batteri8,9, funghi10, vermi11, piante12e più alti eucarioti13 , compreso gli esseri umani14.
Mutazioni nel gene umano di tRNA isopentenyl transferasi, TRIT1, sono associate con la malattia umana. Ad esempio, una mutazione in TRIT1 è correlata con una grave malattia mitocondriale, probabilmente causata da un difetto nella sintesi proteica mitocondriale15,16. Inoltre, TRIT1 è stato descritto come un tumore soppressore gene17,18 ed è implicata in parecchi tipi di cancri, compreso il melanoma19, seno20, gastrico21e cancri polmonari22 ,23. Infine, TRIT1 e Mod5 transferasi isopentenyl (Saccharomyces cerevisiae) sono soggette a aggregazione proteine che formano il prione-come le fibre amiloidi24,25,26. Queste osservazioni implicano potenzialmente transferasi di isopentenyl tRNA nelle malattie neurodegenerative, anche se la prova diretta per questa non è ancora stata dimostrata.
Dato il ruolo che isopentenyl transferasi giocare nella traduzione e nella malattia, metodi che misurano direttamente i6un'attività della transferasi di isopentenyl sono importanti per una comprensione meccanicistica di questi enzimi normali e Stati di malattia. Un crescente numero di metodi è disponibile per individuare i modifiche di RNA A6, compreso in vitro isopentenylation saggi, l'ibridazione positiva in assenza di i6saggi un (PHA6), cromatografia su strato (TLC), aminoacido di sottile analisi di attività di accettazione e approcci di spettrometria di massa (rivisto in rif. 4).
Un'analisi di isopentenylation in vitro è stato descritto che utilizza 14C-DMAPP e tRNAs senza etichetta. In questo saggio, carbonio radioattivo viene trasferito al RNA dal 14C-DMAPP mediante la transferasi di isopentenyl. Mentre questo test è altamente sensibile, è spesso difficile determinare il residuo specifico che è modificato9,20,27. Saggi PHA6 contare su una pesante modifica6A interferire con l'ibridazione di una 32P-labeled sonda che abbracciano il residuo modificato. Come tale, l'ibridazione è maggiore in assenza di una i6una modificazione18,28,29. PHA6 le analisi sono altamente sensibili e in grado di analizzare il RNA totale Estratto da lisati cellulari. Inoltre, la capacità di progettare le sonde specifiche per il RNA di interesse dà tutto questo metodo obiettivo sostanziale. Tuttavia, PHA6 saggi sono limitati alla caratterizzazione delle modificazioni che si verificano sui residui all'interno della regione di destinazione della sonda e pertanto sono meno propensi a identificare nuovi modifica siti. Inoltre, come assenza di associazione è indicativo di modificazione, altre modifiche o mutazioni che influenzano il legame al RNA saranno confondere l'analisi dei dati.
Un altro approccio combina cromatografia di cellulosa di benzile DEAE cellulosa (BD) con attività di accettazione dell'aminoacido come una lettura di i6A modifiche nel tRNA30. Questo approccio di analisi direttamente la funzione di i6A modifiche, ma è un approccio indiretto per individuare i6A modificazione e manca di risoluzione per mappare le modifiche ad un residuo specifico nel RNA. Un approccio di TLC è stato utilizzato per rilevare il tRNA totale ho6A modifiche. In questo approccio, internamente 32P-labeled tRNAs sono digeriti a singoli nucleotidi e analisi TLC bidimensionale viene utilizzato per identificare isopentenylation. Questo approccio è altamente sensibile nella rilevazione totale ho6A in un dato campione di RNA ma sulla digestione, tutte le informazioni di sequenza sono perse; così, l'investigatore non ha modo di determinare quali residui sono stati modificati31.
Più recentemente, sono stati sviluppati metodi liquido cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS) che confronta quantitativamente le modifiche di RNA totale tra specie, tipi di cellule e condizioni sperimentali32,33, 34. Una limitazione di questa metodologia è che è meno in grado di determinare l'identità e la posizione all'interno di RNA da cui i nucleosidi modificati è stato derivato34. Inoltre, le competenze e le attrezzature necessarie per eseguire questi esperimenti limitare la praticità di questo approccio.
Inoltre, diverse tecnologie di sequenziamento di nuova generazione sono stati sviluppati per mappare RNA modifiche transcriptome livello34. Immunoprecipitazione di RNA con anticorpi specifici per una particolare modifica (RIP-Seq) permettono al ricercatore di identificare tutte le sequenze che contengono una modifica specifica35,36. Inoltre, gli approcci basati su trascrittasi inversa come sequenza di mancata corrispondenza non casuale e Chem-Seq si basano su perturbazioni della reazione di trascrizione inversa al residui modificate37,38,39. Nonostante il vantaggio di queste tecniche per mappare tutto il RNA modifiche del trascrittoma, RIP-seq e Chem-Seq tecnologie sono limitati dalla mancanza di anticorpi affidabili o sostanze chimiche reattive disponibili per ogni modifica specifica, rispettivamente34. Inoltre, gli enzimi trascrittasi inversa necessari per eseguire Chem-Seq e tecniche di sequenziamento di mancata corrispondenza non casuale possono essere ostacolate da strutture stabili di RNA. La natura altamente modificata e strutturalmente stabile di tRNAs li rendono particolarmente difficile interrogare usando queste tecniche. Ad oggi, tecnologie basate su sequenziamento di nuova generazione ancora non sono state utilizzate per mappare i6un modifiche34.
Qui, descriviamo un approccio semplice e diretto per individuare i6A tRNA modifiche in vitro. Questo metodo utilizza l'incubazione di RNA con ricombinante S. cerevisiae isopentenyl transferasi (Mod5), seguita da digestione RNasi T1 e analisi di elettroforesi del gel 1-dimensionale per mappare i6A modifiche. Questo approccio è diretto e richiede competenze poco specializzata per analizzare i dati. Inoltre, questo metodo è adattabile ad altri RNA modificando gli enzimi, compreso gli enzimi che modificano covalentemente il peso molecolare di RNA o di mobilità di un RNA attraverso un gel.
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Protocol
Nota: Il protocollo è stato adattato da rif. 24.
1. ottenere RNA e degli enzimi di interesse
- Uso in vitro trascritti RNAs internamente etichettati con 32P e His6-Mod5 ricombinante espressa in e purificato da e. coli, come descritto in precedenza24.
- Introdurre in vitro trascritto RNAs (sezione 3) usando T7 RNA polimerasi in presenza di ATP senza etichetta, UTP, CTP, GTP e 10 µ ci di gel-purificato, etanolo-precipitata α-ATP, risospesi in 1 x TE (10 mM Tris-HCl a pH 7.5, 0.1 mM EDTA) e conservati a-80 ° C 24.
- In alternativa, ottenere commercialmente disponibile fluorescente contrassegnati RNA di interesse. Produrre gli enzimi di interesse in qualsiasi sistema di espressione preferito.
Attenzione: Variabili interne fluorescente nel RNA possono alterare la struttura RNA e riconoscimento dagli enzimi.
2. preparare un 20% poliacrilammide denaturante Gel
Nota: Al fine di ottenere una risoluzione sufficiente di frammenti di RNA, è consigliato un gel di lastra verticale di lunghezza 40 cm. La larghezza del gel utilizzato è determinata dal numero di campioni da analizzare.
- Pulire accuratamente le lastre di vetro. In primo luogo, lavare con acqua e sapone, sciacquare bene con acqua deionizzata e infine pulire con isopropanolo e salviette privo di lanugine.
- Montare le piastre e i distanziali.
- Mescolare i seguenti reagenti per rendere 100 mL di 20% di acrilammide, 7,5 M urea, 1 x TBE gel: 80 mL di urea gel concentrato (237,5 g/L di acrilammide, 12,5 g/L di metilene bisacrylamide, 7,5 M urea in acqua deionizzata), 10 mL di diluente gel urea (7.5 m urea in acqua deionizzata) e 10 mL di buffer di urea gel (0,89 M Tris-borato-20 mM EDTA tampone pH 8.3 e 7,5 M di urea).
Nota: Il volume di soluzione di gel deve essere regolato secondo le dimensioni del gel. - Aggiungere 40 µ l di N, N, N′, N′-Tetrametiletilendiammina (TEMED) e 800 µ l di preparati 10% ammonio persolfato (APS).
- Aspirare la soluzione di gel in una grossa siringa ed erogare tra lastre di vetro. Toccare il vetro con le dita mentre versando per evitare la formazione di bolle.
- Consentire il gel per solidificare per 30 min.
- Morsetto solidificata gel sul gel verticale apparato utilizzando clip legante.
- Riempire il buffer superiore e inferiore camere con 1 x TBE.
- Due ore prima di caricare il gel, pre-corsa il gel a 20 mA, per 2 h consentire il limite di buffer correre più veloce i oligonucleotides più piccoli - in caso contrario il più piccolo nucleotidi e oligonucleotidi tendono a comprimere nella parte anteriore del tampone.
3. RNA Isopentenylation Assay
- Preparare le reazioni in un volume finale di 17 µ l, contenente 58 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1,2 mM ATP, 5,8 mM MgCl2, 0,2 mM DMAPP, inibitore di U di RNAsi 10 (ad esempio, SuperRNaseIn), 40.000 CPM internamente 32P-identificato RNA, 5,3 µM Mod5 e 1,2 mM 2 - mercaptoetanolo.
- Incubare le reazioni a 37 ° C per 1 h.
- Etanolo-precipitato RNAs utilizzando 2.5 volumi (42,5 µ l) di etanolo al 100% e 1/10 volumi (1,7 µ l) di 3,5 M sodio acetato pH 5.5 e posto a-20 ° C per 1 h o durante la notte.
- Centrifugare i campioni di RNA per 20 min a 15.400 x g e a 4 ° C.
- Con attenzione rimuovere il surnatante e lavare la pallina del RNA con 500 µ l di etanolo al 70%.
- Centrifugare i campioni a per 5 min 15.400 x g e a 4° C.
- Rimuovere con cautela il pellet di RNA surnatante e asciugare all'aria per 15 minuti, o fino a quando tutti i etanolo evaporato.
- Risospendere il pellet di RNA in 10 µ l di urea 8 M.
- Aggiungere 150 U di RNAsi T1 e incubare a 37 ° C durante la notte.
- Aggiungere 2 µ l di 6x loading buffer (60% glicerolo, 0.1% xilene cianolo).
- Caricare 10 µ l di ciascun campione di RNA su un pre-esecuzione, poliacrilammide del 20%, gel di 7.5 M urea (vedere la sezione 2 del protocollo).
Nota: RNA radioattivo dimensioni scale possono essere incluse come un marcatore di mobilità supplementari. - Esegua il gel per 2 h a 25 mA.
- Arrestino il gel e rimuovere dall'apparecchio.
- Pausa di tenuta tra le due lastre e rimuovere una delle lastre di vetro, con il gel rimanente sulla piastra "inferiore".
Nota: fare attenzione per non strappare il gel durante questo passaggio. - Mettere uno strato di pellicola trasparente sopra il gel ed esporre su uno schermo al fosforo per 3 h. in alternativa, mettere gel su carta cromatografia ed asciugare con un gel asciuga prima dell'esposizione dello schermo al fosforo.
- Immagine a schermo al fosforo su un imager di fosforo.
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Representative Results
Mod5 è stato incubato con una tirosina tRNA o serina tRNA in presenza o assenza di DMAPP. A seguito della reazione di modificazione, i prodotti erano RNasi T1-digerito, che cliva l'estremità 3' del guanosine tutti lasciando un 3' guanosina monofosfati (GMP)24 (Figura 1). Completa digestione degli RNA produce un modello prevedibile di frammenti radioattivi (Figura 2A), che poi vengono risolti su un 20% poliacrilammide denaturante gel. Il trasferimento di un gruppo di isopentenyl dal DMAPP al RNA provoca uno spostamento di mobilità del frammento contenente il residuo modificato (Figura 1).
Questo protocollo rileva attendibilmente isopentenylation dei residui di tRNA sia canoniche e non canoniche modificati da Mod524. Ad esempio, Mod5 è preveduta per modificare un sottoinsieme di tRNA, che contengono il precedentemente descritti AAA36-38 sequenza requisito10, tra cui la tirosina tRNA e serina tRNA utilizzato in questo studio. Mod5 modifica il predetto residuo in presenza di DMAPP come è indicato dalla spostato 10 nt AAA36-38 contenente frammento nella tirosina tRNA (Figura 2B). Allo stesso modo, quando la serina tRNA viene incubato con Mod5 e DMAPP, un cambiamento completo del 10 nt AAA36-38 contenente il frammento è osservato (Figura 2C). Interessante, uno spostamento parziale di un frammento di nt 7 è osservato che non contengono la AAA36-38 (Figura 2C). Questi dati suggeriscono che la sequenza di36-38 di AAA e la struttura non sono necessari per Mod5 in vitro attività; Tuttavia, sono necessari studi futuri mediante LC-MS/MS o altri metodi per confermare l'esatta natura chimica della modifica.
Figura 1 : Illustrazione di analisi della transferasi di isopentenyl. tRNA, internamente etichettati con 32P-adeonsine, è mostrato incubate con S. cerevisiae tRNA isopentenyl transferasi (Mod5) e ATP con o senza DMAPP. Posizioni A36-A38 sono indicate adiacente alla regione anticodone. Asterischi rossi rappresentano radiomarcati nucleotidi. A seguito di incubazione, RNAs sono digeriti con RNAsi T1, estratte e risolto da denaturare-PAGE 20%. Il trasferimento di un gruppo di isopentenyl dal DMAPP per il tRNA è indicato da una banda di ritardati durante l'elettroforesi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : La RNasi T1 digestione mappa e rappresentante risultati di un'analisi della transferasi di isopentenyl. (A) neri triangoli rappresentano siti di fenditura di RNAsi T1 e linee nere sopra i triangoli rappresentano frammenti risultanti che contengono almeno un 32P-labeled adenosina. Grigi evidenziati residui sono ho predetto6A siti di modificazione (cioè, A37). (B) serina (C) e tirosina tRNA tRNA internamente sono stati etichettati con 32P-adenosina. Lo S. cerevisiae isopentenyl transferasi, Mod5, è stata incubata con ogni RNA in presenza o assenza di DMAPP. Il RNAs era poi digerito con RNAsi T1 e risolto nella pagina denaturazione. Spostato bande dipende dal DMAPP indicano la presenza di un residuo di RNA modificata. Il sito di modifica prevista, A37, è sottolineato e modificate A37 residui sono indicati con un asterisco. Un sito di modifiche impreviste e romanzo è identificato e indicato come "ho6A?". Questa figura è stata modificata da lettura et al. 24 con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Modifiche di RNA continuano ad essere mostrato ai giocano un ruolo sempre più importante e diversificata in funzione cellulare e organismica. Come tale, lo sviluppo di saggi per interrogare RNA modificando gli enzimi è fondamentale per comprendere meglio gli aspetti fondamentali della biologia. Questo protocollo descrive un'analisi ad alta risoluzione in vitro per caratterizzare l'attività di modifica di tRNA di Mod5.
Questo protocollo ha il vantaggio di fornire una lettura diretta e facilmente interpretabile di isopentenylation. Il protocollo descritto consente robusta caratterizzazione biochimica di isopentenyl transferasi. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato con varianti di enzima o modificati substrati di RNA, consentendo per la determinazione diretta dei ruoli che dispongono di specifici residui o domini sulla modificazione. Per ottenere anche una maggiore risoluzione, questo protocollo prontamente potrebbe essere adattato per includere le digestioni parallele con altre RNasi, quali RNasi P1 e/o RNasi A, che unirà tutti i quattro nucleotidi o al C e U, rispettivamente.
Una limitazione di questo test è che è relativamente basso-velocità di trasmissione e così meno RNA che può essere analizzato praticamente rispetto al sequenziamento di RNA e spettrometria di massa si avvicina a34. Pertanto, non è consigliabile che questo protocollo essere usato per coloro che mirano a identificare tutto il RNA modifica siti transcriptome. Questo protocollo è più utile agli investigatori che sono interessati ad esaminare un RNA specifico modificando enzima con particolare RNA di interesse. Tuttavia, molte metodologie di vasta transcriptome utilizzate per identificare le modifiche RNA richiedono aggiunta covalente di una molecola chimica ad un nucleotide modificato. Questo metodo fornisce un'analisi economico ed efficiente, dove uno potrebbe testare protocolli di modifica su un substrato individuo per ottimizzare la modificazione chimica prima di impegnarsi in un sforzo di tutto il trascrittoma40. Anche se questo protocollo fornisce un'analisi semplice e diretta per rilevare attività della transferasi di isopentenyl, come è descritto qui, solo la percentuale per volta del frammento di RNA totale può essere calcolata e confrontata tra gruppi. I ricercatori interessati a comparazione quantitativa enzima attività devono prima calcolare le unità di attività per la concentrazione dell'enzima.
Successo di questo metodo si basa pesantemente su alcuni passaggi critici. È importante che l'integrità del RNA di interesse è confermato prima del isopentenylation. Degradazione del campione di RNA prima l'analisi della transferasi di isopentenyl potrebbe avere un effetto significativo sulla modifica del RNA e confondere l'interpretazione dei dati. Inoltre, tale degrado è difficile da rilevare dopo la digestione di RNAsi T1 ha avuto luogo. Pertanto, si raccomanda che l'integrità del RNA è controllato denaturando pagina. Inoltre, per completamente e accuratamente caratterizzare il grado di modificazione di RNA, è indispensabile per garantire la digestione di RNAsi T1 ha proceduto a completamento. RNasi ulteriori, quali la RNasi P1 e/o RNasi A, possono essere utilizzato da digerire RNAs in parallelo con RNAsi T1 per aumentare la risoluzione di questo test. Oligonucleotide radioattivo scale di lunghezza nota e sequenza e campioni di RNA non digeriti possono essere utilizzate per valutare la digestione. Infine, per alcuni enzimi, la specificità della modifica dipende il RNA è allo stato "correttamente" piegato. Mentre la maggior parte tRNAs sintetizzato in vitro piega in strutture che assomiglia loro struttura in vivo , questo è meno certo per altre classi di RNA, specialmente con più RNAs41.
Anche se il protocollo descritto è specifico di Mod5 isopentenylation di tRNA, questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per la caratterizzazione di altri enzimi modificanti la RNA che covalentemente aggiungere una molecola chimica che altera significativamente il peso molecolare o gel di mobilità dei il RNA.
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Disclosures
Nessuno di divulgare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dr. David Engelke per sua guida e utili commenti su questo manoscritto. PJS - fondi di avvio laboratorio Ball State University; DAB - concedere 1R15AI130950-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
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